豬源IKKγ在原核和真核表達系統(tǒng)中的表達及其多克隆抗體制備

趙祥秀　黃茂發(fā)　高躍美　唐榕澤　胡仁俊　梁晶晶　李曉寧　羅廷榮

摘要：【目的】制備豬源IKKγ多克隆抗體，為進一步研究IKKγ蛋白生物學特性及揭示IKKγ蛋白與豬瘟病毒（CSFV）間相互作用機制打下基礎。【方法】利用RT-PCR從豬腎細胞（PK-15）中克隆原核表達的IKKγ基因功能片段（561 bp），與原核表達載體pET-32a（+）構建原核重組質粒pET-IKKγ，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后進行IPTG誘導表達，表達的融合蛋白經(jīng)純化和濃縮后，免疫小鼠制備豬源IKKγ多克隆抗體。同時克隆IKKγ基因全長序列（1356 bp），與真核表達載體pCMV-HA構建真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ，分別轉染293T細胞和PK-15細胞，檢測融合蛋白表達情況?！窘Y果】以原核重組質粒pET-IKKγ轉化BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導能表達出約40 kD的融合蛋白，且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式進行表達，可通過Ni-NTA親和層析柱進行純化，已獲得較高純度的融合蛋白IKKγ。構建的真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ能在293T細胞中成功表達出IKKγ蛋白;制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體能與293T細胞表達融合蛋白IKKγ發(fā)生特異性反應，其抗體效價為1∶16000，與PK-15細胞表達IKKγ蛋白也具有良好的反應性，其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表達高峰期。此外，制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體能在PK-15細胞中成功檢測到IKKγ蛋白，說明豬源IKKγ多克隆抗體與真核細胞瞬時表達的IKKγ蛋白特異性良好。【結論】制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有效價高、特異性強等特點，可用于檢測CSFV感染PK-15細胞中IKKγ蛋白表達水平，為下一步研究IKKγ蛋白生物學特性及揭示NF-κB信號通路轉錄調節(jié)功能機制提供技術支持。

關鍵詞： IKKγ;豬瘟病毒（CSFV）;原核表達;真核表達;多克隆抗體

中圖分類號： S852.43? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-3099-10

Abstract：【Objective】The preparation of polyclonal antibody against IKKγ from pigs would lay a foundation for further study on the biological characteristics of IKKγ protein and reveal the interaction mechanism between IKKγ protein and classical swine fever virus（CSFV）. 【Method】The functional fragment of IKKγ gene（561 bp） was cloned from porcine kidney cells（PK-15） by RT-PCR. The recombinant plasmid pET-IKKγ was constructed with the prokaryotic expression vector pET-32a（+）. The recombinant plasmid pET-IKKγ was transformed into Escherichia coli BL21（DE3） competent cells and expressed by IPTG induction. The expressed fusion protein was purified and concentrated， and then the polyclonal antibody of pig IKKγ was prepared by immunizing mice. At the same time， the full-length sequence of IKKγ gene（1356 bp） was cloned and the eukaryotic expression vector pCMV-HA was used to construct the eukaryotic recombinant plasmid pCMV-HA-IKKγ， which was transfected into 293T cells and PK-15 cells respectively to detect the expre-ssion of the fusion protein. 【Result】The prokaryotic recombinant plasmid pET-IKKγ was transformed into BL21 competent cells， and about 40 kD fusion protein was expressed after IPTG induction. The fusion protein was mainly expressed in the form of soluble protein， which could be purified by Ni-NTA affinity chromatography. High-purity fusion protein IKKγ was obtained. The recombinant plasmid pCMV-HA-IKKγ could successfully express IKKγ protein in 293T cells; the polyclonal antibody against porcine IKKγ could specifically react with the fusion protein IKKγ expressed in 293T cells， and the titer of the antibody was 1∶16000， which also had good reactivity with the IKKγ protein expressed in PK-15 cells. The peak of IKKγ protein expression was 36 h after CSFV infection. In addition， IKKγ protein was successfully detected in PK-15 cells by the polyclonal antibody against porcine IKKγ， which indicated that the polyclonal antibody against porcine IKKγ had good specificity with the IKKγ protein expressed in eukaryotic cells. 【Conclusion】The polyclonal antibody against IKKγ from pig has the characteristics of high titer and high specificity. It can be used to detect the expression level of IKKγ protein in PK-15 cells infected with CSFV， and provide technical support for further study on the biological cha-racteristics of IKKγ protein， the interaction between CSFV proteins and revealing the transcriptional regulation mechanism of NF-κB signaling pathway.

