保加利亞乳桿菌ND02發(fā)酵乳清過程中的代謝特性

彭江英，李丹陽，劉洋碩，張文弈，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018）

代謝組學(xué)（metabolomics）是研究關(guān)于生物體受刺激或被擾動后，其代謝物變化規(guī)律的科學(xué)[1]。目前，利用代謝組學(xué)技術(shù)分析發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)成分，檢測發(fā)酵過程中代謝物的變化并揭示代謝物產(chǎn)生機制的研究越來越多[2]。

乳清是生產(chǎn)干酪和干酪素的副產(chǎn)品，富含大量的乳糖、乳清蛋白和其它微量成份，保留了牛奶中55%的營養(yǎng)成分[3]。研究表明，利用乳酸菌發(fā)酵乳清，可分解乳清蛋白釋放出免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽、抗高血壓肽和必需氨基酸等，同時可將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，增加乳清產(chǎn)品的生物活性和營養(yǎng)價值[4]。

保加利亞乳桿菌ND02（Lactobacillus delbrueckiisubsp.BulgaricusND02）是分離自青海傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛奶中的乳酸菌，通過對其進行單菌發(fā)酵時間、發(fā)酵乳風(fēng)味以及發(fā)酵乳脫水縮合能力等方面的研究，發(fā)現(xiàn)此菌株具有優(yōu)良的發(fā)酵特性[5]。L.bulgaricusND02基因組中含有431個獨有的基因，其中包括乙酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫羧酶、多糖合成蛋白、多種糖基轉(zhuǎn)移酶以及胞外多糖合成簇等[6]。從基因角度表明了L.bulgaricusND02在發(fā)酵過程中具有優(yōu)良的凝乳特性且具有提高發(fā)酵乳制品營養(yǎng)價值的潛在特性，但還需對其代謝物進行進一步鑒定和研究。

目前，國內(nèi)外利用代謝組學(xué)技術(shù)分析乳清在發(fā)酵過程中代謝物質(zhì)變化的研究還較少。作者利用L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清，采用UPLC-Q-TOF MSE代謝組學(xué)技術(shù)，比較分析L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清過程中代謝物質(zhì)的變化，并通過主成分分析（PCA）結(jié)合偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）研究L.bulgaricusND02在發(fā)酵乳清過程中的代謝特性，評估代謝產(chǎn)物對發(fā)酵乳清生理功效的影響，為發(fā)酵乳清的生產(chǎn)開發(fā)以及乳清原料的合理利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC-Q-TOF MS超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀：Waters Acquity UPLC?HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱；Waters MassLynx 4.1及Progenesis QI工作站：均購自美國Waters公司；Milli-Q純水儀：購自美國密理博公司。

1.2 材料與試劑

試驗菌株L.bulgaricusND02：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供；乳清蛋白粉（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為80%）：購自新西蘭恒天然公司；異亮氨酸-腦啡肽：購自Waters公司；LCMS級乙腈、甲酸、氫氧化銨溶液：均購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 發(fā)酵乳清的制備

將乳清溶液（乳清蛋白粉3.8%）經(jīng)95℃滅菌10 min，冷卻至42℃后，按5×106CFU/mL接入L.bulgaricusND02，于42℃進行發(fā)酵，發(fā)酵終點pH值為4.5，收集乳清溶液樣本和發(fā)酵乳清樣本，并置于-80℃冰箱備用。

1.4 樣品前處理

吸取3 mL樣本于5 mL EP管中，加入1 mL乙腈，充分混勻，10 000g高速離心10 min，吸取1 mL上清液于新的5 mL EP管中，加入3 mL乙腈，充分混勻，4℃靜置2 h，12 000g高速離心5 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮9 h，加體積分數(shù)40%乙腈溶液復(fù)溶，0.22μm微孔濾膜過濾于上樣瓶中。將所有上樣瓶中的樣品各吸100μL，加入同一上樣瓶中，作為質(zhì)量監(jiān)測（Quality control，QC）樣本。每隔6個樣本進行一次質(zhì)控樣本的采集，用于評估在樣本采集過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.5 發(fā)酵乳清UPLC-Q-TOF MSE測定條件

1.5.1 超高效液相色譜條件色譜柱采用Acquity UPLC?HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm），柱溫45℃，進樣體積5μL，流量0.45 mL/min。正離子模式掃描下：流動相A1為H2O+0.1%甲酸，B1為乙腈+0.1%甲酸，梯度洗脫條件見表1；負離子模式掃描下：流動相A2為H2O+0.1%氫氧化銨溶液，B2為純乙腈，梯度洗脫條件見表2。

