CLC對(duì)凍融牛精子體外獲能及抗氧化、抗凋亡能力的影響

徐一超，金一，孟楊

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

膽固醇作為膜功能的調(diào)節(jié)劑起著多重作用[1]，影響膜的流動(dòng)性[2]和滲透性[3]。它還降低了膜所轉(zhuǎn)換的溫度，使膜保持在流體狀態(tài)，從而減少了低溫時(shí)可能發(fā)生的損傷[4]。據(jù)報(bào)道，高膜膽固醇水平會(huì)降低低溫下的膜結(jié)晶，從而通過(guò)減少結(jié)構(gòu)之間的自由度和精子表面蛋白的生物活性來(lái)抑制間接獲能[5]。

β-環(huán)瑚精是由7個(gè)葡萄糖殘基以α-1，4糖苷鍵連接而成的呈桶型立體結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚糖。β-環(huán)糊精分子中葡萄糖單位是以椅式構(gòu)象存在，所有C6上伯醇羥基都位于穴洞外面的下邊緣，其他各種醇羥基都位于穴洞外面的上邊緣。所以，β-環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)中穴洞外邊緣具有親水性，穴洞內(nèi)壁為氫原子和糖苷鍵氧原子，具有疏水性，所以能和膽固醇等多種物質(zhì)形成包合物。

包埋膽固醇的甲基-β-環(huán)糊精(cholesterol-loaded cyclodextrin，CLC)由于膽固醇的生物學(xué)功能，充當(dāng)冷凍保護(hù)劑能提高凍融精子的各項(xiàng)特性，以往的研究表明 CLC補(bǔ)充劑對(duì)質(zhì)膜完整性，活力以及頂體完整性的起到一定的保護(hù)作用[6]。然而，有關(guān) CLC對(duì)蛋白的酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞凋亡的影響的論文未見(jiàn)報(bào)道。因此，在本研究皆在探討CLC對(duì)凍融牛精子獲能狀態(tài)及抗氧化、抗凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 精液來(lái)源

試驗(yàn)選擇西門(mén)塔爾公牛精液，精液樣本均來(lái)自于延吉市犇福種公牛場(chǎng)，精液凍精容量為0.25 mL。

1.2 試劑

CLC、果糖、葡萄糖、丙酮酸鈉、慶大霉素由Sigma公司生產(chǎn)；RIPA、PMSF、動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究公司生產(chǎn),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 精子稀釋液配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉、Tris、葡萄糖、蛋黃、甘油，并加入雙抗，均勻在38 ℃水浴鍋預(yù)熱，備用。

1.4 精子解凍

將裝有精液的麥管放置到提前預(yù)熱的38 ℃水浴鍋中解凍40 s，取出以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.5 精子品質(zhì)檢測(cè)

1.5.1 精子CASA檢測(cè)

將解凍后的精子樣本放在倒置顯微鏡下，通過(guò)精子CASA儀檢測(cè)精子活力及其他活力指標(biāo)。

1.5.2 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)

精子冷凍-解凍后，進(jìn)行低滲腫脹法(HOST法)檢測(cè)，精子樣本置于37 ℃的低滲溶液中，在恒溫培育箱培育30 min，取10 μL精子懸浮液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上記錄尾部彎曲的精子數(shù)量百分比，隨機(jī)選擇200個(gè)以上精子，重復(fù)5次。

1.5.3 精子頂體膜完整性檢測(cè)

精子冷凍-解凍后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)，將樣本精液滴到載玻片上均勻涂開(kāi)，用考馬斯亮藍(lán)染液均勻覆蓋在涂有精液樣本的載玻片上，在常溫環(huán)境下避光染色30 min后，用蒸餾水洗去多余染液，自然烘干后放在顯微鏡下記錄頂體完整的精子數(shù)量百分比，隨機(jī)選擇200個(gè)以上精子，重復(fù)5次。

1.6 蛋白免疫印記

將解凍后的精子用RIPA及PMSF裂解充分，并提取出總蛋白樣本。同時(shí)進(jìn)行SDSPAGE電泳，把所得蛋白條帶轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用TBST緩沖液清洗3遍(每次10 min)，用脫脂奶粉緩沖液封閉2 h。隨機(jī)再用TBST清洗3遍(每次10 min)加入抗磷酸酪氨酸抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，棄掉一抗廢液，TBST清洗3遍每次10 min；加入羊抗鼠IgG HRP，在室溫?fù)u床孵育2 h，棄掉二抗廢液，TBST清洗3遍每次10 min。將ECL顯影試劑均勻覆蓋在膜上，放入數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)中，成像拍照。

1.7 PCR檢測(cè)

將冷凍-解凍后的精子樣本按照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取RNA，(表1為目的基因與內(nèi)參GAPDH引物序列)。再將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×TaqPCR MasterMix 6.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s與72 ℃延伸30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；最后溫度到達(dá)4 ℃。結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 目的基因與內(nèi)參GAPDH引物序列

