鹿皮膠的毒理安全性評價研究

孫琪瑤，康櫻櫻，王慶，沈明浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

鹿皮作為一種中藥，無毒，具有補氣補血、補腎等多種功效。因此，鹿皮常被用于開發(fā)鹿皮膠和各種營養(yǎng)保健品[1-4]。鹿皮膠是由梅花鹿或馬鹿的皮制成[5]，可治療潰瘍、婦女白帶、出血、腎虛滑精等各種疾病[6]。還具有增加白細(xì)胞的功能，能顯著提高動物的免疫功能，具有滋陰、潤燥、養(yǎng)血、止血的作用。其功效在《本草綱目》[7]和《四川中藥志》中均有記載。而現(xiàn)代郭駿騏[8]、楊麗等[9]對鹿皮膠的研究進(jìn)一步證實了鹿皮膠具有補血、增強(qiáng)免疫力的作用。目前，國內(nèi)對鹿皮膠的研究主要是從藥理角度進(jìn)行的，主要研究了其補血和免疫調(diào)節(jié)功能，以及能夠顯著提高血清睪酮的相關(guān)功能[10]。而關(guān)于是否還有其他功能，國內(nèi)外鮮有鹿皮膠功能研究的報道。

鹿皮膠作為食材的開發(fā)利用缺乏明確的毒理安全評價資料。在其大量使用之前還需要進(jìn)行更全面、更深入的研究。因此我們對鹿皮膠進(jìn)行了急性毒性實驗、亞慢性毒性實驗、骨髓細(xì)胞微核實驗、精子畸形實驗和Ames 試驗等毒理學(xué)試驗[11]，以初步了解鹿皮膠是否具有食用安全性，這對鹿皮膠產(chǎn)品的日后開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鹿皮膠：吉林海王健康生物科技有限公司；頂層培養(yǎng)基、底層培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基：北京譜析科技有限公司；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi-murium）（組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 菌株）：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所；環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；苦味酸、伊紅染色液：南京建成生物工程研究所；氯化鈉、甘油、無水乙醇；濃鹽酸：北京化工廠；小牛血清：Dr.Ehrenstorfer 公司；吉姆薩應(yīng)用液、敵克松（Dexon）、1，8-二羥基蒽醌（1，8-HAQ）：Dr.Ehrenstorfer 公司；疊氮鈉（NaN3）：Solarbio 公司；2-氨基芴（2-AF）：Lancaster 公司；大鼠代謝活化酶（S9）：Moltox 公司。

1.2 主要儀器

DHG-9140A 電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：杭州藍(lán)天儀器有限公司；CCT-3320 超純水機(jī)：四川卓越水處理設(shè)備有限公司；DS-671 電子秤：上海寺岡電子有限公司；CM1900 冷凍切片機(jī)、XSZ-7G 細(xì)胞計數(shù)器、XS212-202雙目生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；BS-180 全自動生化分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；OLYMPUS CX21 生物顯微鏡：日本日立公司；NikonE2000 型光學(xué)顯微鏡：Nikon 公司。

1.3 實驗動物

昆明種小白鼠：遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，SPF 級，體重約 18 g～22 g，4 周齡～6 周齡，使用許可證號：SCXK（遼）2015-0003。

1.4 方法

1.4.1 小鼠急性毒性實驗

1.4.1.1 預(yù)試驗

根據(jù)經(jīng)驗和文獻(xiàn)尋找動物100%、0%死亡劑量。在試驗前，取60 只健康小鼠單純禁食16 h。將小鼠隨機(jī)分為6 個劑量組，每組10 只。標(biāo)記小鼠并精確稱重。鹿皮膠樣品分設(shè)6 個梯度劑量，灌胃給藥量為0.2 mL/10 g，以確定引起動物 0%（Dn）和 100%（Dm）死亡的劑量。觀察2 周，記錄小鼠中毒和死亡情況，為正式試驗提供參考。