Key words： IKKγ; classical swine fever virus（CSFV）; prokaryotic expression; eukaryotic expression; polyclonal antibody

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660722）; National Key Research and Development Program of China （2018YFD0500104）; Guangxi Natural Science Foundation （2017GXNSFAA198137）

0 引言

【研究意義】IκB（Inhibitor of NF-κB）家族包括IκBα、IκBβ和IκBγ等3個成員，IκB蛋白包含一系列的錨蛋白重復序列，可與NF-κB結合;且在正常狀態(tài)下，NF-κB與IκB結合的復合體存在于細胞質中，處于未激活狀態(tài)（Isra?l，2000）。IκB激酶家族（Inhibitor of NF-κB kinases，IKKs）作為核因子Kappa B信號途徑的關鍵成員，能解除IκB對NF-κB的抑制作用，激活參與應激反應、免疫細胞的增殖分化與凋亡及腫瘤形成等相關基因轉錄表達的調控（Péant et al.，2011;艾尼瓦爾·艾木都拉，2020）。IKK激酶復合體主要由2個高度同源的激酶亞基（IKKα/IKK1和IKKβ/IKK2）及1個調節(jié)亞基NEMO（NF-κB essential modulator）/IKKγ構成（Longa et al.，1989）。其中，IKKα和IKKβ在序列上有52%的相似性，且在催化基序內(nèi)相似性可達65%;而IKKγ與IKKa和IKKβ無相似性（Ben-Neriah and Karin，2011）。IKKγ可形成穩(wěn)定的二聚體，并與IKKs復合物的其他亞基相結合。IKKγ二聚體的形成及其與IKKs催化亞基的結合對NF-κB活化起關鍵作用（Li et al.，2011;Zaghloul et al.，2012），是研究病毒蛋白功能及病毒與宿主相互作用機理的理想輔助工具。因此，克隆豬源IKKγ基因并制備豬源IKKγ抗體，對揭示IKKγ蛋白生物學特性及NF-κB信號通路激活原理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】NF-κB是一類重要的轉錄因子，能調控細胞因子、化學激活素、生長因子、細胞黏附分子及其他免疫相關蛋白的表達（康喜龍，2018）。作為調節(jié)亞基，IKKγ在NF-κB途徑中被視為一種支架蛋白，能與多種分子相互作用。在脊椎動物中，NF-κB是調控各種刺激引起細胞凋亡反應的關鍵因素，是控制抗凋亡基因和促凋亡基因表達的主要轉錄因子之一（Kankaya et al.，2015）。IKKγ在IKK復合體中扮演著橋聯(lián)IKKa和IKKβ與其上游激酶的作用（Li et al.，2003），當細胞因子（Cytokine）或病原體相關分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）刺激細胞表面的信號受體，如Toll樣受體4（Toll 1ike receptor 4，TLR4）或腫瘤壞死因子受體1（Tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1），即發(fā)生級聯(lián)反應，進而激活IKK復合體。至今，雖然IKK激酶活化前的級聯(lián)反應機制尚未明確，但與其他激酶類似，IKK激酶活化也需要磷酸化2個絲氨酸殘基（IKKβ- Ser177和181;IKKα-Ser176和180）（Mercurio et al.，1997;Delhase，1999）。在IKK復合體作用下，IκB的第32位和第36位絲氨酸迅速被磷酸化，通過泛素化途徑降解，NF-κB二聚體被釋放出來，并轉移至核內(nèi)促進靶基因轉錄（Tergaonkar et al.，2005;Baker et al.，2011）。IKK激酶屬于大型的多蛋白復合物，可調節(jié)轉錄因子NF-κB活化，且涉及多種生物學過程，包括先天免疫、炎癥及生長發(fā)育等（Priyathilaka et al.，2020）。已有研究表明，marc-145細胞感染藍耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）后，IKKγ基因及其蛋白水平均上調，進一步說明NF-κB信號通路被激活，IKKγ基因參與抗PRRSV免疫（段馬魁等，2018）。IKKγ與IKKα和IKKβ結合，以維持IKK激酶復合體的空間構型，且IKKγ在IKK激酶復合體的活化過程中發(fā)揮信息傳遞作用（Yamaoka et al.，1998），因此IKKγ是研究NF-κB機制的重要靶標（Song et al.，2005）。【本研究切入點】目前，針對人類及鼠等生物的IKKγ已得到深入研究，有關于豬IKKγ的研究則相對較少。研究豬體內(nèi)IKKγ蛋白在病毒感染過程中的相互作用，需要應用豬源IKKγ抗體，但目前全世界的生物制品市場中尚缺乏該抗體。【擬解決的關鍵問題】克隆NF-κB信號通路轉錄途徑中的IKKγ基因，經(jīng)大腸桿菌BL21原核表達獲得融合蛋白并免疫昆明小鼠以獲得效價高且特異性強的多克隆抗體，為進一步研究IKKγ蛋白生物學特性及揭示IKKγ蛋白與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）間相互作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

