蒙椴組培腋芽增殖快繁的影響因子研究

趙淑珍，穆曉松，石艷龍，馬雨峰，石 健

（1.承德市園林管理中心，河北 承德067000；2.承德縣園林綠化管理服務(wù)中心，河北 承德067000；3.河北豐寧抽水蓄能有限公司，河北 豐寧068350；4.承德德營苗木種植有限公司，河北 承德067000）

蒙椴（Tilia mongolicaMaxim.）是椴樹科、椴樹屬植物，分布于中國北部各省。萌芽力強(qiáng)，秋葉亮黃色，具有一定的耐蔭性?？刮廴灸芰?qiáng)，觀賞效果好，在道路綠化中很受歡迎。蒙椴花冠秀美、濃郁芳香，可制成干花食用，是制做飲料的上等原料，也是很好的蜜源植物。其木材紋理細(xì)致緊密，是優(yōu)質(zhì)建筑和家具的材料。其莖皮纖維堅(jiān)韌，可用于造紙或替代麻[1]。

但椴樹種皮硬，不易透水，胚休眠和種子內(nèi)抑制物的存在造成椴樹種子發(fā)芽率很低、出苗不整齊[2~5]。自然界中蒙椴花雄蕊先熟，因而自花幾乎不育，異花授粉，結(jié)實(shí)率也較低，一般不超過10%。大部分果實(shí)無發(fā)育的種子，繁殖率極低，現(xiàn)在并未找到有效的快速擴(kuò)繁方式。植物組織培養(yǎng)快繁是短期內(nèi)解決種苗數(shù)量限制的有效途徑之一，但在植物組織培養(yǎng)的過程中常出現(xiàn)褐化以及玻璃化現(xiàn)象[7-8]。褐化和玻璃化現(xiàn)象是在繼代過程中常見的問題，嚴(yán)重影響組培快繁的成功率。為優(yōu)化蒙椴組織培養(yǎng)的快繁體系，本研究選用蒙椴腋芽為外植體進(jìn)行了腋芽增殖途徑的組培研究，對不同基本培養(yǎng)基種類及激素條件、pH值、繼代周期對蒙椴繼代繁殖系數(shù)的影響進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為引自承德豐寧縣實(shí)生蒙椴幼樹，栽植于豐寧縣苗圃。試驗(yàn)中MS、WPM、DKW作為基本培養(yǎng)基，藥品均為國藥公司生產(chǎn)。

培養(yǎng)條件：溫度24℃，光照時(shí)間15h/d，光照強(qiáng)度2000lx，室內(nèi)相對濕度30%左右。接種培養(yǎng)30d后，觀察腋芽生長狀況。以下試驗(yàn)條件均與此相同。

1.2 方法

1.2.1 組織培養(yǎng)初代外植體的獲得

春季5~6月份，采集實(shí)生苗1a生新梢，用清水沖洗干凈，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50~60s，用無菌水洗滌3次，然后用20倍84消毒液搖床上振蕩消毒15~20min。無菌水沖洗20~30min后，再用無菌水洗滌3次。

1.2.2 初代誘導(dǎo)階段基本培養(yǎng)基的篩選

采用MS、DKW和WPM作為基本培養(yǎng)基，分別加入BA 2.0mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH值調(diào)為6.0。每處理重復(fù)10瓶，每瓶內(nèi)接種10個(gè)帶腋芽的莖段。接種培養(yǎng)30d后，觀察腋芽生長狀況。

1.2.3 增殖階段激素組合的篩選

將誘導(dǎo)伸長的腋芽接種到含不同濃度BA（0、0.05、0.1、0.2mg/L）和NAA（0.01、0.02、0.05mg/L）組合的WPM培養(yǎng)基上，共12個(gè)處理；在確定激素組合后，附加不同濃度的GA3（0、1.0、2.0mg/L），觀察分化芽生長情況。

