羅漢果咀嚼片制備工藝的優(yōu)化及抑菌活性研究

何怡，劉翰飛，林冰，岳靜，周英，張俊連

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州中醫(yī)藥大學，貴州貴陽550025；3.貴州德江易盛農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，貴州銅仁554300）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生草質藤本植物羅漢果的干燥成熟果實，為中國特有的藥食同源植物，中醫(yī)上認為其具有清熱潤肺，利咽開音，滑腸通便等效用[1]。羅漢果主要分布于兩廣、貴州、江西、湖南等地區(qū)[2]。羅漢果含有大量的黃酮類，酚酸和萜類以及碳水化合物，蛋白質，氨基酸和維生素成分[3-5]。除在中國藥典中公布的藥用特性外，國內(nèi)外研究人員還研究了羅漢果及其提取物的其他作用，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除，抗炎和抗癌活性，抗疲勞，免疫調節(jié)，以及血脂代謝的調節(jié)以及血脂代謝的調節(jié)血糖代謝的改善[6-15]。羅漢果苷V 是一種葫蘆烷三萜皂苷，是羅漢果的主要生物活性成分[16]。咀嚼片是一種實用且方便有效的片劑形式。經(jīng)嚼碎后，藥片的表面積增大，可促進藥物在人體內(nèi)的代謝吸收。制成咀嚼片可使一些難崩解的藥物加速崩解，提高藥物的療效[17]。

本研究以羅漢果浸膏為主藥，添加適當?shù)妮o料，研制出口感爽口、食用方便的羅漢果咀嚼片，并建立了羅漢果皂苷V 的含量測定方法，對其抑菌活性進行了研究，為羅漢果等藥食同源藥物的開發(fā)和利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅漢果由貴州德江易盛農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為羅漢果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang]的干燥果實；羅漢果皂苷V 標準品：四川維克奇生物科技有限公司，純度≥98 %；淀粉、微晶纖維素鈉、甘露醇、無水檸檬酸、硬脂酸鎂：河南亞統(tǒng)食品原料有限公司；蒸餾水；甲醇、乙腈為色譜純：Fisher 公司；水：娃哈哈純凈水；金黃色葡萄球菌（BNCC 186335）；銅綠假單胞桿菌（CMCC 10104）；枯草芽孢桿菌（CMCC 63501）；移液槍及配套槍頭：大龍；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂：上海博微生物科技有限公司；MH 瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：杭州百思生物技術公司；抗生素藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司。

RE-52CS 旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；藥檢篩：上虞市瑞志儀器廠；DGG-8501A 型電熱恒溫干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；5T 油壓式壓片機：鶴壁市鑫利煤質儀器有限公司；FA2004 型電子天平：上海象平儀器儀表有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠；KH-500DE 型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PTF-DR 全自動脆碎度測定儀：德國Pharma-test 公司；1260 型自動進樣高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；HWS-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZWYR-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；30KBS 高壓滅菌鍋：上海中安醫(yī)療器械廠；WH-2 微型渦旋混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 工藝流程

羅漢果→干燥（30 min）→粉碎→水浴提取→抽濾→濃縮→羅漢果浸膏（+輔料）→混合干燥（60 ℃，30 min）→研磨→過篩（200 目）→（+硬脂酸鎂）→壓片

1.3 操作要點

1.3.1 羅漢果浸膏的制備

稱取羅漢果粉末10 g，置于500 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，置于70 ℃恒溫水浴鍋上加熱提取120 min，過濾得濾液，減壓旋干得浸膏，稱量得浸膏總質量為4.881 g，得膏率為48.81%。