豬瘟病毒石門株（Shimen strain）、大腸桿菌（DH5α和BL21）、原核表達載體pET-32a（+）、真核表達載體pCMV-HA及氨芐青霉素均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護利用國家重點實驗室保存提供。4周齡昆明小白鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。pMD18-T載體、M-MLV反轉錄酶系統(tǒng)、DNA Extraction Kit、LA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、蛋白純化試劑、佛氏佐劑及質粒抽提試劑盒購自TaKaRa公司;Prime STAR高保真聚合酶、馬抗小鼠綠色熒光二抗、脂質體2000轉染試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及Ni-NTA親和樹脂購自天根生化科技（北京）有限公司;膠回收試劑盒Gel Extraction Kit、抗HA標簽鼠源單克隆抗體及抗His標簽鼠源單克隆抗體購自康為世紀生物科技有限公司;免疫熒光染色試劑盒—抗小鼠Alexa Fluor 488和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯示試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1. 2 引物設計與合成

1. 2. 1 原核表達引物設計 參照GenBank已公布的IKKγ基因序列（XM_005674035），采用Oligo 7.0設計引物，原核表達載體的上、下游引物分別插入EcoR I和Not I酶切位點，引物委托廣州華大生物技術有限公司合成。其中，上游引物IKKγ-561-E：5'-GAATTCGAGCAGGGTGCTCCTGAG-3'（下劃線為EcoR I酶切位點）;下游引物IKKγ-561-N：5'-GCGG CCGCCAGCTGGGCCAGCTTCCG-3'（下劃線為Not I酶切位點），擴增目的片段大小561 bp。

1. 2. 2 真核表達引物設計 參照1.2.1引物設計步驟設計真核表達引物，分別插入EcoR I和Not I酶切位點，引物委托廣州華大生物技術有限公司合成。其中，上游引物IKKγ-1356-E：5'-GAATTCGGGCCAC CATGCCGCCGCCGGAGAGAC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點）;下游引物IKKγ-1356-N：5'-GCGGCCG CCTACTCGATACACTCCATG-3'（下劃線為Not I酶切位點），擴增目的片段大小1356 bp。

1. 3 克隆載體構建

1. 3. 1 原核表達載體構建 IKKγ基因RT-PCR擴增：取豬腎細胞（PK-15）總RNA進行反轉錄，以反轉錄獲得的cDNA為模板，參照Prime STAR高保真聚合酶使用說明進行PCR擴增。反應體系50.0 μL：cDNA模板3.0 μL，Prime STAR 25.0 μL，IKKγ-561-E和IKKγ-561-N各1.0 μL，ddH2O補至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，進行34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后按Gel Extraction Kit說明進行膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取多個單克隆液體培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定，挑選陽性菌液送至廣州華大生物技術有限公司測序驗證，驗證成功的陽性質粒與原核表達載體用EcoR I和Not I進行雙酶切，在T4連接酶作用下與原核表達載體pET-32a（+）連接過夜（16 ℃），再轉化DH5α感受態(tài)細胞進行擴大培養(yǎng)，抽提原核重組質粒用EcoR I和Not I進行酶切鑒定，陽性原核重組質粒送至廣州華大生物技術有限公司測序驗證。

