靈芝多糖的復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化

丁霄霄，李鳳偉，商曰玲，王篤軍，王杰，卜雯麗，余曉紅，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城224051）

靈芝（Ganoderma Lucidum），又名赤芝、紅芝、丹芝、瑞草等，是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬（Ganoderma）真菌，常用其子實(shí)體，是一種藥用真菌[1]。靈芝在我國(guó)有上千年的藥用歷史，富含靈芝多糖、三萜、甾醇、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦質(zhì)元素等多種生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中，靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、刺激胰島素分泌以促進(jìn)葡萄糖在外周組織的利用來(lái)降低血糖[2]、抗疲勞、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成[3]等多種藥理活性，可通過(guò)清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和增強(qiáng)抗氧化酶的活性對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用；另外，體內(nèi)自由基過(guò)多是誘發(fā)炎癥、衰老以及腫瘤等疾病的主要因素，因此多糖在抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)[4]和消炎[5]等方面也有極其重要的作用；而近些年來(lái)有關(guān)靈芝多糖對(duì)腸道微生物的影響的報(bào)道逐漸增多[6]。靈芝子實(shí)體主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3 種成分構(gòu)成，三者可形成木素結(jié)合層，纖維素自身也可形成束狀結(jié)晶區(qū)域，致使靈芝子實(shí)體具有較好的維持力和緊密的結(jié)構(gòu)，而靈芝子實(shí)體多糖存在于子實(shí)體緊密的細(xì)胞壁內(nèi)，導(dǎo)致靈芝多糖不容易被提取出來(lái)[7-8]。采用酶法提取靈芝多糖，條件溫和，能使幾丁質(zhì)、半纖維素等與靈芝多糖分離，不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)有利于獲得生物活性多糖，從而提高多糖的提取率，同時(shí)可以大規(guī)模用于工業(yè)化生產(chǎn)[9-10]。但與其他傳統(tǒng)方法相比，采用復(fù)合酶法提取靈芝多糖的研究起步相對(duì)較晚，研究報(bào)道相對(duì)較少，為此，本研究在正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶比例的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶法提取靈芝多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得較高的多糖提取率的提取工藝，為靈芝多糖的深入研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實(shí)體：江蘇德芝林生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司。

纖維素酶（20 000 U/g）：鄭州萬(wàn)博化工產(chǎn)品有限公司；半纖維素酶（20 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）、苯酚（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）、硫酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV752N 紫外可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；PB-20 型pH 計(jì)：德國(guó)賽多利斯公司；FA1104電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DNP 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海金宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D循環(huán)水真空泵、RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、SK-1 型快速混勻器：江蘇省金壇市瑞爾電器有限公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠；FD-1A-50 型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖

靈芝子實(shí)體預(yù)處理：洗凈后干燥至恒重，粉碎，過(guò)20 目篩，用石油醚80 ℃于循環(huán)裝置中水浴熱處理2 d～3 d，除去脂類；干燥至恒重，密封保存待用。

稱取靈芝子實(shí)體樣品1.00 g 置于100 mL 燒杯中，各分別稱取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶、木瓜蛋白酶和半纖維素酶（相對(duì)底物濃度）[11]加入pH 值為5.70 的磷酸鹽緩沖溶液配置成酶解液，按照1 ∶30（g/mL）的料液比加入酶解液，于40 ℃恒溫水浴中酶解100 min。酶解結(jié)束后90 ℃熱水中滅酶10 min，趁熱減壓抽濾后，將所得濾液濃縮至原體積的1/5，緩緩加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃下醇沉過(guò)夜。離心取沉淀，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌之后，用蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶，測(cè)定糖含量，計(jì)算多糖提取率。

1.3.2 糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為對(duì)照品，參照文獻(xiàn)[12]并加以改進(jìn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以葡萄糖含量c 為橫坐標(biāo)（μg），吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程A=0.006 7c+0.000 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。取1 mL多糖溶液，同法顯色后測(cè)吸光度A，代入方程即可進(jìn)一步計(jì)算出靈芝多糖提取率。