1.3.2 混合干燥

羅漢果浸膏易吸水，加入輔料后需干燥，置于60 ℃烘箱中，干燥30 min，然后再研磨過篩。

1.3.4 壓片

加硬脂酸鎂作為潤滑劑，控制壓片壓力在5 kN。

1.4 羅漢果咀嚼片配方的研究

本研究以羅漢果浸膏為主藥，選用淀粉、微晶纖維素、甘露醇、檸檬酸、硬脂酸鎂等輔料，進行羅漢果咀嚼片的制備。因羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇的添加量對咀嚼片口感的影響較大，進行單因素、正交試驗，以得到其最佳制備配方。淀粉和微晶纖維素的添加量則根據(jù)羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇的添加量而調整比例。

1.4.1 單因素試驗

1.4.1.1 羅漢果浸膏的考察

羅漢果浸膏的比例會對整個咀嚼片的風味影響較大。因此，針對羅漢果浸膏添加量的單因素試驗，設計25%、20%、15%、10%、5%羅漢果浸膏添加量進行單因素考察。

1.4.1.2 檸檬酸的考察

采用甘露醇、淀粉、檸檬酸、微晶纖維素鈉等輔料，考慮到檸檬酸對口味影響較大，因此設計0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%檸檬酸含量進行單因素試驗。

1.4.1.3 甘露醇的考察

羅漢果雖具有它特有的味道，甘露醇可以增加其清爽的口感，因此設計甘露醇含量5%、10%、15%、20%、25%進行單因素試驗。

1.4.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取考察因素為羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇，每個因素3 個水平。設計正交試驗表，表1 為因素水平。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing theformulation

1.5 質量控制與評價

根據(jù)《中國藥典》2015 版對于咀嚼片的質量標準檢測方法，對羅漢果咀嚼片的片重差異、脆碎度、微生物指標、感官評價，羅漢果皂苷V 含量等指標進行檢測。

1.6 感官評價

根據(jù)片劑感官評分，包括外觀（20 分）、風味（40分）、質地（20 分）、口感（20 分），將每一項目分為 3 個等級進行打分。每一項目的等級以及分值都進行合理設計，得出感官評分標準設計表，見表8[18]。評分滿分為100 分，由10 人組成評鑒小組，以感官評價法進行評分，以平均分計算。

表2 羅漢果感官評分標準設計表Table 2 Sensory evaluation standards of mogroside chewing tablets

1.7 羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V 的含量測定

1.7.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 ∶水=21 ∶79 體積比；檢測波長：203 nm；流速：1 mL/min；進樣量：8 μL；柱溫：30 ℃。

1.7.2 標準品溶液

精密稱取10 mg 羅漢果皂苷V 標準品，置25 mL容量瓶中，加入適量流動相，振搖溶解，并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.4 mg/mL 標準品溶液。

1.7.3 供試品溶液

按照“1.2”項下制備得羅漢果咀嚼片，研磨成粉末，精密稱取0.5 g 置于10 mL 容量瓶中，加入適量流動相，超聲（150 W，40 kHz）15 min，定容至刻度，搖勻并用0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。

1.7.4 系統(tǒng)適用性試驗

對照品溶液和供試品溶液，按“1.7.1”項下色譜條件進樣色譜分析，測得羅漢果皂苷V 對照品、供試品峰面積，計算其理論塔板數(shù)（n）。

1.7.5 線性關系的考察

按照“1.7.2”項下，配制濃度為0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 mg/mL 羅漢果皂苷 V 標準品溶液，按“1.7.1”項下的色譜條件進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定記錄峰面積。以羅漢果皂苷 V 濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。

1.7.6 精密性試驗

羅漢果皂苷V 對照品溶液，按“1.7.1”項下連續(xù)重復進樣6 次，測定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.7.7 重復性試驗

精密稱取0.5 g 同一批羅漢果咀嚼片粉末共6 份，按“1.7.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.7.1”項下方法測定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計算RSD。

1.7.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“1.7.1”項下方法2 h 進樣一次，共6 次，測定羅漢果皂苷V 色譜峰面積。計算RSD。

1.7.9 加標回收試驗

精密稱取已知含量的羅漢果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.3”項下方法制備供試品溶液，分別加入適量羅漢果皂苷V 對照品，稀釋后按“1.7.1”項下方法測定峰面積，計算加樣回收率。