表1 正離子模式下流動相流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient program in positive ion mode

表2 負離子模式下流動相流動相梯度洗脫條件Table 2 Mobile phase gradient program in negative ion mode

1.5.2 質(zhì)譜條件質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI-）進行采集，以氮氣作為霧化氣，一級質(zhì)荷比掃描范圍為50～1 200，對所有母離子選擇20～40 eV的能量進行破碎，采集所有的碎片信息。毛細管電壓3 kV，錐孔電壓40 kV，離子源溫度（Source Temperature）120℃，脫溶劑氣溫度（Desolvation Temperature）500℃，脫溶劑氣流速（Desolvation Gas flow）800 L/h，錐孔氣流量（Cone Gas flow）50 L/h，掃描時間（Scan Time）0.2 s。正離子模式下鎖定質(zhì)量數(shù)（Lock Mass）為556.277 1，負離子模式下鎖定質(zhì)量數(shù)為554.261 5，Lock Mass掃描時間為0.2 s，采集間隔為20 s，使用質(zhì)量濃度為2 ng/mL亮氨酸腦啡肽作為校正液進行實時質(zhì)量校正，流量為10μL/min。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析及代謝物的鑒定

UPLC-Q-TOF MSE采集到的原始數(shù)據(jù)，包括相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)核比m/z、保留時間和離子強度，通過MassLynx 4.1工作站和Progenesis QI軟件進行峰提取、峰對齊、去卷積化等處理，得到所有標(biāo)志物在各樣本中的量化數(shù)據(jù)。將所得的量化數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZinfo（Waters，USA）軟件進行多元統(tǒng)計學(xué)分析，主要采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法—判別分析（OPLS-DA）來進行建模分析。采用化合物對分組的貢獻程度VIP值＞1、P＜0.05和差異倍數(shù)≥2相結(jié)合的條件篩選乳清發(fā)酵過程中的顯著差異代謝物?；陲@著差異代謝物的質(zhì)核比、保留時間以及碎片信息，通過搜索Chemspider、HMDB、KEGG、METLIN、ECMDB等數(shù)據(jù)庫獲得參考代謝物，完成鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳清UPLC-Q-TOF MSE色譜圖分析

利用UPLC-Q-TOF MSE代謝組學(xué)技術(shù)研究L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清過程中代謝物質(zhì)的變化。正、負離子模式下發(fā)酵乳清（FW）和乳清溶液（W）的代表性基峰強度色譜圖（basepeak intensity chromatograms，BPI）見圖1。BPI圖是將每個時間點質(zhì)譜圖中最強的離子的強度連續(xù)描繪得到的圖譜，它能反映樣本的整體信息[7]。從圖1可看出，在正、負離子模式下，發(fā)酵乳清和乳清溶液在色譜峰的數(shù)量和基峰強度方面均存在明顯差異。

圖1 乳清發(fā)酵過程中的基峰強度色譜（BPI）Fig.1 Based peak intensity（BPI）chromatograms of whey during fermentation

2.2 發(fā)酵乳清代謝組學(xué)分析

為了進一步觀察乳清發(fā)酵過程中代謝物的差異，將Progenesis QI軟件所得的量化數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZinfo軟件進行多元統(tǒng)計學(xué)分析，通過主成分分析（PCA）和偏最小二乘法—判別分析（OPLS-DA），得到2組樣本間的聚集情況，結(jié)果見圖2—3。在PCA得分圖上，每一個點代表一個樣本，每個樣本的位置由其自身的代謝決定，具有相似代謝物的樣本在得分圖上處于相近的地理位置。距離差距越大，也就表明樣品間的代謝物差異越大。由圖2可看出，兩組平行樣品間能夠較好的聚集在一起，且組間顯著區(qū)分。此外，QC樣本也能較好的聚集在一起，說明檢測分析體系的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。結(jié)果表明，經(jīng)L.bulgaricusND02發(fā)酵的乳清與乳清溶液中的代謝物質(zhì)存在明顯的差異。為了確定L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清過程中差異顯著的代謝物，進一步生成OPLS-DA模型所對應(yīng)兩組樣本分類的得分圖（S-PLOT）。基于S-PLOT圖選擇VIP值＞1的離子，將其看做是可能潛在的標(biāo)志物，結(jié)果見圖4。在S-PLOT圖中，離子對組間分類的貢獻越大，其距離原點越遠。圖4中存在多個遠離中心區(qū)域的離子，表明乳清發(fā)酵過程中存在差異代謝物。