1.4.1.2 正式試驗

根據(jù)相關(guān)要求，應(yīng)用寇氏（Korbor）法[12]進(jìn)行小鼠急性毒性正式試驗。選取70 只健康小鼠，雌雄各半。將小鼠隨機(jī)分為6 個劑量組和空白對照組。標(biāo)記小鼠并精確稱重。根據(jù)初步試驗得到的劑量結(jié)果，計算出6 個劑量組：15.0、12.5、10.0、7.5、5.0、2.5 g/kg 。配置所需濃度，一次性分別灌胃給予鹿皮膠提取物，采用兩次等容灌胃給藥，給藥體積為0.2 mL/10 g，對照組灌胃給予生理鹽水。觀察給藥后反應(yīng)，記錄14 d 動物毒性反應(yīng)及死亡情況。死亡動物及時尸檢，觀察各器官的變化。

1.4.2 小鼠亞慢性毒性實驗

參照三七的經(jīng)口急性毒性及亞慢性毒性研究[13]實驗方法，將80 只小鼠隨機(jī)分為4 組：每組20 只，雌雄各半，分別為實驗組1～3 組，即高、中、低劑量組和第4 組空白對照組。實驗組分別以人體攝入量的100、50倍和10 倍劑量灌胃。鹿皮膠樣品的劑量分別為10.0、5.0、1.0 g/kg?？瞻捉M每天定期給小鼠9 g/L 生理鹽水。每組連續(xù)喂養(yǎng)30 d 后剖殺采樣，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.4.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗

將50 只昆明小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，雌雄各半。鹿皮膠的3 種劑量分別為10.0、5.0、2.5 g/kg 劑量組，以經(jīng)口灌胃方式給予受試物X。采用4 次染毒方法，各組小鼠在最后一次給藥后第2 天處死。每只小鼠計數(shù)200 個嗜多染紅細(xì)胞，并對成熟紅細(xì)胞計數(shù)，計算骨髓嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocytes，PCE）與成熟紅細(xì)胞（mature erythrocyte，NCE）比值。每只小鼠通過計數(shù)1 000 個嗜多染紅細(xì)胞的方法進(jìn)行評估，計算微核發(fā)生率（‰）：

嗜多染紅細(xì)胞微核率/‰=含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)×1 000。

1.4.4 小鼠精子畸形實驗

參照靈芝功能性食品遺傳毒理學(xué)實驗[14]，鹿皮膠樣品的3 個劑量分別為10.0、5.0、2.5 g/kg （分別是人體攝入量的 100、50、25 倍）劑量組，然后以 0.02 mL/g體積對動物進(jìn)行灌胃，陰性對照組給予同樣體積的純水，陽性對照組給予同樣體積的2 mg/mL 環(huán)磷酰胺溶液。連續(xù)5 d，每天給藥一次。最后一次給藥后的第30 天處死動物，取副睪丸的精子涂片，甲醇固定，伊紅染色。計數(shù)1 000 個精子，并計算精子畸形發(fā)生率：

精子畸形發(fā)生率/%=精子畸形總數(shù)/檢查精子總數(shù)×100

1.4.5 Ames 試驗

鹿皮膠樣品在0.103 MPa 下高溫滅菌20 min，無菌條件下用無菌蒸餾水稀釋。將樣品制成如下5 個劑量組，分別為 5 000、1 000、200、40、8 μg/皿。陰性對照組蒸餾水用量為0.1 mL/皿。陽性對照組試劑采用敵克松、疊氮鈉、2-氨基芴和1，8-二羥蒽醌，在加與不加S9 混合物狀況下，試驗均采用平板摻入法進(jìn)行。制備頂層培養(yǎng)基，并分裝于無菌小試管內(nèi)2 mL，在45 ℃水浴中保溫。依次加入0.1 mL 新鮮菌液，混勻，加0.1 mL受試物，混勻?？焖俚谷氲撞颗囵B(yǎng)基中，旋轉(zhuǎn)平皿，平放固化，37 ℃培養(yǎng)48 h。每個劑量做3 個平行皿，陽性試驗結(jié)果做3 次測試，陰性試驗結(jié)果做兩次測試。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性實驗結(jié)果