1.3.3 復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝條件確定

1.3.3.1 各單酶最佳添加量確定

分別以纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶的添加量為自變量，保持酶解條件不變，按照1.3.1 的試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，并分別記錄相應(yīng)吸光度，計(jì)算出靈芝多糖提取率，進(jìn)而分析各單酶添加量對(duì)其影響，得各最佳添加量。

1.3.3.2 復(fù)合酶配比確定

根據(jù)上述1.3.3.1 試驗(yàn)結(jié)果，按照表1 進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，以復(fù)合酶配比為自變量，保持酶解條件不變，按照1.3.1 的試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以靈芝多糖提取率為指標(biāo)，分析確定最佳復(fù)合酶配比。

表1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of Ganoderma lucidum polysaccharide by complex enzymatic method

1.3.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取條件的確定

分別以其中一個(gè)提取條件的因素水平為自變量，保持上述所得最佳酶配比以及其他條件不變，按照1.3.1 步驟進(jìn)行試驗(yàn)并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。如研究不同酶解時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率影響時(shí)，僅改變時(shí)間40、60、80、100、120 min，保持酶配比、酶解溫度和 pH 值不變；研究不同溫度對(duì)提取率影響時(shí)，僅改變溫度35、40、45、50、55 ℃時(shí)，保持酶配比、時(shí)間和 pH 值不變；研究不同pH 值對(duì)提取率影響時(shí)，僅改變pH 值4.30、4.65、5.00、5.35、5.70、6.05，保持酶配比、酶解溫度和時(shí)間不變。

通過(guò)提取條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別得各最佳水平；在此基礎(chǔ)之上，以酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH 值（C）為自變量，依據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，以靈芝多糖的提取率為響應(yīng)值，按照表2 三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13-14]及1.3.1 的試驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)提取靈芝多糖條件的優(yōu)化。

表2 三因素三水平的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Three-level three-factors of experimental Box-Behnken Design

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照表1 和表2 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算得到一系列的靈芝多糖提取率數(shù)據(jù)，分別采用軟件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手和Design-Expert version 8.0 軟件對(duì)其做進(jìn)行進(jìn)一步處理分析后，分別得出最佳酶配比和提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶添加量配比優(yōu)化

2.1.1 各單酶添加量對(duì)靈芝多糖提取效果的影響

纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶添加量對(duì)靈芝多糖提取效果的影響見圖1。

由圖1 可知，不同種類以及不同添加量的酶對(duì)靈芝多糖提取率有明顯的影響，原因在于靈芝子實(shí)體主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3 種成分構(gòu)成的木素結(jié)合層，子實(shí)體多糖存在于緊密的細(xì)胞壁內(nèi)，而不同種類及添加量的酶能使幾丁質(zhì)、半纖維素等與靈芝多糖分離，有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶劑中的溶解度。其中纖維素酶添加量達(dá)到3.0%時(shí)的多糖含量最高，提取率達(dá)到了2.94%，當(dāng)添加量大于3.0%時(shí)提取率反而降低；而半纖維素酶添加量在1.0%～4.5%的范圍內(nèi)，多糖得率隨著添加量的升高而增加，此后繼續(xù)增加后多糖得率得變化趨勢(shì)較平緩，最高提取率為2.34%；木瓜蛋白酶在添加量為2.5%時(shí)提取率達(dá)到最高1.66%，之后添加量大于2.5%時(shí)得率反而降低。因此3 種酶的最佳添加量為纖維素酶添加量3.0%，半纖維素酶添加量4.0%，木瓜蛋白酶添加量2.5%。

2.1.2 復(fù)合酶添加量配比的正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合酶添加量配比對(duì)靈芝多糖提取效果的影響見表3、表4。

表3 酶配比L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Enzyme ratio L9（34）orthogonal experimental results

