一株石油烴降解菌的鑒定及菌劑的制備研究

劉 虹，曾繁城，高鵬飛，劉翠珠，溫 鋼

(1.吉林化工學(xué)院 資源與環(huán)境工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.北京市水文總站，北京 100089；3.吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

石油烴是多種烴類的混合物，包括正烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴等，這些化學(xué)組分一旦進(jìn)入環(huán)境，通過食物鏈運(yùn)輸，將會表現(xiàn)出長期的毒性，對人類健康和環(huán)境都存在一定的影響，因此，石油污染的問題越來越受到重視[1].近年來，石油污染修復(fù)微生物技術(shù)得到了快速發(fā)展，與其它物理、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，具有廉價(jià)、清潔等優(yōu)勢[2].目前已報(bào)道的降解石油烴的微生物約有100余屬200多種，在實(shí)際應(yīng)用中主要以細(xì)菌為主[3].在微生物修復(fù)石油污染環(huán)境的過程中，大多采用游離菌體或固體菌劑，與游離菌體相比，制備的固體菌劑具有穩(wěn)定性好、易保存、使用方便等優(yōu)點(diǎn)[4].

國內(nèi)外相關(guān)研究大多集中在石油降解菌株的篩選與降解機(jī)理方面，鮮有涉及菌劑的研發(fā)與制備的報(bào)道[5].已有的研究報(bào)道中，葉峰等通過定向馴化活性污泥從而獲得高活性混合菌種，然后將其接種至載體，經(jīng)固體發(fā)酵培養(yǎng)制備復(fù)合微生物菌劑[6]；席北斗等將康氏木霉、白腐菌、變色栓菌與EM菌、固氮菌、解磷菌、解鉀菌按一定配比擴(kuò)大培養(yǎng)制成 5組復(fù)合微生物菌劑[7]；趙延君等對石油降解菌進(jìn)行固定化，按照5%接種量接入活化后的目標(biāo)菌，固定若干小時(shí)，最終得到的固定化菌劑[8].該研究從松原油田石油污染土壤中篩選出一株新的高效降解石油烴菌株，通過16S rDNA序列分析對其進(jìn)行鑒定.并考察了制備其固體菌劑的最佳條件及菌劑對石油烴的降解效果，為石油污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供了新的菌源及技術(shù)支持.同時(shí)，由于選取的菌劑載體為稻殼、核桃殼、玉米秸稈等廢棄材料，在修復(fù)石油污染環(huán)境的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了廢棄物的資源化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(單位： mg/L)：(NH4)2SO42000，K2HPO41550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

原油培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入柴油.

主要儀器設(shè)備：LD4-2A 醫(yī)用離心機(jī)、氣相色譜儀(Agilent7890B)、手提式壓力蒸汽滅菌器、SP-DJ系列垂直凈化工作臺、HZQ-QX 全溫振蕩器、PTC-200 型 PCR 儀(美國)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 總石油烴(Total Petroleum Hydrocarbon,簡稱TPH)測試方法

樣品TPH采用氣相色譜儀進(jìn)行測定.

色譜條件：注入口溫度280.0 ℃，載氣為氮?dú)?，壓?9.5 kPa，總流量37.7 mL/min；分流比為20.0；采用Rtx-1色譜柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，流量為1.65 mL/min，初始溫度80.0 ℃下平衡3.0 min，按8 ℃/min升溫速率升溫至100 ℃，再按10 ℃/min速率升溫至200 ℃，按15 ℃/min速率升溫至280 ℃平衡15 min，總程序35.85 min.柱箱最大溫度330 ℃；檢測器溫度290.0 ℃；進(jìn)樣體積為1.0 μL.

1.2.2 菌株的16S rDNA鑒定

16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增引物：上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′.

PCR擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后于4 ℃保溫.取5 μL 反應(yīng)液與1 μL 6×上樣緩沖液混合，在1%的瓊脂糖凝膠中，于150 V電壓下電泳檢測.

引物合成及PCR產(chǎn)物測序均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成.

1.2.3 菌劑載體的選擇

選用廢棄的稻殼、核桃殼、玉米秸稈作為菌劑載體，以上材料經(jīng)粉碎后，過120目篩作為前體物，然后加入紅木屑(纖維素)以及硅藻土或高嶺土(穩(wěn)定劑)制作載體.將載體接入菌懸液，于130 rpm，30 ℃搖床震蕩培養(yǎng)2 d，然后置于40 ℃的烘箱烘干36 h，干燥后，將其研磨成粉末將固體菌劑接入4 000 mg/L原油培養(yǎng)基中，于130 rpm，30 ℃搖床中培養(yǎng)6 d，用正己烷萃取(培養(yǎng)液：正己烷=5：1).萃取后的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，采用氣相色譜儀測定TPH的殘留量，計(jì)算其降解率.實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)有2個(gè)平行樣，并輔以不接菌劑的空白樣作為對照.