2.1.1 小鼠急性毒性癥狀及死亡情況

鹿皮膠樣品急性毒性實驗死亡動物數(shù)見表1。

表1 鹿皮膠樣品急性毒性實驗死亡動物數(shù)Table 1 Number of dead animals in acute toxicity test of deer hide glue samples

試驗觀察期間，對照組和劑量組小鼠均處于良好狀態(tài)，無明顯不良反應(yīng)和死亡情況。飼養(yǎng)結(jié)束后，解剖小鼠，肉眼觀察各器官無病變情況。由表1 可知，鹿皮膠樣品劑量為15.00 g/kg 時，動物未出現(xiàn)死亡，說明鹿皮膠樣品的經(jīng)口急性毒性LD50＞10.00 g/kg，可知鹿皮膠樣品屬于無毒物質(zhì)。

2.1.2 小鼠體重變化情況

對小鼠給藥后，觀察藥物對小鼠的體重質(zhì)量的變化情況見表2。

表2 給藥后小鼠體重質(zhì)量變化Table 2 Changes of body mass in mice after administration

如表2 所示，小鼠體重變化情況在小鼠急性毒性實驗中，各組小鼠的初始體重相近，2 周后，空白組體重增加顯著。說明正常情況下，實驗動物體重應(yīng)持續(xù)增加。劑量組和對照組的雄、雌小鼠的初始體重、7、14 d 體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明灌胃劑量對小鼠體重影響并不明顯。

2.1.3 小鼠主要臟器指數(shù)變化情況

臟器指數(shù)是實驗動物的臟器重量與其自身體重的比值，評價器官和組織狀態(tài)的重要指標(biāo)。產(chǎn)生致敏t 細(xì)胞和漿細(xì)胞。鹿皮膠樣品對小鼠臟器指數(shù)的影響分析見表3。

由表3 可知，空白對照組無明顯異常，雄雌劑量組與空白對照組的心、肝、腎、脾進(jìn)行比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 給藥后小鼠臟器指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effect of administration on organ index in mice（，n=10）

表3 給藥后小鼠臟器指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effect of administration on organ index in mice（，n=10）

注：-表示空白對照組。

性別劑量/（g/kg）臟器指數(shù)/%心肝脾肺腎雌性 15.0 0.46±0.16 4.25±1.03 0.33±0.03 0.68±0.14 1.25±0.16 12.5 0.54±0.09 4.17±1.24 0.36±0.02 0.62±0.15 1.33±0.08 10.0 0.46±0.05 4.04±2.93 0.39±0.06 0.66±0.03 1.29±0.11 7.5 0.49±0.04 4.21±1.59 0.36±0.08 0.76±0.08 1.34±0.06 5.0 0.46±0.13 4.16±0.52 0.32±0.01 0.65±0.44 1.26±0.09 2.5 0.45±0.06 4.12±1.81 0.29±0.12 0.65±0.67 1.15±0.09-0.51±0.06 4.09±0.54 0.35±0.05 0.72±0.28 1.44±0.04雄性 15.0 0.44±0.04 3.98±0.43 0.31±0.04 0.62±0.61 1.57±0.03 12.5 0.45±0.04 3.94±0.78 0.35±0.04 0.71±0.30 1.43±0.05 10.0 0.56±0.09 3.86±0.68 0.29±0.08 0.70±0.05 1.49±0.09 7.5 0.52±0.07 4.10±0.21 0.34±0.02 0.73±0.21 1.55±0.04 5.0 0.49±0.03 4.03±1.15 0.30±0.08 0.64±0.18 1.49±0.09 2.5 0.52±0.05 4.15±0.54 0.29±0.04 0.60±0.24 1.40±0.07-0.42±0.02 3.75±0.33 0.27±0.04 0.78±0.15 1.43±0.06