圖2 乳清發(fā)酵過程中的PCAFig.2 PCA of whey during fermentation

圖3 乳清發(fā)酵過程中的OPLS-DAFig.3 OPLS-DA of whey during fermentation

圖4 乳清發(fā)酵過程中的S-PLOTFig.4 S-PLOTS of whey during fermentation

2.3 潛在標(biāo)志物的鑒定與分析

鑒定差異代謝物的方法是通過MSE數(shù)據(jù)采集方法得到母離子和相應(yīng)的碎片離子信息，根據(jù)其保留時間、豐度值、質(zhì)核比，經(jīng)Progenesis QI軟件篩選分析?；谧兞恐匾酝队爸礦IP值＞1，P＜0.05和差異倍數(shù)≥2的代謝物確定標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出37種代謝物，包括氨基酸、多肽、碳水化合物及相關(guān)代謝物、脂肪酸及相關(guān)代謝物、有機酸、維生素中間產(chǎn)物和核苷酸代謝物，見表3。

表3 乳清發(fā)酵過程中的差異代謝物Table 3 The potential biomarkers of whey during fermentation

2.3.1 氨基酸和多肽多肽和氨基酸的變化是由于L.bulgaricusND02在發(fā)酵過程中將乳清中的蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸。由表3可知，與乳清溶液相比，發(fā)酵乳清中游離氨基酸亮氨酸、異亮氨基酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸的相對含量顯著增加。Micaela Pescuma等人評估了德氏乳桿菌保加利亞亞種CRL 454、嗜酸乳桿菌CRL636和嗜熱鏈球菌CRL 804c水解乳清蛋白的能力，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種CRL 454水解乳清蛋白能力最強，并可釋放支鏈氨基酸亮氨酸和纈氨酸[8]。之后，Micaela Pescuma等人在研究功能性發(fā)酵飲料時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞亞種CRL 656發(fā)酵的乳清中有較高濃度的必需氨基酸，包括亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和蘇氨酸，從而提高了發(fā)酵乳清的營養(yǎng)價值[9]。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）是乳清蛋白的主要組成成分，但是它是引起牛乳過敏的主要蛋白質(zhì)之一，可誘發(fā)特異性IgE抗體介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)。德氏乳桿菌保加利亞亞種在發(fā)酵過程中可將BLG水解為支鏈脂肪酸亮氨酸、異亮氨基酸和纈氨酸，從而緩解過敏反應(yīng)[10]。這可以解釋發(fā)酵乳清中支鏈氨基酸亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸相對含量顯著增加的原因。研究表明，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸在機體劇烈運動時為骨骼肌供能并促進丙氨酸和谷氨酸的合成，此外亮氨酸、賴氨酸、異亮氨基酸和蘇氨酸參與葡萄糖代謝和蛋白質(zhì)代謝，對于體質(zhì)量的控制有很大的作用[11]。劉晶等人發(fā)現(xiàn)，利用保加利亞乳桿菌對乳清進行發(fā)酵可以提高抗氧化性，主要因為半胱氨酸、賴氨酸和脯氨酸具有較好的抗氧化作用[12]。本研究中半胱氨酸和脯氨酸的相對濃度都顯著增加，進一步驗證了乳酸菌發(fā)酵的乳清飲料可以作為天然的抗氧化劑來改善食品的品質(zhì)。保加利亞乳桿菌對營養(yǎng)需求比較苛刻，自身不能直接利用外源蛋白質(zhì)[13]，因此，L.bulgaricusND02可能利

用乳清中存在的游離氨基酸來維持其生長與繁殖，這可解釋在發(fā)酵乳清中苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丙氨酸相對濃度減少的原因。