1.2.4 繼代周期的選擇

長勢良好的無菌苗作為試驗(yàn)材料，切除無菌苗的基部以及葉片，之后將無菌苗切分為帶有1~2個(gè)腋芽的莖段。然后將帶有腋芽的莖段轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的繼代培養(yǎng)基中，在LED燈光照射下進(jìn)行培養(yǎng)。每培養(yǎng)瓶中放入5個(gè)莖段，每試驗(yàn)處理共50個(gè)莖段，3次重復(fù)。30d后觀察莖段的長勢，并統(tǒng)計(jì)節(jié)間距、腋芽數(shù)和植株?duì)顟B(tài)等。各試驗(yàn)處理的對照培養(yǎng)條件（CK）為：繼代周期40d；光照條件1500lx；培養(yǎng)基WPM添加BA 0.2mg/L、IBA 0.04mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L。繼代周期的調(diào)整：將培養(yǎng)40d的組培苗，切分后按照3個(gè)不同繼代周期進(jìn)行接種培養(yǎng)，分別為25、30、35d，比較不同繼代周期對下一繼代腋芽萌發(fā)及生長狀態(tài)的影響。

1.2.5 增殖階段培養(yǎng)基pH值的調(diào)整

將增殖培養(yǎng)基（WPM+BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂6.0g/L）的pH值分別調(diào)節(jié)為5.6、5.8、6.0、6.2，共4個(gè)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對蒙椴腋芽誘導(dǎo)的影響

經(jīng)消毒滅菌處理后的外植體接種在MS、DKW、WPM（附加BA 2.0mg/L、NAA 0.01mg/L）3種不同元素含量的基本培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)結(jié)果如表1。不同基本培養(yǎng)基雖然都能誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，但誘導(dǎo)情況差異很大。其中WPM基本培養(yǎng)基外植體5～7d芽苞開始膨大，個(gè)別開始抽出葉片，長勢良好，啟動率較快；而MS和DKW基本培養(yǎng)基經(jīng)過25d左右腋芽才開始有變化，部分芽一直處于膨大狀態(tài)，不再進(jìn)一步發(fā)育。經(jīng)多重比較，3種培養(yǎng)基的萌芽率差異顯著，WPM培養(yǎng)基的萌芽率極顯著高于其他基本培養(yǎng)基，這表明基本培養(yǎng)基對蒙椴初代培養(yǎng)具有一定的影響，WPM可作為誘導(dǎo)蒙椴腋芽萌發(fā)的啟動培養(yǎng)基。

2.2 植物激素濃度對蒙椴腋芽增殖的影響

將誘導(dǎo)伸長的腋芽剪成莖段，分別轉(zhuǎn)入不同的增殖培養(yǎng)基中，30d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查，試驗(yàn)結(jié)果見表2。不同濃度的激素組合對蒙椴腋芽增殖系數(shù)具有顯著影響。在各處理中，BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L的腋芽增殖系數(shù)最高，其增殖系數(shù)為4.85，葉片數(shù)量多、濃綠。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，添加了BA和NAA的激素組合，雖然提高了增殖效果，但是蒙椴組培苗莖矮小、節(jié)間比較短，莖纖細(xì)。為此在試驗(yàn)中添加了GA3來促進(jìn)已分化的腋芽伸長生長，結(jié)果表明：不同濃度的GA3對蒙椴腋芽伸長生長有一定的作用，隨著濃度的提高，苗高增長明顯、葉子數(shù)量增多，當(dāng)GA3濃度為2.0mg/L時(shí)，苗高達(dá)7.8cm，比不添加GA3的高34.5%（表3）。

