茵陳蒿湯對(duì)肝纖維化大鼠Caspase-12通路以及TIMP-1、Smad2的影響*

張貴賢 李木松 魏媛媛 秦 維 陳 暉

(保定市傳染病醫(yī)院 1. 結(jié)核二科 2. 五病區(qū) 3. 四病區(qū) 4. 六病區(qū)， 保定 071000)

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是由各種原因引起的肝臟中纖維和結(jié)締組織增生沉積和纖維分解下降引起的[1]。Caspase是一類富含半胱氨酸的蛋白酶，其中Caspase-12是參與細(xì)胞凋亡的主要蛋白，并且Caspase-12相關(guān)通路在LF中上調(diào)[2]。Smad2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)可通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外機(jī)制的降解參與LF的發(fā)生和發(fā)展[3]。茵陳蒿湯是一種歷史悠久的中醫(yī)方劑，具有清熱，利濕，退黃之功效，有研究認(rèn)為茵陳蒿湯具有治療LF的作用，但是關(guān)于其機(jī)制尚不明確[4]。因此本文主要分析茵陳蒿湯對(duì)LF大鼠的治療作用，并分析其對(duì)Caspase-12通路、TIMP-1、Smad2的影響，分析其可能的治療機(jī)制，為臨床更好地治療LF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，體質(zhì)量180～210 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)：1703371。蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色試劑盒購(gòu)自武漢華美公司(中國(guó))。GRP78、eIF2α和Caspase-12一抗以及相關(guān)二抗購(gòu)自Abcam公司(美國(guó))。PVDF膜(Bio-Rad，美國(guó))。PCR引物由Genewiz(蘇州，中國(guó))設(shè)計(jì)和合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa(日本)。

1.2 建模和藥物處理方法

SD大鼠45只隨機(jī)分為3組，各15只，即對(duì)照組，模型組，茵陳蒿湯組。模型組和茵陳蒿湯組通過(guò)白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃結(jié)合小劑量CCl4腹腔注射建立，CCl4溶解在橄欖油中，體積比為1∶1，注射劑量為0.2 mL/kg體質(zhì)量，每周2次，連續(xù)8周。建模同時(shí)使用茵陳蒿湯灌胃，每次10 mL，連續(xù)灌胃8周。通過(guò)HE染色和Masson染色分析建模情況以及茵陳蒿湯干預(yù)效果，血生化檢測(cè)大鼠肝功能(ALT和AST水平)驗(yàn)證造模的成功性。

茵陳蒿湯制備方法：茵陳18 g，梔子12 g以及大黃6 g制成水煎劑，減壓濃縮至0.35 g/mL。大鼠茵陳蒿湯使用劑量通過(guò)《中藥藥理研究方法學(xué)》換算為3.5 g /kg。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1HE染色和Masson染色:大鼠麻醉處死后取出肝臟組織，立即使用4%甲醛溶液在室溫下固定24 h。脫水并包埋在石蠟中。將樣品切成5 μm厚的均勻薄片并置于APES涂覆的載玻片上。分別通過(guò)HE和Masson試劑進(jìn)行染色，顯微鏡觀察肝組織形態(tài)和纖維化程度。

1.3.2Western Blot:使用Western Blot檢測(cè)肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白水平。在液氮的保護(hù)下裂解組織細(xì)胞，在12 000 r/min，4 ℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無(wú)脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.3RT-qPCR:RT-qPCR用于檢測(cè)肝組織中膠原蛋白Collagen I和Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA的表達(dá)水平。將組織在液氮保護(hù)下研磨裂解，然后用Trizol法提取組織總RNA并溶解于DEPC水中。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85 ℃ 15 s。用實(shí)時(shí)PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)， 95℃ 5 min下激活DNA聚合酶，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的兩步PCR(95℃ 10 s和60℃ 30 s)，延伸75 ℃ 10 min，最終保持在4°C。使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

8周后對(duì)照組大鼠精力充沛、皮毛光滑。模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，皮毛出現(xiàn)明顯脫落，并且腹部出現(xiàn)隆起，部分出現(xiàn)出血。干預(yù)組大鼠未出現(xiàn)腹部隆起和出血情況，皮毛較完整光滑，精力較充沛。

2.2 各組大鼠肝組織HE染色和血生化結(jié)果比較

對(duì)照組大鼠的肝組織中細(xì)胞大小均一，形態(tài)完整，細(xì)胞以中央靜脈為中心成放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰。模型組干細(xì)胞出現(xiàn)顯著形變，細(xì)胞排列異常，出現(xiàn)假肝小葉，并且出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。茵陳蒿湯組肝組織損傷程度較模型組顯著緩解，炎癥反應(yīng)較輕，細(xì)胞排列基本緊密。這提示模型組肝組織出現(xiàn)顯著的損傷，茵陳蒿湯可顯著緩解肝損傷。見圖1。血生化結(jié)果顯示，模型組ALT和AST水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，菌陳蒿湯干預(yù)后ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠8周后肝組織HE染色結(jié)果比較Fig.1 Compariso n of HE staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeks

圖2 各組大鼠8周后血ALT和AST水平比較注：與對(duì)照組比較，##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01Fig.2 Comparison of serum ALT and AST levels of the rats in each group after 8 weeksNote:compared with the control group ##P<0.01;compared with the model group **P<0.01

