遺傳工程小鼠凍存卵巢異體原位移植比較研究

左 琴 王勁松 范 濤 朱婉月 劉秋菊 劉佐民

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，北京 100050)

隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，研發(fā)產(chǎn)生的遺傳工程小鼠日漸增加，對(duì)于這些遺傳資源的種質(zhì)保存目前主要采用精子冷凍和胚胎冷凍技術(shù)。精子冷凍和胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成為資源保存的主要手段和方法，但是一些遺傳工程小鼠尤其是疾病模型小鼠因自身的繁殖能力低下，或未成年就死亡，或因先天性無(wú)輸卵管、子宮等而出現(xiàn)繁殖困難或斷種等問(wèn)題[1]。卵巢冷凍和卵巢異體原位移植技術(shù)就成為保存此類雌性遺傳工程小鼠或珍惜動(dòng)物生殖功能的有效手段,是種質(zhì)資源保存方法的必要補(bǔ)充，同時(shí)在研究不孕癥治療模型方面也有著廣闊的應(yīng)用前景。

卵巢組織移植作為研究繁殖生理的重要工具，多數(shù)的卵巢生理研究是將卵巢組織移植到皮下、腎包膜下等不同部位研究和分析激素的產(chǎn)生和卵巢功能的重建，本研究采用將卵巢移植到同種不同受體的同一部位即原位移植方式，使得移植受體可以實(shí)現(xiàn)妊娠與生育，這對(duì)滿足特定個(gè)體生育要求以及挽救瀕危動(dòng)物物種具有特殊意義，1940年Robertson[2]首次報(bào)道了小鼠卵巢原位移植，此后這項(xiàng)技術(shù)得到Jackson實(shí)驗(yàn)室的改進(jìn)和應(yīng)用。小鼠卵巢組織冷凍移植并得到后代首次由Parrot[3]在1960年報(bào)道，研究者們隨后進(jìn)行了卵巢慢速冷凍、玻璃化冷凍和快速冷凍的研究。

本實(shí)驗(yàn)選用DAP213快速冷凍法[4]凍存卵巢并在復(fù)蘇后原位移植，采用兩種背景品系小鼠進(jìn)行異體原位移植并進(jìn)行比較，通過(guò)比對(duì)可以更快確定遺傳背景，更好地完善冷凍保種體系；通過(guò)比對(duì)幼鼠毛色，可以直觀地辨別其目的基因，確認(rèn)遺傳背景，顯著加快了基因型的檢測(cè)工作，為小鼠種質(zhì)資源保存奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

M2培養(yǎng)液(M7167-100ML, SIGMA)，M2培養(yǎng)液(M7292-100ML, SIGMA)，0.7%戊巴比妥鈉溶液(P3761-5G, SIGMA)，0.9%生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；0.25 mol/L蔗糖溶液、1 mol/L DMSO培養(yǎng)液和DAP213冷凍保護(hù)液(COSMO BIO CO.,LTD, JAPAN)。

CO2培養(yǎng)箱(8000DH, THERMO)；體式顯微鏡(SMZ645, NIKON)；冰箱(西門(mén)子KK21V1160 W)；維納斯剪和脂肪鑷等手術(shù)器械。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究中使用C57BL/6 J、B6 albino(JAX000058)等品系均為SPF級(jí)小鼠，由國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心提供并飼養(yǎng)。10日齡體質(zhì)量6～8 g的C57BL/6 J和遺傳背景來(lái)源于C57BL/6 J的SCARB2、PSGL1、IGB3S遺傳工程純合雌鼠(本單位研發(fā))為提供卵巢的供體鼠，4周齡13～15 g的C57BL/6 J和B6 albino雌鼠為受體鼠接受卵巢移植，B6 albino除了毛色基因與C57BL/6 J不一樣外其他遺傳背景相同，10周齡體質(zhì)量26～28 g的C57BL/6 J成年雄鼠用于與卵巢移植復(fù)蘇后受體鼠交配，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組中均分別使用5只供體鼠及受體鼠。實(shí)驗(yàn)中共使用50只供體鼠和50只受體鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)是SCXK(京)2014-0013；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)是SYXK(京)2016-0004。

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行，福利倫理審查證號(hào)是中檢動(dòng)(福)第2014(B)003號(hào)，所有實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心進(jìn)行。

1.3 供體鼠卵巢的取材

10日齡供體幼鼠頸椎脫臼處死，皮膚消毒，打開(kāi)腹腔，暴露兩側(cè)子宮及卵巢，用脂肪夾固定卵巢脂肪，在解剖鏡下用兩把鑷子撕開(kāi)卵巢囊膜，暴露卵巢后用維納斯剪剪斷卵巢蒂底部連接處，將整個(gè)卵巢取出，放置到0 ℃冰盒上平衡的M2溶液中準(zhǔn)備凍存或直接移植。