基因引物(5′→3′)大小/bp退火溫度/℃CAT-FAGTCCTGCTCCCTGTTGTTCAT-RTACCGTGCCAGTCCCTAGT10756GPx-FAGTCCTGCTCCCTGTTGTTGPx-RGGAGGACAGGTTGAAGGGC13160GAPDH-FCTGGTGCTGAGTATGTGGTGAPDH-RCAATCTTGAGGGTGTTGTT9156SOD-FTAGACACAGAAAACAAACTSOD=RCACATACACACTCACTCAC21560Caspase-3-FCAGTGGTGCTGAGGATGACCaspase-3-RCACAAAGAGCCTGGATGAA13756Caspase-8-FCTGCCCTCAAGTTCCTAAGCaspase-8-RGTTTTCCTCCAACATTCTC11356BAX-FTAGACACAGAAAACAAACTBAX-RCACATACACACTCACTCAC21555

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本次試驗(yàn)的結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行檢測(cè)與分析。 PCR的試驗(yàn)結(jié)果采用LANE軟件進(jìn)行分析與檢測(cè)。所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS19軟件進(jìn)行分析，利用方差分析進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性，P<0.05表示差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用X±SD進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的CLC對(duì)凍融精子質(zhì)量的影響

表2所示，在冷凍保護(hù)劑中添加不同濃度CLC(0、0.5、1、1.5及2 mg/mL )，處理組與對(duì)照組之間以及處理組之間的精子的活率、質(zhì)膜完整性及頂體膜完整性均無(wú)顯著差異(P<0.05)。

表2 CLC對(duì)凍融牛精子質(zhì)量參數(shù)的影響

質(zhì)量參數(shù)對(duì)照組CLC(mg/mL)處理組0.511.52精子活力/%88.37±2.1289.02±2.8388.67±1.6187.88±2.4488.06±2.39質(zhì)膜完整性/%64.87±0.4565.31±1.5765.02±0.2164.35±2.1764.82±1.37頂體完整性/%65.23±2.0265.71±1.4065.42±0.7064.82±1.3764.39±3.10

2.2 添加不同濃度CLC處理組對(duì)凍融牛精蛋白的酪氨酸磷酸化水平的影響

將6個(gè)不同處理組(冷凍-解凍非獲能、冷凍-解凍獲能、0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL CLC)的蛋白進(jìn)行 Western blot分析，分別運(yùn)用酪氨酸磷酸化一抗與酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育之后，得出(如圖1A)顯示，分子量大約在32 KDa處出現(xiàn)了蛋白條帶，將蛋白條帶進(jìn)行分析，制出酪氨酸磷酸化水平的條帶灰度值(如圖1B)，0.5 mg/mL CLC處理組精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平與凍融后獲能對(duì)照組的水平最為相近。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。下同

圖1 CLC素對(duì)凍融牛精子體外獲能的影響

2.3 不同濃度的CLC處理組對(duì)凍融牛精子抗氧化基因表達(dá)量的影響

將添加了不同濃度CLC進(jìn)行冷凍保存的精子進(jìn)行解凍之后，進(jìn)行RNA的提取，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA電泳試驗(yàn)。檢測(cè)精子內(nèi)的抗氧化基因CAT、GPX、SOD、GAPDH的表達(dá)量。圖2A為所得到的條帶，圖2B為抗氧化基因表達(dá)量的柱狀圖。從圖2結(jié)果中可以看出在添加不同濃度(0、0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL CLC)后保存的精子，經(jīng)過(guò)解凍之后，精子內(nèi)的抗氧化基因CAT、GPX、SOD、GAPDH的含量在處理組0.5 mg/mL CLC、1.0 mg/mL CLC和2.0 mg/mL 均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。添加1.5 mg/mL CLC組的精子中與對(duì)照組差異不顯著。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5. 0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL CLC

圖2 CLC對(duì)凍融后牛精子CAT、GPX和SODmRNA表達(dá)量的影響

2.4 不同濃度的CLC處理對(duì)凍融牛精子內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響

將添加了不同濃度CLC進(jìn)行冷凍保存的精子進(jìn)行解凍之后，進(jìn)行RNA的提取，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA電泳試驗(yàn)。檢測(cè)精子內(nèi)的凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達(dá)量。圖3A為所得到的條帶，圖3B為凋亡基因相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖。從圖三3結(jié)果中可以看出精子內(nèi)細(xì)胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。也顯著低于1.5和2.0 mg/mL CLC處理組(P<0.05)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL

圖3 CLC對(duì)凍融后牛精子Caspase-3，Caspase-8和BAXmRNA表達(dá)量的影響

3 討論

許多研究證明了CLC在冷凍保存過(guò)程中對(duì)精子的保護(hù)作用。CLC使膽固醇摻入精子膜，從而防止其在冷凍保存過(guò)程中丟失[7]。在本研究中，CLC的加入改善了精子活力，和精子百分比，在平衡和解凍后具有完整的頂體。目前關(guān)于CLC的有益作用支持了其他類似報(bào)道的結(jié)果[7，8-13]。此外，在冷凍保存的公牛，公羊和種馬精子中，已經(jīng)表明，當(dāng)在冷凍前加入CLC時(shí)，膜的膽固醇含量增加2至3倍[7,9,12]。雖然，膽固醇改善精子冷凍存活的確切機(jī)制仍然未知，但增加膽固醇與磷脂的比例可能提高了對(duì)冷休克的抵抗力，減少了細(xì)胞成分的泄漏或抑制了鈣進(jìn)入精子，從而減少了獲能[12]。

本次試驗(yàn)中將0 、0.5、1、1.5及2 mg/mL的CLC添加到牛精液中，進(jìn)行冷凍解凍之后，檢測(cè)與對(duì)照組間的精子質(zhì)量差異，繼續(xù)進(jìn)行凍融后牛精子的活率、質(zhì)膜完整性、頂體膜完整性的檢測(cè)，從數(shù)據(jù)中可以看出，在冷凍解凍的過(guò)程中，在添加不同處理組(0、0.5、1、1.5 及2 mg/mL CLC)中的結(jié)果與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，由此可以證明 CLC對(duì)冷凍保存的牛精液沒(méi)有破壞性的作用，并且可以在一定的基礎(chǔ)上改善由于冷凍帶來(lái)的損傷，和在一定的程度上改善了精子受到的一系列損傷。

蛋白酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)與獲能相關(guān)的事件的重要調(diào)節(jié)途徑。有研究表明，一種55 kDa的酪氨酸磷酸化蛋白與牛精子的運(yùn)動(dòng)性有關(guān)[14]。平衡后缺少p32蛋白的酪氨酸磷酸化和冷凍-解凍樣品中所述蛋白質(zhì)的高磷酸化率表明該特定蛋白質(zhì)在平衡過(guò)程中沒(méi)有作用，但當(dāng)這種磷酸化條帶存在時(shí)總是發(fā)生獲能[15]，因此通過(guò)不同CLC處理組中p32的條帶強(qiáng)度的變化，進(jìn)一步增強(qiáng)了上述調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化的可能性。從數(shù)據(jù)中可以看出，1.0 mg/mL CLC處理組精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平最高，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異，顯示出更接近新鮮精液的獲能狀態(tài)。說(shuō)明在1.0 mg/mL CLC處理組精子發(fā)生獲能和“獲能樣”變化之后，蛋白的酪氨酸磷酸化水平有一定程度上的上升。

Zha等[16]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在牛的卵母細(xì)胞中，為了能夠提高卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)量，便通過(guò)向體外的成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素，則GSH和ATP的濃度由顯著性的提高，與此同時(shí)，他們所檢測(cè)的抗氧化相關(guān)基因(SOD、CAT和GPx)mRNA的表達(dá)量也顯著的提高。本試驗(yàn)選擇了CAT、GPX和SOD基因進(jìn)行檢測(cè)。由試驗(yàn)結(jié)果顯示，在處理組0.5 mg/mL、1 mg/mL CLC凍融牛精子內(nèi)的抗氧化基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。1.5 mg/mL CLC處理組的凍融牛精子內(nèi)的抗氧化基因的表達(dá)量與對(duì)照組的表達(dá)量相接近，無(wú)顯著差異。

最近Men等[17]報(bào)道了使用熒光素FragEL DNA片段化的檢測(cè)和半胱天冬酶-3檢測(cè)冷凍-解凍的牛卵母細(xì)胞和胚胎中的細(xì)胞凋亡。Caspase-3被認(rèn)為是存在于細(xì)胞質(zhì)中的主要蛋白酶。適當(dāng)?shù)腃aspase級(jí)聯(lián)在精子的分化和睪丸的成熟中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。BAX屬于Bcl-2家族中的一份子，它參與細(xì)胞的凋亡。分析了不同CLC處理組與對(duì)照組之間的精子內(nèi)的凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達(dá)量，結(jié)果顯示0.5 mg/mL和1.0 mg/mL精子內(nèi)的凋亡基因顯著低于對(duì)照組和其他處理組。其中0.5 mg/mL處理組最低。說(shuō)明細(xì)胞的凋亡程度降低，對(duì)精子的保護(hù)目的起到了作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明濃度為0.5～1.0 mg/mL CLC的凍融牛精子獲能處理后蛋白的酪氨酸磷酸化水平較正常，表明0.5～1.0 mg/mL CLC可以改善凍融后牛精子質(zhì)量。濃度為0.5～1.0 mg/mL CLC顯著提高了凍融后牛精子的抗氧化能力和顯著抑制了精子內(nèi)的細(xì)胞凋亡，對(duì)牛精子起到了保護(hù)作用。