1.7.10 羅漢果皂苷V 含量測定

分別稱取三批咀嚼片各0.5 g 按照“1.7.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.7.1”項下的色譜條件測定，記錄峰面積，計算羅漢果皂苷V 的含量。

1.8 抑菌活性研究

1.8.1 菌懸液的制備

將供試菌株分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h 活化，待用。使用時，挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中搖動24 h。取100 μL 菌懸液逐倍稀釋后涂布到平板上，培養(yǎng)后統(tǒng)計菌落數(shù)，按照稀釋的倍數(shù)與接種量計算含菌量（平板菌落計數(shù)法）。使用時，將菌懸液的濃度調為1×107CFU/mL，放4 ℃冰箱備用。

1.8.2 供試液的制備

稱取50 mg 羅漢果咀嚼片粉末置于10 mL 塑料EP 管中，加入5 mL 水溶解，滅菌備用。

1.8.3 濾紙片法測定抗菌活性

向培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基，凝固后加入100 μL菌液（濃度調整為1×107CFU/mL），均勻涂布。將浸有供試液、鏈霉素（陽性對照）或水的濾紙片（直徑6 mm）置于涂菌平板上，平行3 次，靜置5 min。培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，用游標卡尺測量抑菌圈大小。

抑菌圈直徑（mm）=測量值（mm）-濾紙片直徑（mm）

2 結果與分析

2.1 羅漢果咀嚼片配方單因素試驗結果

2.1.1 羅漢果浸膏的考察

以感官評分為指標考察羅漢果浸膏的影響，結果如圖1。

圖1 羅漢果浸膏添加量對羅漢果咀嚼片感官評價的影響Fig.1 Effect of amount of mogroside extract on sensory quality of mogroside chewable tablets

由圖1 可知，咀嚼片中羅漢果浸膏添加量為15%時感官評分最高，故選擇羅漢果浸膏15%的添加量制備咀嚼片。

2.1.2 檸檬酸考察

以感官評分為指標考察檸檬酸的影響，結果如圖2。

圖2 檸檬酸添加量對羅漢果咀嚼片感官評價的影響Fig.2 Effects of amount of citric acid on sensory quality of mogroside chewing tablets

由圖2 可知，咀嚼片中檸檬酸添加量為0.5%時感官評分最高，故選擇檸檬酸0.5%的添加量制備咀嚼片。

2.1.3 甘露醇的考察

以感官評分為指標考察甘露醇的影響，結果如圖3。

圖3 甘露醇添加量對羅漢果咀嚼片感官評價的影響Fig.3 Effects of amount of mannitol on sensory quality of mogroside chewing tablets

由圖3 可知，甘露醇添加量為20%時感官評分最高，故選擇甘露醇20%的添加量制備咀嚼片。

2.2 正交試驗結果

以感官評價為指標，正交試驗結果如表3。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

由表3 的極差R 可以說明，對羅漢果咀嚼片影響的主次關系為羅漢果浸膏＞甘露醇＞檸檬酸，其最佳組合是A2B2C2，即羅漢果浸膏為15%，檸檬酸為0.5%，甘露醇為20%。

2.3 質量控制與評價結果

2.3.1 外觀性狀

羅漢果咀嚼片表面色澤均勻、無異物、無任何雜斑。

2.3.2 片重差異

測得羅漢果咀嚼片平均片重為0.258 6 g，片重范圍在 0.250 4 g～0.271 6 g，片重差異范圍-3.31%～4.81%，符合中國藥典規(guī)定。

2.3.3 脆碎度

所有咀嚼片均未檢出斷裂、龜裂及粉碎的片劑，且咀嚼片減失質量為0.005 4 g，為0.83%，符合中國藥典規(guī)定。

2.3.4 微生物指標

咀嚼片中的細菌總數(shù)≤750 CFU/g；大腸菌群≤30 MPN/100 g；霉菌≤25 CFU/g；酵母菌≤25 CFU/g；致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌），不得檢出。