1. 3. 2 真核表達載體構建 以1.3.1反轉錄獲得的cDNA為模板，采用真核引物IKKγ-1356-E和IKKγ-1356-N進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體上，并轉化DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定，挑選陽性菌液送至廣州華大生物技術有限公司測序驗證，再克隆至真核表達載體pCMV-HA上，經(jīng)EcoR I和Not I酶切鑒定后，將陽性重組質粒送至廣州華大生物技術有限公司測序驗證。

1. 4 融合蛋白表達

以原核重組質粒pET-IKKγ轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落接種于7 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng);然后按1∶100比例將上述菌液接種于30 mL的LB培養(yǎng)基中，并加入0.1 mmol/L IPTG進行誘導表達。分別取誘導前及誘導后6 h的菌液（2 mL）放入離心管中，12000 r/min離心5 min，棄上清液，利用PBS進行重懸，采用細胞破碎儀充分破碎，12000 r/min離心10 min。取上清液、沉淀及破碎的全菌液各100 μL置于不同的1.5 mL離心管中，加入1/5體積5×SDS的蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min變性處理后進行SDS-PAGE電泳，以空載質粒pET-32a（+）在BL21（DE3）感受態(tài)細胞中的誘導表達菌液為對照。

1. 5 融合蛋白純化

由于融合蛋白IKKγ以可溶性蛋白形式表達為主，且目的蛋白含有抗His組氨酸標簽，故采用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白IKKγ。以含20和70 mmol/L咪唑的洗滌液及含250 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，采用Ni-NTA親和層析柱進行純化。將純化收集的上清液、穿透液和洗脫液等樣品分別進行SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍染色分析;同時采用Western blotting檢測分析純化透析后的融合蛋白。Western blotting檢測所用的一抗為抗His標簽鼠源單克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠IgG。

1. 6 免疫小鼠制備多克隆抗體

4周齡昆明小白鼠先飼養(yǎng)3～4 d以適應新環(huán)境，減少外部應激影響。將純化融合蛋白IKKγ與佛氏佐劑乳化成油包水乳劑，通過小鼠背部皮下多點注射進行免疫，免疫程序按照1、7、21和42 d分4次進行免疫。首次免疫時，融合蛋白IKKγ與佛氏佐劑等體積混合乳化，其余免疫則與佛氏不完全佐劑等體積混合乳化，每只昆明小白鼠注射約500 μg的融合蛋白IKKγ。四免后第7 d進行昆明小白鼠眼球采血，分離血清即為制備的IKKγ多克隆抗體，按100 μL/管分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 7 豬源IKKγ多克隆抗體特異性鑒定

按照脂質體2000轉染試劑盒說明，以真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ轉染293T細胞，轉染36 h后收集細胞總蛋白進行Western blotting檢測。以1 MOI的CSFV感染80%單層培養(yǎng)的PK-15細胞，刺激其產(chǎn)生IKKγ蛋白，感染2 h后換成含3%血清的DMEM，分別在0、12、24、36和48 h后收集細胞總蛋白進行Western blotting檢測;同時以真核表達載體pCMV-HA轉染PK-15細胞，48 h后進行間接免疫熒光（IFA）檢測，驗證抗體特異性。

2 結果與分析

2. 1 IKKγ原核表達基因片段選擇

根據(jù)GenBank已公布的豬IKKγ基因序列，對豬IKKγ氨基酸親水性及其抗原指數(shù)進行預測分析，結果（圖1）顯示，其核苷酸序列長度1356 bp，編碼452個氨基酸殘基。選取親水性良好且具有線性表位氨基酸第76～263位點中的187個氨基酸殘基作為目的蛋白，用于制備多克隆抗體。

2. 2 豬IKKγ基因片段擴增結果

采用原核表達引物IKKγ-561-E和IKKγ-561-N，通過RT-PCR擴增獲得豬IKKγ基因片段561 bp（圖2-A）;而采用真核表達引物IKKγ-1356-E和IKKγ-1356-N，通過RT-PCR擴增獲得豬IKKγ基因全長序列1356 bp（圖2-B）。

2. 3 豬源IKKγ原核/真核表達載體構建情況

原核表達載體pET-32a（+）屬于原核高效表達系統(tǒng)，由于攜帶His標簽，Ni2+與6×His螯合后能將His標簽特異性抗體結合至Ni-NTA純化介質上，而未結合的蛋白被洗滌下來，從而獲得高純度的融合蛋白IKKγ。將IKKγ基因片段（561 bp）插入原核表達載體pET-32a（+）中的EcoR I和Not I多克隆位點，即成功構建獲得原核重組質粒pET-IKKγ，具體構建流程如圖3所示。