2.2 小鼠亞慢性毒性實驗結(jié)果

2.2.1 鹿皮膠樣品對小鼠體重的影響

對小鼠給藥30 d 后，觀察藥物對小鼠的體重質(zhì)量的變化情況見表4。

與對照組相相比，3 個劑量組雌雄大鼠的初始體重、1 周～4 周體重和 30 d 體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.2 鹿皮膠樣品對小鼠食物利用率的影響

食物利用率是指實驗動物每食入100 g 飼料所增長的體重克數(shù)。對小鼠給藥30 d 后，觀察藥物對小鼠的食物利用率的影響情況見表5。

表4 鹿皮膠樣品對小鼠體重的影響（，n=10）Table 4 Effect of deer hide dlue on body weight of mice（，n=10）

表4 鹿皮膠樣品對小鼠體重的影響（，n=10）Table 4 Effect of deer hide dlue on body weight of mice（，n=10）

注：-表示空白對照組。

性別劑量/（g/kg）始重/g體重/g30 d/g第一周 第二周 第三周雄18.95±0.87 26.40±0.96 29.39±1.16 31.84±1.48 34.62±2.08 1.0 18.32±0.78 26.55±0.90 30.14±0.98 32.80±1.22 35.72±1.29 5.0 19.10±0.70 26.69±1.07 29.88±1.34 31.78±1.54 33.85±1.38 10.0 18.25±0.91 25.95±1.15 29.15±1.40 31.96±1.17 35.06±1.24雌-18.95±0.87 26.40±0.96 29.39±1.16 31.84±1.48 34.62±2.08 1.0 18.32±0.78 26.55±0.90 30.14±0.98 32.80±1.22 35.72±1.29 5.0 19.10±0.70 26.69±1.07 29.88±1.34 31.78±1.54 33.85±1.38 10.0 18.25±0.91 25.95±1.15 29.15±1.40 31.96±1.17 35.06±1.24-

表5 鹿皮膠樣品對小鼠食物利用率的影響（，n=10）Table 5 Effect of deer hide dlue on food utilization rate in mice（，n=10）

表5 鹿皮膠樣品對小鼠食物利用率的影響（，n=10）Table 5 Effect of deer hide dlue on food utilization rate in mice（，n=10）

性別 劑量/（g/kg） 總增重/g第一周食物利用率/% 第二周食物利用率/% 第三周食物利用率/% 第四周食物利用率/% 總食物利用率/%雄- 12.25±6.76 57.31±4.34 44.33±4.81 36.12±4.61 29.48±3.43 38.85±3.19 1.0 16.90±1.70 55.78±5.23 40.38±5.30 36.63±4.19 30.71±4.34 38.03±3.08 5.0 16.80±2.13 55.02±5.47 44.17±4.60 34.30±2.48 29.52±4.40 37.80±2.00 10.0 13.50±5.33 57.14±4.65 45.60±3.02 37.69±5.89 30.15±5.38 39.38±4.04

續(xù)表5 鹿皮膠樣品對小鼠食物利用率的影響（，n=10）Continue table 5 Effect of deer hide glue on food utilization rate in mice（，n=10）

續(xù)表5 鹿皮膠樣品對小鼠食物利用率的影響（，n=10）Continue table 5 Effect of deer hide glue on food utilization rate in mice（，n=10）

注：-表示空白對照組。

性別 劑量/（g/kg） 總增重/g第一周食物利用率/% 第二周食物利用率/% 第三周食物利用率/% 第四周食物利用率/% 總食物利用率/%雌- 12.25±6.76 53.12±3.95 29.68±3.10 17.61±2.51 14.29±3.99 25.35±1.74 1.0 16.90±1.70 50.52±4.35 26.61±5.70 20.21±5.29 14.43±2.74 24.49±2.55 5.0 16.80±2.13 50.16±5.01 24.92±7.55 18.50±3.48 12.55±3.12 23.27±2.79 10.0 13.50±5.33 47.80±6.08 25.55±6.57 18.39±4.51 13.44±4.32 23.26±3.13

與對照組比較，3 個劑量組雄性和雌性大鼠每周食物利用率和總食物利用率無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3 鹿皮膠對小鼠臟器系數(shù)的影響