表1 基本培養(yǎng)基對腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

表2 蒙椴莖尖在添加不同濃度的6-BA、NAA培養(yǎng)基中的增殖情況

表3 蒙椴莖尖在不同濃度的BA、ZT培養(yǎng)基中的增殖情況

2.3 繼代周期對蒙椴組培繼代繁殖的影響

蒙椴組培苗在繼代培養(yǎng)后，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了4個(gè)不同繼代周期對蒙椴繼代苗繁殖系數(shù)、生長狀態(tài)的影響（表4）。觀察發(fā)現(xiàn)繼代周期25d時(shí)，莖段基部無褐化，繼代腋芽萌發(fā)率達(dá)89.12%，繁殖系數(shù)達(dá)2.72；繼代周期30d時(shí)，基部無褐化但有輕度玻璃化現(xiàn)象，繼代腋芽萌發(fā)率達(dá)91.24%，繁殖系數(shù)達(dá)6.38；繼代周期35d時(shí)，基部出現(xiàn)輕度褐化和輕度玻璃化現(xiàn)象，繼代萌發(fā)率達(dá)79.06%，繁殖系數(shù)達(dá)4.58；繼代周期40d時(shí)（CK），基部褐化嚴(yán)重且伴有重度玻璃化現(xiàn)象，繼代萌發(fā)率達(dá)64.17%，2周期繁殖系數(shù)達(dá)3.02。從表4中數(shù)據(jù)可以看出：縮短繼代時(shí)間可以有效防止蒙椴繼代苗褐化和玻璃化現(xiàn)象，提高萌發(fā)率。其中，30d和35d繼代周期下的繁殖系數(shù)分別是對照的2.11倍和1.52倍，通過提高腋芽萌發(fā)率顯著提高了繁殖系數(shù)。25d繼代周期下的繼代苗雖然萌發(fā)率較高，且基部無褐化，但由于生長期太短、腋芽數(shù)少，繁殖系數(shù)較低。

表4 繼代周期對蒙椴組培繼代繁殖的影響

2.4 pH值對蒙椴增殖的影響

蒙椴幼苗喜歡微酸性的土壤，所以在組培過程中，對培養(yǎng)基pH值也進(jìn)行了調(diào)整。研究發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基的pH值對蒙椴腋芽增殖系數(shù)的影響顯著（表5）。在各處理之間，增殖系數(shù)差異顯著。培養(yǎng)基pH值為5.6的腋芽增殖系數(shù)最低，為1.5；pH值為5.8的處理次之，增殖系數(shù)為2.3；當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6.0時(shí)，腋芽增殖系數(shù)最高，為5.4；pH值為6.2時(shí)，增殖系數(shù)下降，為4.3。培養(yǎng)基pH值為6.0處理的增殖系數(shù)是pH值為5.6處理的3.6倍。從生長狀態(tài)上來看，當(dāng)培養(yǎng)基pH值在6.0～6.2之間時(shí)，生長情況良好，新增生的腋芽比較健壯，葉片較大。當(dāng)pH值為5.6時(shí)，培養(yǎng)基呈酸性，幼芽長得比較細(xì)弱，增殖系數(shù)明顯下降。因此，在蒙椴腋芽增殖培養(yǎng)中，pH6.0～6.2的微酸性培養(yǎng)基更適合腋芽的增殖培養(yǎng)。

表5 pH值對蒙椴腋芽分化的影響

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蒙椴在誘導(dǎo)階段不同的基本培養(yǎng)基影響很大，WPM培養(yǎng)基比較適合蒙椴的誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)階段對BA與NAA的適量范圍相對較寬，一般都能誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)；在增殖階段，增殖系數(shù)隨著BA濃度的增加而提高，NAA濃度為0.05mg/L時(shí)，其增值系數(shù)較低，分化情況不好，植株生長遲緩。BA與NAA的適量配合使用才能夠達(dá)到誘導(dǎo)腋芽分化的目的。本試驗(yàn)表明：WPM培養(yǎng)基附加BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+GA32.0mg/L的配比的外植體分化最好。由于蒙椴生性屬于較耐蔭樹種，喜微酸性土壤，根據(jù)這樣的特性，蒙椴腋芽離體快繁在偏酸性的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果好，這也符合蒙椴的生長特性。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒙椴在當(dāng)?shù)貧夂?月份間，枝條抽葉進(jìn)入了加快的階段，植物體內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)比較活躍，而且枝條還沒有進(jìn)入木質(zhì)化階段，這個(gè)時(shí)期接種進(jìn)行組織培養(yǎng)是最合適的。植物激素組合不同配比對植物組織培養(yǎng)增殖效果有很大不同[10-14]。本研究中，添加細(xì)胞分裂素與生長素的濃度與比例在不同品種椴樹中并不相同，可能與樹種差異有關(guān)。細(xì)胞分裂素與生長素比例不適合，外植體不分化，腋芽有輕微膨脹的現(xiàn)象，且長時(shí)間不會發(fā)生進(jìn)一步的變化，說明生長素與細(xì)胞分裂素的配合使用是必要的。