真核表達載體pCMV-HA屬于真核高效表達系統(tǒng)，插入外源基因片段構建重組真核表達載體，轉染哺乳動物細胞后即可誘導表達HA標記的融合蛋白，便于利用HA標簽抗體對融合蛋白進行檢測分析。將IKKγ基因全長序列（1356 bp）插入真核表達載體pCMV-HA的EcoR I和Not I多克隆位點，即成功構建獲得真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ，具體構建流程如圖4所示。

2. 4 豬源IKKγ原核/真核表達載體鑒定結果

原核重組質粒pET-IKKγ和真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ的雙酶切鑒定結果如圖5所示。其中，原核重組質粒pET-IKKγ經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切后獲得561 bp的IKKγ基因條帶和5900 bp的原核表達載體pET-32a（+）條帶;而真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切后獲得1356 bp的IKKγ基因條帶和3800 bp的真表達載體pCMV-HA條帶。

2. 5 豬源IKKγ基因原核誘導表達形式鑒定結果

將原核重組質粒pET-IKKγ轉化BL21感受態(tài)細胞后，分別以含0.1 mmol/L IPTG和不含IPTG的LB培養(yǎng)基進行誘導表達，誘導6 h后各取1 mL菌液進行超聲波破碎裂解，收集總菌液、上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測及考馬斯亮藍染色。結果（圖6）顯示，重組菌體經(jīng)IPTG誘導能表達出約40 kD的融合蛋白，且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式進行表達。

2. 6 融合蛋白純化與鑒定結果

將Ni-NTA親和層析純化收集的上清液、穿透液、2次洗滌液及5次蛋白洗脫液分別進行SDS-PAGE電泳檢測，結果表明，融合蛋白與Ni-NTA親和層析柱結合良好;含70 mmol/L咪唑的洗滌液可洗滌掉部分雜蛋白，達到洗滌目的;含250 mmol/L咪唑的洗脫液可洗脫全部目的蛋白（圖7-A）。Western blotting鑒定結果顯示，在40 kD處有1條清晰的目的條帶（圖7-B），說明成功獲得較高純度的融合蛋白IKKγ。

2. 7 豬源IKKγ基因真核表達效果

以1∶1000稀釋的抗HA標簽鼠源單克隆抗體為一抗，采用Western blotting檢測真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ轉染293T細胞中融合蛋白IKKγ的表達情況，結果（圖8）顯示，構建的真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ能在293T細胞中成功表達出IKKγ蛋白。

2. 8 豬源IKKγ多克隆抗體效價檢測結果

收集真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ轉染293T細胞后表達的融合蛋白樣品，分別用1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000稀釋的豬源IKKγ多克隆抗體與其進行Western blotting檢測分析，結果（圖9）表明，豬源IKKγ多克隆抗體可與293T細胞表達融合蛋白IKKγ發(fā)生特異性反應，其抗體效價為1∶16000。

2. 9 豬源IKKγ多克隆抗體特異性檢測結果

采用Western blotting檢測豬源IKKγ多克隆抗體與純化后的融合蛋白IKKγ是否發(fā)生反應，結果（圖10-A）顯示豬源IKKγ多克隆抗體的特異性良好。收集CSFV誘導PK-15細胞產(chǎn)生的IKKγ蛋白進行Wes-tern blotting，結果表明，豬源IKKγ多克隆抗體與PK-15細胞表達的IKKγ蛋白反應性良好，其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表達高峰期（圖10-B）?？梢姡苽浍@得的豬源IKKγ多克隆抗體反應性良好。

2. 10 豬源IKKγ多克隆抗體與PK-15細胞表達IKKγ蛋白的反應性

真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ瞬時轉染PK-15細胞48 h后，以1∶300稀釋的豬源IKKγ多克隆抗體為一抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）檢測真核重組質粒pCMV-HA-IKKγ在PK-15細胞中的表達情況，結果顯示，制備的豬源IKKγ多克隆抗體能在PK-15細胞中成功檢測到IKKγ蛋白（圖11），說明制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體與真核細胞瞬時表達的IKKγ蛋白反應性良好。