肉眼觀察各組被剖殺的小鼠的主要臟器，觀察是否出現(xiàn)病理變化。測定小鼠肝、脾、腎等主要器官的絕對重量，得出其臟器系數(shù)見表6。其中結(jié)果表明，各實驗組臟器系數(shù)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組測得的臟器系數(shù)均正常，由此可說明鹿皮膠樣品對小鼠的臟器系數(shù)無不良影響。

2.2.4 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)數(shù)據(jù)對于評估藥物對實驗動物的器官功能或損傷改變情況起著決定性或提示性作用。對小鼠給藥30 d 后，觀察藥物對小鼠的血液生化指標(biāo)的影響見表7。與對照組比較，3 個劑量組雄性和雌性大鼠的血液學(xué)指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 鹿皮膠對小鼠臟器系數(shù)的影響（，n=10）Table 6 Effect of deer hide glue on visceral coefficient in mice（，n=10）

表6 鹿皮膠對小鼠臟器系數(shù)的影響（，n=10）Table 6 Effect of deer hide glue on visceral coefficient in mice（，n=10）

注：-表示空白對照組。

性別劑量/（g/kg）臟器系數(shù)/%肝脾腎雄- 5.43±0.15 0.31±0.04 1.09±0.10 1.0 4.72±0.09 0.32±0.03 1.13±0.07 5.0 5.58±0.16 0.30±0.04 1.11±0.08 10.0 5.34±0.14 0.31±0.06 1.08±0.11雌- 5.39±0.24 0.40±0.05 1.04±0.07 1.0 5.33±0.14 0.36±0.03 1.16±0.10 5.0 5.50±0.25 0.32±0.09 1.12±0.08 10.0 5.04±0.16 0.36±0.01 1.23±0.06

表7 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=5）Table 7 Effect of deer hide glue on blood biochemical indexes in mice（，n=5）

表7 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=5）Table 7 Effect of deer hide glue on blood biochemical indexes in mice（，n=5）

注：-表示空白對照組。

性別劑量/（g/kg）血紅蛋白/（g/L） 紅細(xì)胞計數(shù)/（1012/L） （109/L） 中性粒細(xì)胞/% 淋巴細(xì)胞/% 血小板數(shù)/（109/L）雄-121.20±12.40 9.01±0.84 6.95±0.80 13.46±2.32 69.71±2.41 168.93±2.32白細(xì)胞計數(shù)/1.0 125.60±12.70 8.61±1.08 5.97±0.52 12.52±4.53 52.25±4.50 170.60±1.73 5.0 125.33±10.80 9.16±0.90 7.70±0.88 11.67±1.62 60.07±3.36 169.13±5.41 10.0 127.50±11.22 9.38±1.96 8.53±0.96 13.23±3.32 66.77±1.41 167.11±2.30雌-120.20±9.40 8.93±0.54 8.13±0.81 12.75±3.57 72.23±2.40 149.65±5.75 1.0 125.00±4.60 9.10±1.09 9.26±0.52 11.31±3.07 81.82±3.52 150.82±3.85 5.0 133.67±7.83 9.31±0.90 8.50±0.77 13.21±1.41 75.30±3.90 145.73±1.42 10.0 126.67±12.19 8.65±0.96 7.62±0.57 13.41±1.62 69.70±4.20 142.72±5.51

2.2.5 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)檢驗結(jié)果見表8。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，與對照組相比，3 個劑量組的末期血生化指標(biāo)檢測結(jié)果中，雄鼠高劑量組總蛋白明顯升高（P＜0.05），其余指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.05）。上述測量值均在本研究的正常范圍內(nèi)。

2.2.6 病理學(xué)檢查

隨機(jī)解剖各組中的5 只小鼠，觀察藥物對小鼠內(nèi)臟器官的影響。如圖1～圖3 所示。肝、腎、脾的形態(tài)、顏色、質(zhì)地未見異常變化，組織病理學(xué)檢查未見明顯異常病理變化。由此可見，鹿皮膠樣品對小鼠內(nèi)臟器官無不良影響。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗結(jié)果

