群體感應(yīng)調(diào)控下的乳酸菌細(xì)菌素合成

宋 剛，曹春振，楊志馨，潘 月，葛菁萍*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080）

隨著國(guó)民安全意識(shí)的不斷提高以及國(guó)家對(duì)化學(xué)防腐劑的嚴(yán)格限制，利用新型、天然、安全的防腐劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)防腐劑成為一種必然的趨勢(shì)[1]。由乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物——細(xì)菌素被認(rèn)為是安全且天然的防腐劑，并且已成為主要關(guān)注點(diǎn)[2]。細(xì)菌素是一種由核糖體合成的抗菌蛋白質(zhì)或多肽，可以抑制或殺死同種或種屬關(guān)系較近的細(xì)菌[3]?，F(xiàn)有由乳鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素Nisin作為食品添加劑獲得了FDA的認(rèn)可并已經(jīng)被投入使用[4]。目前，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 700多種細(xì)菌素，其中有300多種細(xì)菌素為乳酸菌產(chǎn)生[5]。

乳酸菌是一類被認(rèn)為對(duì)人類安全的微生物，因此乳酸菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素也被認(rèn)為是對(duì)人類無(wú)害的，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的防腐劑[6]。但是目前只有乳酸鏈球菌素Nisin通過(guò)了FDA認(rèn)證并進(jìn)行生產(chǎn)和使用，主要原因是大部分產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的群體感應(yīng)基因存在多樣性，目前還沒(méi)有一套通用的調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用到細(xì)菌素的生產(chǎn)中，從而影響了乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用與發(fā)展[7]。

1 乳酸菌細(xì)菌素的分類

目前，研究者將細(xì)菌素分為3類：I類是含有羊毛硫氨酸的低相對(duì)分子質(zhì)量（＜5 000）熱穩(wěn)定肽，含有約19～37個(gè)氨基酸，其主要結(jié)構(gòu)含有氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸[8-9]，例如由乳酸乳桿菌屬產(chǎn)生的乳鏈菌肽lactocin[10-11]。這些細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌、李斯特菌和腸球菌的生長(zhǎng)有著顯著的抑制作用[12]。1944年Hirsch較早發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌可產(chǎn)生一種具有抑菌活性的物質(zhì)，且具有和蛋白質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，后命名為Nisin，它是I類乳酸菌細(xì)菌素的典型代表[13]。II類是小相對(duì)分子質(zhì)量（＜10 000）非羊毛硫氨酸熱穩(wěn)定肽，包括4個(gè)亞類IIa、IIb、IIc和IId，如 pediocin PA1、lactococcin G、acidocin B、lacticin Q等[14-15]；其中IIa類細(xì)菌素是主要的亞種，植物乳桿菌產(chǎn)生的pediocin PA1是主要代表。2014年P(guān)erez和其他研究者發(fā)現(xiàn)，IIa類細(xì)菌素僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如乳酸菌和李斯特菌表現(xiàn)出抗菌活性[16]；2015年O′Oconnor等又發(fā)現(xiàn)IIa類細(xì)菌素對(duì)極少數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等也具有抗菌活性[17]。III類為高相對(duì)分子質(zhì)量（＞30 000）不含羊毛硫氨基酸的熱不穩(wěn)定肽，如lysostaphin、enterolysin A、helveticin J[15]。

表1 乳酸菌細(xì)菌素的分類Table 1 Classification of lactic acid bacteria bacteriocin

2 細(xì)菌素合成相關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)（QS）是細(xì)胞之間的通信過(guò)程，可以調(diào)節(jié)細(xì)菌之間細(xì)菌行為和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制[18]。當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到閾值時(shí)，它使用可在細(xì)胞間擴(kuò)散的信號(hào)分子來(lái)感知菌群的數(shù)量變化，啟動(dòng)其相關(guān)基因表達(dá)并調(diào)節(jié)相關(guān)的生物學(xué)功能[19]，如生物發(fā)光、生物聚類、細(xì)胞外多糖的合成、毒素和細(xì)菌素的產(chǎn)生以及生物膜的形成[20-22]。乳酸菌屬于G+細(xì)菌，其QS系統(tǒng)與G-細(xì)菌不同。大部分乳酸菌有兩套QS系統(tǒng)，分別應(yīng)用于種內(nèi)交流和種間交流[23]。

2.1 種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)