1.4 卵巢冷凍保存

采用DAP213方法凍存[4]，用微量加樣器取100 μL的1 mol/L的DMSO溶液在60 mm培養(yǎng)皿上做4個(gè)液滴，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的供體卵巢從M2溶液轉(zhuǎn)移到DMSO液滴中平衡1 min，連續(xù)在DMSO溶液中轉(zhuǎn)移平衡3次，最后一次平衡后將卵巢放入已在冰盒上內(nèi)已有5 μL 1 mol/L的DMSO凍存管中，再次檢查兩側(cè)卵巢是否均放入，完成后將凍存管放入冰盒平衡5 min，再將45 μL的DAP213凍存保護(hù)劑加入凍存管，擰上凍存管蓋子，再次平衡5 min，然后快速將凍存管放入到液氮罐中的凍存架上。

1.5 凍存卵巢的復(fù)蘇

采用文獻(xiàn)方法復(fù)蘇[4]，從液氮罐中取出冷凍保存3～6個(gè)月的凍存管，迅速擰開(kāi)蓋子，倒出管內(nèi)液氮，立即計(jì)時(shí)30 s，用移液器取已經(jīng)在37 ℃預(yù)熱的0.25 mol/L蔗糖溶液900 μL，在計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，到時(shí)將蔗糖溶液順著距凍存管底部1 cm的管壁打入，并吸吹20次左右后將全部溶液連同卵巢吸出放到培養(yǎng)皿中，找到卵巢后，立即移入已經(jīng)在37 ℃預(yù)熱的100 μL的M16溶液液滴中，在液滴中平衡1 min，同樣轉(zhuǎn)移平衡10次后，將已經(jīng)復(fù)蘇回收的卵巢放入在冰盒上平衡的100 μL M2液滴中，準(zhǔn)備移植待用。

1.6 受體卵巢移植

受體鼠用0.7%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹背部開(kāi)口，摘除整個(gè)卵巢，再將新鮮或解凍復(fù)蘇的四個(gè)品系遺傳工程小鼠卵巢移植到C57BL/6 J和B6 albino受體鼠移出卵巢的原位中，將卵巢包膜覆蓋住移植卵巢，隨后將子宮和卵巢輕輕放回腹腔，縫合肌肉層和皮膚層。另外一側(cè)卵巢用同樣方法進(jìn)行操作。手術(shù)后將受體鼠置于37 ℃恒溫臺(tái)保溫，蘇醒后送回飼養(yǎng)間。

1.7 移植后繁殖方式

將卵巢移植后受體鼠飼養(yǎng)到10周齡，與10周齡性成熟C57BL/6 J雄鼠1∶1長(zhǎng)期交配，妊娠產(chǎn)仔后，觀察和記錄每胎產(chǎn)仔數(shù)及毛色。遺傳工程小鼠剪尾進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6 J新鮮和凍存卵巢原位移植到不同受體的比較

將10日齡C57BL/6 J雌鼠新鮮卵巢和凍存復(fù)蘇卵巢原位移植到4周齡C57BL/6 J和B6 albino體內(nèi)，表1結(jié)果顯示，C57BL/6 J新鮮卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.8±1.5)個(gè)；C57BL/6 J凍存卵巢移植妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±0.8)個(gè),新鮮卵巢移植和凍存卵巢移植比較有顯著性差異(P<0.05)。C57BL/6 J新鮮卵巢移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(4.0±1.0)個(gè)，毛色均為黑色；凍存卵巢移植妊娠率是100%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.6±1.0)個(gè)，毛色均為黑色，受體是B6 albino，易從毛色就可以分辨出生小鼠來(lái)自于供體小鼠，新鮮卵巢移植和凍存卵巢移植比較有極顯著性差異(P<0.01)。兩種受體在凍存卵巢移植后的產(chǎn)仔數(shù)均低于新鮮卵巢產(chǎn)仔數(shù)。

表1 新鮮和凍存卵巢異體原位移植比較Table 1 Comparing the result of fresh and frozen/thawed ovarian heterotopically transplantion

2.2 遺傳工程小鼠凍存卵巢原位移植到不同受體的比較

將10日齡純合遺傳工程小鼠SCARB2、PSGL1、IGB3S雌鼠凍存復(fù)蘇卵巢原位移植到4周齡C57BL/6 J和B6 albino體內(nèi)，表2結(jié)果顯示，SCARB2品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是100%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±1.5)個(gè)；移植到B6 albino妊娠率是60%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.3±1.2)個(gè)，毛色均為黑色,兩種受體比較有顯著性差異(P<0.05)。PSGL1品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.3±1.1)個(gè)；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±1.1)個(gè)，毛色為黑色, 兩種受體比較無(wú)顯著性差異。IGB3S品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是60%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.7±0.5)個(gè)；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.3±0.8)個(gè)，毛色為黑色，兩種受體比較有顯著性差異(P<0.05)?；驒z測(cè)后均為雜合子。