由表3 極差分析結(jié)果可知，極差RA（0.52）＞RC（0.13）＞RB（0.10），因此改變纖維素酶添加量對(duì)靈芝多糖提取率影響最大。以K 值最佳選擇最優(yōu)方案為A3B2C3，即提取靈芝粗多糖的最佳復(fù)合酶的比例為：纖維素酶3.5%、半纖維素酶4.0%、木瓜蛋白酶3.0%，在此最佳復(fù)合酶比例下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得靈芝多糖提取率為3.32%，達(dá)到最高；而由表4 方差分析表可知，與另外兩種酶相比，纖維素酶添加量對(duì)靈芝多糖提取率的影響最為顯著，其他兩個(gè)因素對(duì)提取率的影響均不顯著。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取條件

2.2.1 提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

按照正交試驗(yàn)結(jié)果選用最佳復(fù)合酶的比例，參照張?zhí)煨Φ萚15]的試驗(yàn)并加以改進(jìn)，保持酶解溫度40 ℃、pH 5.70 不變，改變酶解時(shí)間，按照1.3.1 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，分析結(jié)果得出時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取效果的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖2 表明，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率在酶解時(shí)間為80 min 時(shí)靈芝多糖提取率達(dá)到最大提取率3.55%，此后呈下降的趨勢(shì)。原因可能是由于用于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致靈芝多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使提取率降低。因此選擇80 min 為試驗(yàn)最佳酶解時(shí)間。

2.2.1.2 酶解溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

按照上述的試驗(yàn)結(jié)果選用最佳復(fù)合酶的比例以及上述酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果，參照翟為等[16]的試驗(yàn)并加以改進(jìn)，保持酶解時(shí)間80 min、pH 5.70 不變，改變酶解溫度，按照1.3.1 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，分析結(jié)果得溫度對(duì)靈芝多糖提取效果的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖3 表明，隨著酶解溫度的升高，靈芝粗多糖的提取率逐漸增大，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，復(fù)合酶分解靈芝細(xì)胞壁效果最佳，大量的多糖類物質(zhì)迅速地釋放出來(lái)，此時(shí)靈芝多糖提取率達(dá)到最大值3.57%；當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸下降。原因可能是由于溫度過(guò)高降低了復(fù)合酶的活性，酶解細(xì)胞壁效果降低，使多糖提取率下降。試驗(yàn)結(jié)果與梁姍等運(yùn)用復(fù)合酶提取胭脂蘿卜花青素的結(jié)果一致[17]，且其中纖維素酶的最適溫度為50 ℃左右，因此復(fù)合酶采用50 ℃也是較適宜的。

2.2.1.3 酶解pH 值對(duì)靈芝多糖提取率的影響

按照上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，參照劉曉艷等[18]的試驗(yàn)并加以改進(jìn)，保持酶解時(shí)間80 min、溫度時(shí)間50 ℃不變，改變酶解pH 值，分析結(jié)果得pH 值對(duì)靈芝多糖提取效果的影響見圖4。

圖4 pH 值對(duì)靈芝多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

由圖4 可知，靈芝多糖提取率隨pH 值升高呈顯著上升趨勢(shì)；在pH 值為5.35 時(shí)，靈芝多糖提取率最大，達(dá)到3.67%；而pH 值超過(guò)5.35，靈芝多糖提取率逐漸降低。這說(shuō)明復(fù)合酶體系的pH 值為5.35 左右，在這一特定的pH 值，酶的的空間結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)固，從而對(duì)酶的構(gòu)象和酶活的相應(yīng)變化影響較小[18]；低于或高于5.35 時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)遭到不同程度的破壞，從而引起酶構(gòu)象和酶活的相應(yīng)變化，導(dǎo)致酶活性下降，影響酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致多糖提取率下降，也可能是某些酶反應(yīng)不充分，提取率不高[19]。所以最佳pH 值確定為5.35。

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間（A）、溫度（B）、pH 值（C）進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface methodology