此外，發(fā)酵乳清中的多肽含量高于乳清溶液，本研究共鑒定了13種差異豐富的寡肽。其中在發(fā)酵乳清中Valyl-Alanine、Tyr-Pro-Trp、Ala-Leu-Pro-Met、L-Glutaminyl-L-tyrosyl-L-asparaginyl-Lalanyl-L-aspartic acid、Lysyl-Isoleucine、Tyr-Trp、Lalanyl-L-proline、Lys-Val-Ala 8種寡肽的相對濃度相比于乳清溶液顯著增高，相反TThr-Tyr-Trp-Trp、Alanyl-Lysine、Leu-Gly、Asn-Leu-His、Ala-Val 5種寡肽的相對濃度則降低。乳酸菌（LAB）是被廣泛用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的微生物，其擁有由細胞包膜蛋白酶（啟動蛋白質(zhì)降解）、運輸系統(tǒng)和幾種細胞內(nèi)肽酶組成的有效蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)，能夠降解乳蛋白[14]。雖然本研究未對發(fā)酵乳清中肽鏈的功能進行探究，但國內(nèi)外學(xué)者對此進行了大量研究。Saint-Sauveur D等人通過小鼠試驗表明，乳清蛋白發(fā)酵后產(chǎn)生的多肽可使未受大腸桿菌感染的小鼠體內(nèi)的免疫球蛋白A含量增加[15]。α-乳白蛋白是生產(chǎn)天然抗氧化劑的良好原料，β-乳球蛋白經(jīng)分解也可以釋放出抗氧化肽[16]。Micaela Pescuma等人在德氏乳桿菌保加利亞亞種CRL 454水解BLG的代謝物中發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能的多肽Y102-R124、C121-L140和L149-I162[17]。由此可知，乳清蛋白經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后會產(chǎn)生多種生物活性肽，這些活性肽不僅能提高人體的免疫功能，預(yù)防細菌、病毒和寄生蟲的感染，而且具有抗氧化能力，可防止衰老。此外，乳清發(fā)酵產(chǎn)品中含有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的多肽，可起到降血壓的作用[18]。

2.3.2 碳水化合物及其相關(guān)代謝物保加利亞乳桿菌對乳糖的代謝方式為同型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下被NADH還原為乳酸，而半乳糖不能被利用，被排除到細胞外[19]。因此在發(fā)酵乳清中乳糖的相對含量減少而半乳糖的含量卻增加。雙乙酰一直被認為是構(gòu)成發(fā)酵乳制品獨特風(fēng)味的主要成分之一，而2-乙酰乳酸是乳酸菌合成雙乙酰的前體物質(zhì)，在乳酸菌中生成雙乙酰的代謝途徑主要有檸檬酸代謝途徑和糖酵解代謝途經(jīng)[20]。由于乳清中檸檬酸的含量很低，所以發(fā)酵乳清中的雙乙?？赡苤饕ㄟ^糖酵解代謝途徑生成。但是由于雙乙酰是揮發(fā)性物質(zhì)，一般用GC-MS才可以檢測到，本研究只檢測到了它的前體物質(zhì)2-乙酰乳酸。

2.3.3 脂肪酸及相關(guān)代謝物本研究只鑒定到了不飽和脂肪酸油酸，其在發(fā)酵乳清中含量顯著高于乳清溶液。油酸又叫順-9-十八碳烯酸，乳酸菌在厭氧條件下通過脫飽和作用可以生成不飽和脂肪酸，不過這種脫飽和作用發(fā)生在脂肪酸合成的早期，通常是在合成8～12個碳原子的β-羥脂酰基后，經(jīng)脫水酶催化形成不飽和脂肪酸，之后在β-酮脂酰-ACP合成酶的催化下使碳鏈加長，最終形成油酸。油酸和硬脂酸對軟化血管有一定的功效，且在人體的新陳代謝代謝中發(fā)揮著很重要的作用[21]，因而發(fā)酵乳清中油酸的增加可以說明發(fā)酵乳清有益于人體健康。

2.3.4 有機酸有機酸不僅賦予了發(fā)酵乳制品特殊的營養(yǎng)價值、口感風(fēng)味和生物功能，而且還是天然的防腐劑[22]。本研究在乳清發(fā)酵過程中鑒定到4種有機酸（乳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯乳酸）的相對含量發(fā)生了顯著變化。其中，發(fā)酵乳清中檸檬酸相對含量減少，乳酸、琥珀酸和苯乳酸的相對含量增加。保加利亞乳桿菌是一種兼性厭氧的乳酸菌，在缺氧條件下具有很強的產(chǎn)酸能力和耐酸性，通過體內(nèi)H+-ATPase酶的催化促進其對糖和氨基酸的利用，并生成代謝物質(zhì)檸檬酸和乳酸[23]。兼性厭氧乳酸菌在無氧的條件下，由于缺乏丙酮酸脫氫酶系和α-酮戊二酸脫氫酶系，TCA循環(huán)被改為兩條分支的支路進行。氧化支路由檸檬酸脫氫生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在無氧條件下不能轉(zhuǎn)換生成琥珀酸，只能生成谷氨酸；還原支路由草酰乙酸還原延胡索酸，最后還原為琥珀酸。因此保加利亞乳桿菌在無氧條件下發(fā)酵乳清的過程中，其利用乳糖生成乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳清中乳酸含量增加，同時可能進行了分支TCA循環(huán)導(dǎo)致乳清中琥珀酸積累，而檸檬酸最終減少轉(zhuǎn)化為谷氨酸[24]。苯乳酸是一種天然的防腐劑，具有抗真菌的功效。Lavermicocca等人從乳酸菌屬Lactobacillus plantarum21B代謝產(chǎn)物中分離得到苯乳酸，研究發(fā)現(xiàn)其具有較廣的抑菌圖譜，與其他生物防腐劑相比，具有較好的溶解性和穩(wěn)定性[25]。