2.3.5 感官評價結果

感官評定為10 人小組評定結果見表4。

從表4 感官評價結果可以看出，15%浸膏、33 %淀粉、25 %微晶纖維素、20 %甘露醇、0.5 %檸檬酸、1.5%硬脂酸鎂為最佳配方。

表4 感官評價結果Table 4 Results sensory evaluation

2.4 羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V的含量測定結果

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗

經(jīng)HPLC 測定羅漢果皂苷V 對照品、供試品圖譜如圖4。

圖4 羅漢果皂苷V 的HPLC 圖Fig.4 HPLC chromatograms of mogroside V standard

按“1.7.1”項下色譜條件分析，得羅漢果皂苷V 對照品、供試品色譜圖，計算得兩者理論塔板數(shù)均大于17 000。在該色譜條件下，樣品的分離較好。

2.4.2 線性關系的考察

以羅漢果皂苷V 濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算得回歸方程y=1 916.5x-5.96，R2=0.999 2，結果表明，羅漢果皂苷V 的含量在0.08 mg/mL～0.24 mg/mL 的范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.4.3 精密性試驗

羅漢果皂苷V 對照品溶液，按“1.7.1”項下連續(xù)重復進樣6 次，測定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計算RSD 為0.80%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 重復性試驗

精密稱取0.5 g 同一批粉末共6 份，按“1.7.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.7.1”項下方法測定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計算RSD 為0.82%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“1.7.1”項下色譜方法2 h進樣一次，共6 次，測定羅漢果皂苷V 色譜峰面積，計算RSD 為0.54%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加標回收試驗

精密稱取已知含量的羅漢果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.2”項下方法制備供試品溶液，分別加入適量羅漢果皂苷V 對照品，稀釋后按“1.7.1”項下方法測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表5。

表5 羅漢果皂苷V 的加標回收試驗Table 5 Additive recovery test of mogroside V sample

由表5 可知，羅漢果皂苷V 的平均加樣回收率為100.412 %，6 份樣品加樣回收率均在95 %～105 %之間，且RSD<5%，說明方法的準確度良好。

2.4.7 樣品含量測定結果

根據(jù)3 批樣品色譜峰面積，通過線性方程計算出其含量如表6。

表6 3 個批次羅漢果咀嚼片中的羅漢果皂苷V 含量Table 6 Results of determination of mogroside V content in three batches of mogroside chewing tablets

結果表明，羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V 含量為3.744 mg/g。

2.5 抑菌活性研究結果

通過羅漢果咀嚼片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌的抑菌活性試驗，測量其抑菌圈直徑，結果如表7 所示。

表7 羅漢果咀嚼片抑菌圈直徑Table 7 Diameter of inhibition zone of mogroside chewable tablets

由表7 可知，羅漢果咀嚼片對革蘭氏陽性菌敏感，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，對枯草芽孢桿菌次之，對銅綠假單包桿菌則無抑菌作用。因此，羅漢果咀嚼片具有一定的抑菌活性。

3 結論

本研究以羅漢果浸膏為主藥，選用適當?shù)妮o料，完成羅漢果咀嚼片的制備。進行單因素、正交試驗，得到其最佳制備配方為：浸膏15%、淀粉33%、微晶纖維素25 %、甘露醇20 %、檸檬酸 0.5 %、硬脂酸鎂1.5 %。按該配方制成的咀嚼片表面光滑，色澤均勻，具有羅漢果特有的香味且酸甜爽口。經(jīng)HPLC 測定，咀嚼片中羅漢果皂苷V 含量為3.744 mg/g。抑菌結果表明，羅漢果咀嚼片對革蘭氏陽性菌具有一定的敏感性，其中對金黃色葡萄球菌效果最好，對銅綠假單孢桿菌則無抑菌活性。本品配方合理，各項指標均符合藥典要求，含片質量穩(wěn)定，工藝可行，為羅漢果的開發(fā)提供了理論依據(jù)。