在種內(nèi)交流機(jī)制中，乳酸菌能夠在核糖體中合成一種小分子寡肽類物質(zhì)（autoinducingpeptide，AIP）的前導(dǎo)肽，其經(jīng)過(guò)特殊的轉(zhuǎn)錄后加工與修飾成為具有活性的信號(hào)分子AIP，并通過(guò)對(duì)雙組分蛋白質(zhì)的磷酸化及去磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)傳遞，以達(dá)到對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[24]。不同種類的細(xì)菌中前導(dǎo)肽的長(zhǎng)短及組成差異較大，形成的寡肽分子也不同[25]。此外，AIP不能自由通過(guò)細(xì)胞壁，需通過(guò)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC）或其他膜傳遞蛋白質(zhì)在細(xì)胞外分泌，從而行使功能作用[26]。乳酸菌的種內(nèi)群體感應(yīng)機(jī)制見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌的種內(nèi)群體感應(yīng)機(jī)制Fig.1 Intraspecific quorum sensing mechanism of lactic acid bacteria

2.2 種間群體感應(yīng)系統(tǒng)

LuxS/AI-2型QS系統(tǒng)又稱種間QS系統(tǒng)，廣泛存在于G-菌和G+菌中，研究人員認(rèn)為，AI-2在細(xì)菌群體的交換中充當(dāng)通用信號(hào)分子，在諸如腸道菌群等多菌種生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要的信號(hào)傳遞作用[27]。AI-2于1993年首次被人們認(rèn)可，Bassler等人[28]在研究哈維氏弧菌（Vibro harveyi）生物發(fā)光現(xiàn)象時(shí)，發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)調(diào)控的信號(hào)分子是AI-2，并詳細(xì)探明其調(diào)控機(jī)制。

目前，已知大多數(shù)細(xì)菌中AI-2的生物合成途徑基本相似，并且在細(xì)菌的基因組中都有發(fā)現(xiàn)luxS同源序列的存在[29]。AI-2由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）通過(guò)3步酶促反應(yīng)形成。多細(xì)胞生物如真菌中的主要細(xì)胞甲基化供體也是合成脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白質(zhì)的重要輔助因子呋喃硼酸二酯的前體[30]。在催化過(guò)程中，SAM被轉(zhuǎn)化為甲基供體，形成中間產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸（Sadenosylhomocysteine，SAH），隨后被SAH核苷酸酶水解為S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和腺嘌呤，由luxS基因編碼的LuxS蛋白催化SRH產(chǎn)生高半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮（4，5-dihydroxy-2，3-pentanedion，DPD），最后DPD進(jìn)一步環(huán)化、重排及一系列反應(yīng)形成AI-2[31]。由于4，5-二羥基-2，3-戊二酮從不同細(xì)菌中重排的差異，所以產(chǎn)生的AI-2具有一定的特異性，能夠被不同的細(xì)菌所識(shí)別[32]。

LuxS蛋白是合成AI-2的關(guān)鍵酶，一些研究也證明了AI-2產(chǎn)生必須依賴luxS基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)luxS基因進(jìn)行突變、克隆，致使LuxS蛋白失活，在細(xì)菌內(nèi)也不能檢測(cè)到AI-2的產(chǎn)生[33]。近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一株從人類健康腸道中分離出的L.rhamnosusGG能夠產(chǎn)生類似呋喃酰硼酸二酯類化合物的信號(hào)分子，并在該菌中發(fā)現(xiàn)了LuxS同源蛋白質(zhì)，當(dāng)敲除基因luxS后，致使突變菌株生長(zhǎng)緩慢，且無(wú)法再合成細(xì)菌素的同時(shí)生物膜合成也受到阻礙[34]。