微核試驗用于檢測受試物在哺乳動物所引起的染色體或原紅細(xì)胞有絲分裂器損傷，以確定該受試物有無誘變性。對小鼠給藥30 d，觀察藥物對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率的影響結(jié)果見表9。由表9 可知，小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率在陽性對照物（環(huán)磷酰胺）中最高，與陰性對照組比較差異顯著（P＜0.01）。3 個受試物劑量組分別與相應(yīng)的陰性對照組的微核率（以0.1%表示）進(jìn)行比較，均無顯著性差異（P＞0.05），各個劑量組之間也無差異（P＞0.05）。在本試驗中，3 個劑量組鹿皮膠樣品的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果為陰性。

表8 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)檢驗結(jié)果（，n=5）Table 8 Testing results of blood biochemical indexes of mice with deer hide glue samples（，n=5）

表8 鹿皮膠樣品對小鼠血液生化指標(biāo)檢驗結(jié)果（，n=5）Table 8 Testing results of blood biochemical indexes of mice with deer hide glue samples（，n=5）

注：-表示空白對照組。

性別 劑量（g/kg） 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/（U/L）總蛋白/（g/L）雄- 18.10±2.64 128.00±22.78 5.71±0.64 84.40±19.70 1.13±0.19 47.81±4.78 5.51±0.38 54.86±2.21 10.0 19.90±5.57 119.60±20.17 5.74±0.70 95.10±15.20 1.17±0.12 46.08±3.75 5.32±0.44 54.45±2.06 5.0 20.40±5.40 133.10±21.26 5.53±0.45 93.70±20.80 1.08±0.23 44.78±3.05 5.22±0.39 55.10±2.69 1.0 24.70±7.07 140.30±22.81 5.73±0.81 91.80±16.40 1.11±0.15 45.86±6.37 5.33±0.70 55.88±2.64雌- 25.50±6.82 112.50±10.42 8.77±1.53 84.40±19.70 1.23±0.23 39.26±3.46 6.20±0.44 54.48±2.89 10.0 24.30±3.06 120.90±23.57 8.00±0.92 95.10±15.20 1.24±0.21 39.19±2.12 6.27±0.24 55.81±1.62 5.0 23.20±3.65 103.10±14.62 8.05±1.10 93.70±20.80 1.22±0.16 39.21±2.36 6.36±0.44 56.04±1.96 1.0 27.20±4.39 120.00±20.91 7.71±1.76 91.80±16.40 1.12±0.32 40.61±1.49 6.47±1.43 58.35±2.96谷草轉(zhuǎn)氨酶/（U/L）尿素氮/（mmol/L）堿性磷酸酶/（U/L）總膽固醇/（mmol/L）肌酐/（μmol/L）血糖/（mmol/L）

圖1 鹿皮膠對亞慢性毒性小鼠肝組織的病理組織學(xué)觀察Fig.1 Histopathological observation of deer hide glue on liver tissue of subchronic toxic mice

圖2 鹿皮膠對亞慢性毒性小鼠脾組織的病理組織學(xué)觀察Fig.2 Histopathological observation of deer hide glue on spleen tissue of subchronic toxic mice

圖3 鹿皮膠對亞慢性毒性小鼠腎組織的病理組織學(xué)觀察Fig.3 Histopathological observation of deer hide glue on kidney tissue of subchronic toxic mice

表9 受試物對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率的結(jié)果（，n=10）Table 9 The results of micronucleus incidence of bone marrow polychromatic erythrocyte in mice（，n=10）

表9 受試物對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率的結(jié)果（，n=10）Table 9 The results of micronucleus incidence of bone marrow polychromatic erythrocyte in mice（，n=10）

注：與陰性對照相比，*表示差異極顯著，P＜0.01；-表示空白對照組。

組別 劑量/（g/kg）受試細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)胞數(shù) 微核率/‰ PCE/NEC高劑量組 10.0 1 000 14 1.40±0.97 2.76/1中劑量組 5.0 1 000 11 1.10±0.88 2.93/1低劑量組 2.5 1 000 17 1.70±1.07 2.97/1陰性對照 - 1 000 13 1.30±1.16 3.01/1陽性對照 環(huán)磷酰胺 1 000 219* 21.9±7.62* 1.73/1*