1.2.4 不同菌劑制備條件

(1)不同料水比

載體與水的比例分別選取0.5：1、1：1、1：1.1、1：2、1：2.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，往菌劑中加入水的pH為7，接菌量50%，烘干溫度40 ℃，載體比例(稻殼/核桃殼/玉米秸稈：木屑：高嶺土/硅藻土)85%：10%：5%制備固體菌劑.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行樣.將菌劑接入4 000 mg/L原油培養(yǎng)基中，于130 rpm，30 ℃搖床中培養(yǎng)6 d后測定石油烴殘留量.

(2)不同烘干溫度

分別選取30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃ 5種溫度作為制備菌劑的烘干溫度，進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn)，往菌劑中加入水的pH為7，接菌量50%，料水比為1：2，載體比例(稻殼/核桃殼/玉米秸稈：木屑：高嶺土/硅藻土)85%：10%：5%制備固體菌劑.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行樣.接入菌劑至4 000 mg/L原油培養(yǎng)基中，于130 rpm，30 ℃搖床中培養(yǎng)6 d后測定石油烴殘留量.

(3)不同載體比例

在菌劑制備過程中分別選取載體比例75%：15%：10%、80%：10%：10%、80%：15%：5%、85%：10%：5%和90%：5%:5%，進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn)，往菌劑中加入水的pH為7，接菌量50%，料水比為1：2，烘干溫度40 ℃制備固體菌劑.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行樣.接入菌劑至4 000 mg/L原油培養(yǎng)基中，于130 rpm，30 ℃搖床中培養(yǎng)6 d后測定石油烴殘留量.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的16S rDNA鑒定

將菌株16S rDNA序列輸入Gen Bank數(shù)據(jù)庫，以BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比較，選擇同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0軟件對L4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，500次重復(fù)檢測，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以估計(jì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度.結(jié)果如圖1所示.

圖1 菌株YH基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖1可知：YH菌與Stenotrophomonas acidaminiphila strain進(jìn)化距離較近，判定YH菌株在分類學(xué)屬性為：微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila strain).已有的研究表明，該菌株對芴具有較好的降解效果，在培養(yǎng)11 d后對芴的降解效果達(dá)到86.0%[9].另外，該菌株5 d內(nèi)將15.4 mg/L的微囊藻毒素完全降解[10]，在32 ℃下主動降解丙烯酰胺[11]以及對銅具有較好的降解效果[12].而關(guān)于該菌株在石油烴微生物降解方面未見報(bào)道.

2.2 菌劑最佳載體的確定

由圖2可以看出，使用硅藻土作為穩(wěn)定劑，菌劑對石油烴降解率分別為76%、65%、63%，而使用高嶺土的分別為63%、52%、43%，因此選用硅藻土作為穩(wěn)定劑.所選的3種菌劑載體中，稻殼作為載體，菌劑對石油烴的降解率為76%、63%，玉米殼作為載體，降解率為65%、52%，核桃殼作為載體，降解率為63%、43%，因此選用稻殼作為制備菌劑的載體.

注：載體一：稻殼+硅藻土；載體二：稻殼+高嶺土；載體三：玉米秸稈+硅藻土；載體四：玉米秸稈+高嶺土；載體五：核桃殼+硅藻土；載體六：核桃殼+高嶺土.圖2 不同載體制備的菌劑對石油烴的降解效果

2.3 最佳菌劑制備條件的確定

2.3.1 最佳料水比的確定

降解效果見圖3.

料水比圖3 不同料水比的菌劑對石油烴的降解效果

從圖3中可以看出載體制備過程中料水比為1：2時(shí)菌劑降解石油烴效果最好，降解率達(dá)到72.8%.料水比過低則不能使微生物充分生長，料水比過高可能導(dǎo)致烘干不徹底影響石油烴解.

2.3.2 最佳烘干溫度的確定

從圖4中可以看出，載體制備過程中，烘干溫度為35 ℃時(shí)菌劑降解石油烴效果最好，降解率達(dá)到75.1%.溫度過低或過高不利于微生物生長，在一定溫度內(nèi)升高溫度會微生物的繁殖能力和活性，而溫度過高則會直接殺死微生物，從而影響TPH降解效果.

烘干溫度/℃圖4 不同烘干溫度下菌劑對石油烴的降解效果

2.3.3 最佳載體比例的確定

由圖5中可知，載體(稻殼：木屑：硅藻土)比例為80%：10%：10%時(shí)菌劑降解石油烴效果最好，降解率達(dá)到75.9%.其中，木屑作為纖維素，主要作用是給菌劑載體提供足夠的菌群生長所需的空隙，硅藻土作為穩(wěn)定劑，具有良好的濕度調(diào)節(jié)作用.纖維素與穩(wěn)定劑過高或過低都不利于微生物的生長.

載體比例圖5 不同載體比例的菌劑對石油烴的降解效果

3 結(jié) 論

(1)從松原石油污染土壤中篩選、分離得到一株新的高效降解石油烴菌株YH，通過16S rDNA序列分析，鑒定其為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila strain).

(2)選取廢棄的稻殼、核桃殼、玉米秸稈作為菌劑載體，用YH菌株制備固體菌劑，其最佳制備條件分別為：料水比1：2、烘干溫度35 ℃、載體(稻殼：木屑：硅藻土)比例80%：10%：10%.