表2 遺傳工程小鼠凍存卵巢異體原位移植比較Table 2 Comparing the result of frozen/thawed genetically modified ovarian heterotopically transplantion

3 討論

彭南妮等[5]總結(jié)了卵巢移植技術(shù)的進(jìn)展，19世紀(jì)60年代開(kāi)始進(jìn)行卵巢移植技術(shù)的研究，并相繼成功進(jìn)行了小鼠、大鼠、兔、羊、獼猴和人的卵巢移植，開(kāi)創(chuàng)了卵巢自體原位移植，自體異位移植，同種異體移植和異種移植等技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了小鼠的同種異體原位卵巢移植。Lara等[6]將受體動(dòng)物雙側(cè)卵巢全切，體內(nèi)缺乏性激素的條件下，發(fā)現(xiàn)植入異體的雙側(cè)卵巢發(fā)育良好，具有內(nèi)分泌功能，并能與上級(jí)器官，即下丘腦垂體產(chǎn)生反饋應(yīng)答，維持正常的動(dòng)情周期，洪勝輝[7]將10月齡背景為C57BL/6 J小鼠的轉(zhuǎn)基因小鼠新鮮卵巢取出，移植到8周齡C57BL/6 J體內(nèi)，得到轉(zhuǎn)基因小鼠的雜合后代，郁麗麗等[1]以10日齡、20日齡和4周齡鼠的卵巢為供體，移植到4周齡同品系的小鼠體內(nèi)的結(jié)果顯示，將卵巢異體移植受體后和正常的雄鼠交配，三組實(shí)驗(yàn)鼠均可懷孕產(chǎn)仔說(shuō)明移植卵巢可以在受體內(nèi)存活，并正常發(fā)育成熟和輸卵管子宮建立互動(dòng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)將10日齡 C57BL/6 J小鼠新鮮和凍存卵巢移植到4周齡C57BL/6 J及B6 albino，恢復(fù)后和正常雄鼠交配，均妊娠產(chǎn)仔，與以上結(jié)論相符。

Parrot[3]將卵巢組織切片在12%甘油中平衡40 min再慢速冷凍到-79 ℃，原位移植后1/10的小鼠妊娠產(chǎn)仔。1997年，Gunasena等[8-9]發(fā)表了關(guān)于小鼠卵巢冷凍保存的兩篇文章，報(bào)道了整個(gè)卵巢凍存后原位移植產(chǎn)仔，第一篇文章中是將凍存復(fù)蘇后的卵巢移植給提供卵巢的同一只雌鼠，結(jié)果有63%的妊娠率，這個(gè)研究中存在一個(gè)問(wèn)題，即是不能區(qū)分妊娠是由凍存復(fù)蘇移植卵巢導(dǎo)致的或是之前的卵巢殘余組織導(dǎo)致的妊娠，在第二篇文章中使用免疫缺陷小鼠作為受體，結(jié)果有25%的妊娠率。兩次研究中的凍存方法都一樣，用1.4 mol/L DMSO作為凍存液，在液氮蒸汽平衡后用程序降溫儀慢速冷凍的方法。1998年Jorge等[10]采用慢速冷凍法凍存小鼠半個(gè)卵巢，在復(fù)蘇移植后有57%的妊娠率。2004年朱孝榮等[11]用玻璃化冷凍液EFS40對(duì)Latsl基因敲除雜合子小鼠卵巢進(jìn)行玻璃化冷凍，復(fù)蘇后卵巢囊原位移植，移植后妊娠率為33.3%，平均產(chǎn)仔數(shù)為(3.7±2.2)只。本研究用在胚胎冷凍上已經(jīng)取得極高成活率的DAP213冷凍保存液[4]，快速冷凍保存10日齡的C57BL/6 J小鼠及遺傳工程小鼠卵巢，復(fù)蘇及原位移植到C57BL/6 J和B6 albino品系后有60%以上的妊娠率，平均產(chǎn)仔數(shù)在(2.3±0.8)只以上，并且通過(guò)移植到除了毛色基因不一樣，有相同遺傳背景的B6 albino小鼠上，在妊娠產(chǎn)仔后很容易通過(guò)幼鼠的毛色辨別是否來(lái)自于C57BL/6 J的背景。卵巢移植面臨的最大障礙是不同個(gè)體之間存在免疫排斥反應(yīng)，要選擇遺傳背景相同的受體，但有時(shí)沒(méi)有合適的相同背景的受體，進(jìn)行卵巢的異種移植主要選用免疫缺陷動(dòng)物作為移植受體如裸鼠、重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠等[5]，所以下一步的研究將進(jìn)行凍存卵巢的異種移植。