2.3 各組肝組織Masson染色結(jié)果比較

對(duì)各組大鼠肝組織進(jìn)行Masson染色，圖3中灰藍(lán)色為纖維組織，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化現(xiàn)象，而模型組肝組織出現(xiàn)大量的纖維化染色，茵陳蒿湯組肝組織基本正常，并且僅有少量的纖維化染色。這提示大鼠LF模型建立成功，茵陳蒿湯可顯著抑制LF。

2.4 各組Caspase-12通路比較

建模后8周模型組大鼠肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著升高(P<0.01)，茵陳蒿湯組的GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著低于模型組(P<0.01)，見表1和圖4。

表1 各組GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression levels in each group

2.5 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比較

模型組的Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，茵陳蒿湯組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平顯著低于模型組(P<0.01)，見表2和圖5。

圖3 各組大鼠8周后肝組織Masson染色結(jié)果比較注：與對(duì)照組比較，**P<0.01;與模型組比較,# P<0.01Fig.3 Comparison of Masson staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeksNote:compared with the control group **P<0.01;compared with the model group # P<0.01

表2 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比較Table 2 Comparison of mRNA levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1, and Smad2 in each group

圖4 各組GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression leves in each group

圖5 各組Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2蛋白水平比較Fig.5 Comparison of protein levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1 and Smad2 in each group

3 討論

LF是肝臟對(duì)反復(fù)損傷的傷口愈合反應(yīng)的結(jié)果，多種藥物引起的肝損傷會(huì)引起LF，此外，慢性病毒性肝炎、酒精毒性、自身免疫性疾病和遺傳性代謝紊亂也會(huì)引起LF，肝星狀細(xì)胞(HSC)會(huì)發(fā)展成肌成纖維細(xì)胞樣表型，并過(guò)量表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白和Collagen I、Collagen III蛋白[5]。LF會(huì)影響肝功能和機(jī)體的代謝水平，并且LF尚無(wú)特異性的治療藥物，探究有效的治療LF的方法具有重要意義。

中藥在治療LF中有著較好的效果，茵陳蒿湯記載于《傷寒論》，具有保肝利膽之功效，有研究顯示茵陳蒿湯在治療肝損傷中有較好的效果[6]，最近也有研究顯示茵陳具有治療LF的作用[7]。本次研究中通過(guò)CCl4建立LF模型，并通過(guò)HE染色后和Masson染色鑒定建模成功，通過(guò)茵陳蒿湯灌胃治療可顯著地減少纖維組織的生成，并保護(hù)肝細(xì)胞及肝小葉結(jié)構(gòu)，具有較好的保肝作用，這與過(guò)往的研究結(jié)果相一致[7]。此外，進(jìn)一步的研究也顯示模型組的Collagen I、Collagen III mRNA水平顯著高于對(duì)照組，茵陳蒿湯組Collagen I、Collagen IIImRNA水平顯著低于模型組?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)可以通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解[8]。本次研究結(jié)果顯示模型組的TIMP-1 mRNA水平顯著高于對(duì)照組，茵陳蒿湯組TIMP-1 mRNA水平顯著低于模型組。這說(shuō)明茵陳蒿湯可抑制細(xì)胞外機(jī)制的生成，抑制纖維化進(jìn)程，并保護(hù)肝組織，但是關(guān)于其治療機(jī)制尚無(wú)定論。

有研究認(rèn)為肝細(xì)胞凋亡水平增加是LF過(guò)程造成肝損傷的主要因素，細(xì)胞凋亡主要有三種通路，即線粒體途徑、死亡受體相關(guān)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路，Caspase-12通路可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起細(xì)胞凋亡，Caspase-12通路的激活被發(fā)現(xiàn)可能是LF的機(jī)制之一[9]。本次研究結(jié)果顯示模型組ALT和AST水平顯著高于對(duì)照組，菌陳蒿湯干預(yù)后ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，菌陳蒿湯可以有效改善模型大鼠的肝功能，符合我們的預(yù)期。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著升高，茵陳蒿湯組的GRP78、eIF2α和Caspase-12顯著低于模型組。研究認(rèn)為抑制Caspase-12通路可顯著減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減少細(xì)胞凋亡[10]。Kim等[11]研究也發(fā)現(xiàn)使用caspase抑制劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)LF。Smad2可調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Smad2是參與LF的發(fā)生和發(fā)展的重要基因[12]。本次研究結(jié)果顯示模型組的Smad2 mRNA水平顯著高于對(duì)照組，茵陳蒿湯組Smad2 mRNA水平顯著低于模型組。有研究發(fā)現(xiàn)更低水平的TIMP-1具有更好的治療效果[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)抑制Smad2可有效地抑制LF[14]。這提示茵陳蒿湯可能通過(guò)抑制Caspse-12通路以及Smad2基因的表達(dá)抑制肝細(xì)胞凋亡和抑制LF，從而發(fā)揮保護(hù)肝組織的作用。

綜上所述，茵陳蒿湯可顯著緩解大鼠肝組織的纖維化，這可能由于茵陳蒿湯具有抑制Caspase-12通路以及Smad2基因的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化和抗凋亡的作用有關(guān)。說(shuō)明茵陳蒿湯對(duì)于LF具有較好的治療效果，但是關(guān)于其治療LF的劑量、安全性以及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。