2.3.5 維生素在發(fā)酵乳清中N-氧代煙酰胺的相對含量減少。煙酰胺-N-氧化物是乳酸菌合成維生素B12的一個中間產(chǎn)物[26]。李俊芳等人對16株乳酸菌進行產(chǎn)維生素B12的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16株菌中有8株產(chǎn)維生素B12，產(chǎn)維生素B12的量最高的SE7-1菌株被鑒定為乳桿菌[27]。維生素B12是人體必需的惟一含有金屬離子的水溶性維生素，具有廣泛的生理學(xué)作用，它參與體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)換及葉酸代謝，促進神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經(jīng)和外周髓鞘神經(jīng)纖維的功能完整，并參與廣泛的蛋白質(zhì)及脂肪代謝，是人體必需的維生素之一[28]。目前，由于對乳酸菌發(fā)酵過程中維生素B12變化方面研究較少，尤其是在使用代謝組學(xué)的方法來監(jiān)測其生物化學(xué)變化及代謝途徑的研究更是寥寥無幾，需要進一步研究。

2.3.6 核苷及其相關(guān)代謝產(chǎn)物本研究還發(fā)現(xiàn)乳清經(jīng)L.bulgaricusND02發(fā)酵后，胞嘧啶核苷酸、黃嘌呤和尿酸這3種核苷酸代謝物的相對含量顯著增加。核苷酸由堿基、戊糖和磷酸三部分組成，在生物體內(nèi)不是由三部分直接聚合而成的，而是由糖代謝過程中的中間體，通過一系列反應(yīng)步驟逐步合成的。嘧啶核苷酸（CTP）是從NH3、CO2、和ATP合成氨基甲酰磷酸開始，在與天冬氨酸結(jié)合生成氨基甲酰天冬氨酸，經(jīng)閉環(huán)后生成二氫乳清酸，從而形成嘧啶環(huán)。乳清酸進一步與PRPP反應(yīng)生成乳清核苷-5′-UTP，最終生成5′-CTP。保加利亞乳桿菌可以利用嘌呤作為碳源、氮源和生長的能量來源。其在分解嘌呤的過程中腺嘌呤在腺嘌呤脫氫酶的催化下分解為次黃嘌呤，進一步被次黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變成黃嘌呤。此外鳥嘌呤也可以在鳥嘌呤脫氫酶的催化下生成黃嘌呤。最終黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸。這就解釋了發(fā)酵乳清中胞嘧啶、黃嘌呤和尿酸的含量升高的原因。核苷酸是生物體內(nèi)一類重要含氮化合物，其中乳中的核苷酸的生物功能主要有調(diào)節(jié)腸道菌群、促進生長發(fā)育、增強免疫能力、改善脂質(zhì)代謝等[29]。

3 結(jié)語

采用UPLC-Q-TOF MSE代謝組學(xué)方法，比較分析了L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清過程中代謝物的變化，通過多變量統(tǒng)計分析對代謝物進行篩選后，共鑒定出了異亮氨酸、Ala-Leu-Pro-Met、甲基-D-吡喃半乳糖苷、油酸、琥珀酸、黃嘌呤和胞嘧啶腺苷酸等37個差異代謝物，涉及氨基酸代謝、糖代謝、脂肪酸代謝以及核苷酸代謝等多條復(fù)雜代謝途徑。L.bulgaricusND02發(fā)酵乳清中半胱氨酸、Tyr-Trp、胞嘧啶核苷酸以及苯乳酸等23個代謝物的相對含量顯著增加，這些代謝物不僅可以提高發(fā)酵乳清的營養(yǎng)價值，而且具有抗氧化、抗高血壓和抑制病原菌等特殊的生理功效。