2.4 小鼠精子畸形實驗結(jié)果

每只動物觀察到1 000 個完整的精子，精子畸形分為無定形、香蕉形、胖頭、無鉤、雙頭和雙尾，分別記錄畸形精子數(shù)見表10。各個樣品劑量組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照組與陰性對照組比較，有顯著差異（P<0.01）。不同劑量的小鼠精子畸形發(fā)生率無明顯變化，說明該樣品對小鼠精子畸形無影響。

表10 鹿皮膠樣品對小鼠精子畸變的影響（，n=5）Table 10 Effect of deer hide glue on sperm aberration in mice（，n=5）

表10 鹿皮膠樣品對小鼠精子畸變的影響（，n=5）Table 10 Effect of deer hide glue on sperm aberration in mice（，n=5）

注：與陰性對照相比，*表示差異極顯著，P<0.01，-表示空白對照組。

組別劑量/（g/kg） 觀察精子數(shù) 精子畸形數(shù) 畸形率/%陰性對照 - 1 000 74 1.48±0.23低劑量組 2.5 1 000 69 1.37±0.37中劑量組 5.0 1 000 89 1.78±0.29高劑量組 10.0 1 000 95 1.90±0.19陽性對照 環(huán)磷酰胺（40 mg/kg）1 000 335* 6.70±0.48*

2.5 Ames試驗結(jié)果

Ames 試驗結(jié)果是直接計數(shù)培養(yǎng)基上的突變菌落數(shù)，其檢測鹿皮膠的體外致突變性見表11 和表12。在背景生長良好的條件下，試驗組中的突變菌落數(shù)量增加一倍以上（即突變菌落數(shù)量等于或大于未處理菌落數(shù)量的2 倍）且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，或至少有一個測試點具有可重復(fù)性和顯著性差異，即認(rèn)為該受試物誘變試驗陽性。如表11 和12 所示，Ames 試驗的結(jié)果均顯示，與未處理對照組相比，鹿皮膠樣品的5 個不同劑量組（5 000、1 000、200、40、8 μg/皿）對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型 4 菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 有或無S-9 活化系統(tǒng)，其回變菌落數(shù)，均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2 倍，并且陽性對照組菌落數(shù)均超過未處理對照組的2 倍（P<0.01）。結(jié)果表明，在體外試驗中未發(fā)現(xiàn)致突變性。

表11 鹿皮膠樣品第一次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Table 11 First Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

表11 鹿皮膠樣品第一次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Table 11 First Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

注：與溶劑對照組比，*表示差異極顯著，P<0.01。

系統(tǒng) 組別 TA97 TA98 TA100 TA102非S-9 活化系統(tǒng) 未處理組 133.0±19.1 39.3±7.1 168.0±10.4 261.3±34.4陽性對照組 2254.7±405.2* 1050.0±133.5* 887.7±93.3* 1 183.3±127.3*5 000 μg/皿 128.0±13.7 35.0±5.0 159.3±21.9 262.7±18.0 1 000 μg/皿 120.3±23.5 40.3±11.0 150.0±20.2 246.0±10.8 200 μg/皿 114.3±20.8 38.0±9.5 146.0±31.5 250.0±4.4 40 μg/皿 131.0±25.1 35.7±6.7 159.7±15.8 261.0±16.1 8 μg/皿 120.0±23.6 34.3±4.0 168.3±23.9 266.0±24.1 S-9 活化系統(tǒng) 未處理組 121.0±16.4 41.7±10.7 165.3±12.7 279.9±24.0溶劑對照組 116.3±10.2 35.7±3.1 159.0±16.1 283.7±6.5陽性對照組 590.0±29.0* 394.3±46.2* 632.7±66.9* 710.0±77.5*5 000 μg/皿 117.0±23.3 38.0±14.8 149.7±12.7 301.0±37.7 1 000 μg/皿 120.7±21.5 39.7±2.5 143.7±21.0 293.3±32.1 200 μg/皿 107.0±12.2 42.7±4.7 154.3±14.2 286.7±38.9 40 μg/皿 122.3±9.7 34.7±9.0 144.0±31.5 293.3±52.2 8 μg/皿 106.7±8.0 35.7±10.7 142.0±7.8 291.0±26.9