3 討論

豬源IKKγ是一個由452個氨基酸殘基組成的具有調節(jié)作用的亞基蛋白，雖然其本身不具催化作用，但IKK激酶復合體活性依賴于IKKγ亞單位的完整性。IKKγ與IKK激酶復合體的2個催化亞基（IKKα和IKKβ）在結構上并無同源性（Ishrat et al.，2012）。真核細胞核轉錄因子Rel/NF-κB家族廣泛存在于從昆蟲到人類的細胞中，主要參與細胞的分化、發(fā)育、凋亡、黏附及炎癥反應。NF-κB通過與抑制分子IκB相互作用，在細胞質中保持非活性狀態(tài)，尤其在炎癥細胞因子、細菌脂多糖、病毒感染或應激等多種刺激下，IκB在2個關鍵絲氨酸殘基上發(fā)生磷酸化，且這種修飾可通過蛋白酶體降解機制進行識別及破壞（Karin and Ben-Neriah，2000）。因此，游離的NF-κB進入細胞核后，激活參與免疫和炎癥反應、細胞黏附、生長控制或防止凋亡等基因轉錄水平（Goto et al.，2018）。IKK激酶復合體是NF-κB的上游激酶，其激活方式為刺激依賴性，不同的上游信號激活特異IKK激酶復合體，且可能存在不同的受體及受體附近復合物等信號分子參與。如IL-1R和RIG-1均通過TRAF6將信號傳給IKK激酶復合體，但在其附近存在各自不同的受體接頭復合物，包括MyD88和MAVS（Hayden and Ghosh，2008）。

目前，制備多克隆抗體過程中高效表達目的蛋白最常用的原核表達系統(tǒng)是pET-32a（+），具有簡單、經(jīng)濟、高效等特點（楊忠東和何成，2011），能在短期內(nèi)獲得大量的目的蛋白特異性抗體（耿抒賢等，2020）。本研究的預試驗選用原核表達載體pGEX-4T-1，與原核表達載體pET-32a（+）相比，二者的多克隆酶切位點、自帶標簽及載體大小均不相同。原核表達載體pGEX-4T-1自帶GST標簽，與IKKγ重組構建的原核重組質粒pGEX-4T-1-IKKγ轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，融合蛋白的表達量較低，甚至出現(xiàn)不表達情況，且誘導表達的最適條件難以掌控，蛋白表達量未能達到免疫量要求。選用原核表達載體pET-32a（+）制備豬源IKKγ多克隆抗體的優(yōu)勢在于：（1）可制備獲得良好的免疫原蛋白，作為免疫原免疫小鼠;（2）免疫原的線性表位直接影響多克隆抗體的反應性、特異性、親/疏水性（尹珊，2013）。本研究通過多次摸索不同溫度梯度及IPTG誘導濃度，最終確定在30 ℃及IPTG終濃度為0.1 mmol/L的條件下誘導表達的可溶性蛋白濃度較高。雖然融合蛋白在低溫與低IPTG濃度條件下表達速度較慢，但更有利于其空間結構的正確折疊，更好地保留IKKγ蛋白的免疫原性。

抗體制備是研究目的基因轉錄和表達特性、蛋白間相互作用、蛋白亞細胞定位及蛋白生物學功能的基礎工作（Wootla et al.，2014）。本研究制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有較高親和性，包含多個線性表位，可與多個抗原決定簇結合，可用于檢測293T細胞或PK-15細胞的外源性和內(nèi)源性IKKγ蛋白水平，即豬源IKKγ多克隆抗體具有良好的反應性和較強的特異性。Western blotting檢測結果表明，IKKγ蛋白在CSFV感染PK-15細胞中的表達水平較在正常PK-15細胞中的表達水平明顯上升，IKKγ蛋白可能在與CSFV蛋白互作過程中發(fā)揮重要作用?？梢姡弥苽浍@得的豬源IKKγ多克隆抗體有助于進一步拓展IKKγ蛋白生物學特性及NF-κB信號通路調節(jié)機制研究。

4 結論

制備獲得的豬源IKKγ多克隆抗體具有效價高、特異性強等特點，可用于檢測CSFV感染PK-15細胞中IKKγ蛋白表達水平，為下一步研究IKKγ蛋白生物學特性及揭示NF-κB信號通路轉錄調節(jié)功能機制提供技術支持。

參考文獻：

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（責任編輯 蘭宗寶）