以靈芝多糖提取率為響應(yīng)值（Y），使用軟件Design-Expert versi 進(jìn)行多元回歸擬合，計(jì)算回歸系數(shù)，可以得到靈芝多糖提取率對(duì)酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）和酶解pH 值（C）的多項(xiàng)回歸方程：Y=3.574＋0.089×A+0.00125×B+0.22×C－0.22×AB－0.063×AC－0.0075×BC－0.31×A2－0.15×B2－0.017×C2。

2.2.2.2 模型顯著性檢驗(yàn)

模型顯著性檢驗(yàn)見表6。

從表6 的模型方差分析中可以看出，本試驗(yàn)的回歸方程模型P＜0.05，表明模型具有顯著性，說(shuō)明該回歸模擬合理，可以很好地解釋響應(yīng)值；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.528 7＞0.05），說(shuō)明該模型對(duì)復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝的分析和預(yù)測(cè)是可靠的。模型的一次項(xiàng)C 即酶解pH 值的影響顯著，A、B 的影響不顯著；二次項(xiàng)中酶解時(shí)間的影響顯著，酶解pH 值、酶解溫度的影響不顯著；交互項(xiàng)中酶解時(shí)間和酶解溫度的影響顯著，酶解時(shí)間和酶解pH 值的影響不顯著，酶解pH 值和酶解溫度影響不顯著。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of the regression model

圖5～圖7 是根據(jù)多元回歸程所得到的不同因素之間的交互作用對(duì)靈芝多糖提取率影響的響應(yīng)面圖及等高圖。從3D 響應(yīng)面可以直觀地看出各變量之間的相互作用關(guān)系，而根據(jù)2D 等高線圖是圓形或者橢圓形則可以看出各變量之間的顯著水平[18]。通過(guò)3D 圖可知，3 個(gè)因素的相互作用對(duì)靈芝多糖提取率的影響都是先隨著數(shù)值的增加，響應(yīng)值緩慢增大，當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極值后，隨著因素的繼續(xù)增加，響應(yīng)值逐漸減??；由圖5 中的2D 等高線圖是橢圓形圖可知，酶解溫度和酶解時(shí)間兩個(gè)因素交互作用顯著，結(jié)果與表6 回歸模型方差表中的AB 兩因素分析結(jié)果顯著一致。

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果和回歸方程，利用Design Expert8.0 軟件進(jìn)行分析靈芝多糖最佳提取工藝，得到回歸方程的最大值點(diǎn)是：酶解時(shí)間為81.33 min，酶解溫度為49.67 ℃，酶解pH 值為5.70，考慮到實(shí)際操作性將工藝參數(shù)修正為：酶解時(shí)間為 81 min、溫度為 50 ℃、pH 值為 5.70，模型預(yù)測(cè)的靈芝多糖提取率最高為3.78%。為了驗(yàn)證其可行性，在此條件下進(jìn)行3 組驗(yàn)證性試驗(yàn)，靈芝多糖提取率為3.73%，與模型預(yù)測(cè)值相差0.05%，說(shuō)明響應(yīng)面法得到的靈芝多糖提取工藝條件真實(shí)可靠。

圖5 酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用對(duì)靈芝多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Enzymolysis temperature and enzymolysis time as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖6 酶解pH 值和酶解時(shí)間交互作用對(duì)靈芝多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Enzymolysis time and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖7 酶解pH 值和酶解溫度交互作用對(duì)靈芝多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Enzymolysis temperature and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

3 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶法提取靈芝多糖優(yōu)于單酶提取，復(fù)合酶用量最佳配比為纖維素酶3.5 %、半纖維素酶4.0 %和木瓜蛋白酶3.0 %；然后采用響應(yīng)面法分析得最佳提取條件：酶解時(shí)間為81 min、溫度為50 ℃、pH 值為5.70，驗(yàn)證得靈芝多糖的最大提取率為3.73%。本研究結(jié)果為較高的粗多糖得率提取工藝提供了理論依據(jù)。