表12 鹿皮膠樣品第二次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Table 12 Second Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

表12 鹿皮膠樣品第二次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Table 12 Second Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

系統(tǒng) 組別 TA97 TA98 TA100 TA102非S-9 活化系統(tǒng) 未處理組 129.3±8.5 45.0±12.5 174.3±36.5 254.3±13.5陽性對照組 2 085.7±294.9* 1 291.3±187.0* 760.3±113.8* 1 261.0±136.7*5 000 μg/皿 140.0±23.1 38.0±3.6 155.3±11.0 269.0±25.9 1 000 μg/皿 128.0±9.5 37.7±9.9 164.0±7.9 275.0±25.1 200 μg/皿 126.3±8.6 40.3±6.1 180.7±10.7 261.3±25.1 40 μg/皿 114.3±11.7 35.3±6.0 171.7±11.1 272.0±21.0 8 μg/皿 126.7±17.6 37.3±2.5 179.7±12.1 274.7±21.5

續(xù)表12 鹿皮膠樣品第二次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Continue table 12 Second Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

續(xù)表12 鹿皮膠樣品第二次Ames 試驗結(jié)果（，n=3）Continue table 12 Second Ames test results of deer hide glue samples（，n=3）

注：與溶劑對照組比，*表示差異極顯著，P＜0.01。

系統(tǒng) 組別 TA97 TA98 TA100 TA102 S-9 活化系統(tǒng) 未處理組 127.3±7.6 37.3±2.5 145.3±9.7 269.7±43.6溶劑對照組 123.7±15.3 38.7±6.7 154.0±9.6 276.0±11.1陽性對照組 547.0±109.3* 426.0±38.4* 577.3±93.3* 736.3±89.9*5 000 μg/皿 130.7±11.5 40.3±8.3 152.7±9.3 285.7±26.0 1 000 μg/皿 129.3±11.6 35.0±5.6 143.3±25.5 267.0±17.1 200 μg/皿 131.3±13.3 30.7±2.1 153.0±22.5 271.7±31.1 40 μg/皿 133.3±3.8 33.3±4.0 143.7±16.0 278.7±18.0 8 μg/皿 121.3±23.7 41.0±2.6 135.3±11.7 266.7±19.1

3 討論

試驗可知鹿皮膠樣品的小鼠經(jīng)口急性LD50＞10 g/kg，所以鹿皮膠屬于無毒物質(zhì)。各個灌胃劑量對小鼠的質(zhì)量、臟器指數(shù)、肝、腎功能無顯著影響，初步說明鹿皮膠樣品具有較高的食用安全性。亞慢性毒性試驗中，各劑量組與對照組在血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)、病理組織學(xué)等方面均無明顯差異，說明鹿皮膠樣品在合理使用范圍內(nèi)不會對受試動物產(chǎn)生慢性毒性。

本研究參考陳文學(xué)等的相關(guān)毒理學(xué)試驗[15，19]，采用小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗，對鹿皮膠樣品致突變作用進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，在雌雄兼有小白鼠，劑量低于10 g/kg 的鹿皮膠樣品不能引起小鼠雌雄骨髓細(xì)胞微核率升高，不具有致突變作用。精子畸形試驗結(jié)果表明，各劑量組小鼠精子畸形無異常，表明鹿皮膠樣品在此次試驗條件下對雄性小鼠無生殖毒性。Ames 試驗[20]結(jié)果表明鹿皮膠樣品5 個劑量對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型4 菌株均無致突變作用?？膳卸蛊つz樣品的Ames 試驗結(jié)果為陰性。