3 QS對(duì)乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)生的特性研究

3.1 QS對(duì)乳酸菌細(xì)菌素合成的調(diào)控

初步研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)系統(tǒng)可調(diào)節(jié)乳酸乳球菌、植物乳桿菌和球形乳桿菌中的細(xì)菌素合成[35]。目前，許多研究已經(jīng)證實(shí)，大多數(shù)乳酸菌的細(xì)菌素合成受QS系統(tǒng)調(diào)控，如分別由乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、 嗜 酸 乳 桿 菌（Lactobacillus acidophilus） 和 嗜 熱 鏈 球 菌（Streptococcus thermophilus）分泌的Nisin、ABP-118和Blp等均由QS系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控[36]。其中，乳酸乳球菌分泌的細(xì)菌素——乳鏈菌肽（Nisin）是研究最多的，Nisin前體被修飾并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，當(dāng)它作為信號(hào)分子達(dá)到閾值時(shí)，Nisin被雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)識(shí)別，最后開(kāi)始表達(dá)編碼細(xì)菌素的相關(guān)基因。當(dāng)組氨酸蛋白激酶NisK或反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白NisR被破壞時(shí)，Nisin不能合成[37]。當(dāng)編碼Nisin前體結(jié)構(gòu)基因nisA突變后，菌株無(wú)法合成Nisin[38]。有趣的是，在培養(yǎng)基中再加入少量乳鏈菌肽后，突變菌株恢復(fù)了合成乳鏈菌肽的能力，這一現(xiàn)象說(shuō)明乳鏈菌肽具有抗菌活性的同時(shí)還能誘導(dǎo)自身的合成，即具有自誘導(dǎo)肽功能。隨后又發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽的抗菌活性高，自誘導(dǎo)肽活性低，且是相對(duì)獨(dú)立的[39]。Renye JA等人[40]研究顯示，嗜熱鏈球菌ST109產(chǎn)生的細(xì)菌素是一種約5 000～6 000的熱穩(wěn)定肽，屬于QS誘導(dǎo)肽，當(dāng)編碼群體感應(yīng)誘導(dǎo)肽的blpC的缺失會(huì)導(dǎo)致抗微生物活性的喪失。Wayah SB等人[41]從椰子奶源里的戊糖乳桿菌CS2中分離出一種新型細(xì)菌素Pentocin MQ1，其生物合成受群體感應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)。它具有廣譜的抗菌活性，并且在針對(duì)藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的微摩爾濃度有效。它表現(xiàn)出高的化學(xué)、熱和pH穩(wěn)定性，但顯示出對(duì)蛋白質(zhì)水解酶敏感。賈芳芳等人[42]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌KLDS1.0391合成細(xì)菌素plantaricin受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝中分泌的信號(hào)分子AI-2達(dá)到閾值時(shí)，則會(huì)被HK所識(shí)別并經(jīng)磷酸化與去磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞給RR，使細(xì)菌素合成基因表達(dá)。

作者所在實(shí)驗(yàn)室基于自然和加菌兩種酸菜發(fā)酵體系，對(duì)副干酪乳桿菌HD 1.7（Lactobacillus paracaseiHD 1.7）合成細(xì)菌素paracin 1.7的機(jī)制進(jìn)行了研究。研究表明，外源添加副干酪乳桿菌HD 1.7的加菌發(fā)酵體系與白菜中自然存在的乳酸菌、大腸桿菌、腸膜明串珠菌等內(nèi)生菌群間通過(guò)傳遞細(xì)菌素作為信號(hào)分子引發(fā)群體感應(yīng)，以刺激細(xì)菌素的生成來(lái)完成種群調(diào)節(jié)，使主要的功能菌群乳酸菌的相對(duì)豐度能夠隨著發(fā)酵底物和發(fā)酵條件的變化始終占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

進(jìn)一步試驗(yàn)引入宏基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析酸菜發(fā)酵，在酸菜發(fā)酵這一特殊微生態(tài)體系中引入產(chǎn)細(xì)菌素和不產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌兩種干擾因素，研究復(fù)雜的各菌群時(shí)空分布，從DNA、RNA、酶3個(gè)層面互相印證，在天然發(fā)酵和加菌發(fā)酵條件下，探究微生物的時(shí)空分布并闡明干擾菌的加入對(duì)發(fā)酵體系原有群體效應(yīng)的影響，分析優(yōu)勢(shì)菌菌群變化與群體效應(yīng)的關(guān)系。

3.2 QS對(duì)乳酸菌共培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌素合成的調(diào)控

在產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌領(lǐng)域，已經(jīng)有一些研究集中于共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)菌素產(chǎn)生的特征，特別是這種相互作用的分子機(jī)制。細(xì)菌素誘導(dǎo)微生物與產(chǎn)生細(xì)菌素的微生物之間沒(méi)有明顯的關(guān)系，在某些情況下，AI-2的存在與共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)菌素表型相關(guān)[43]。Maldonado等人[44]對(duì)Lactobacillus plantarumNC8進(jìn)行純培養(yǎng)時(shí)是無(wú)法合成細(xì)菌素的，但當(dāng)其與革蘭氏陽(yáng)性菌的不同屬特定菌株共培養(yǎng)后，如羅伊氏乳桿菌DSM 20016，唾液乳桿菌NCFB 2747，LactococcuslactisMG1363等都可以誘導(dǎo)植物乳桿菌素NC8（plantaricin NC8）的產(chǎn)生，特別是當(dāng)與LactococcuslactisMG1363共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌素合成顯著提高，合成量高達(dá)2 560 IU/mL。MANLL等人[45]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L.plantarumKLDS1.0391與L.helveticusKLDS 1.9207共培養(yǎng)信號(hào)分子AI-2積累達(dá)到閾值時(shí)，它將被雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的組氨酸蛋白激酶識(shí)別，并且信號(hào)分子將被磷酸化或去磷酸化為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，最后編碼細(xì)菌素的相關(guān)基因表達(dá)，合成細(xì)菌素。張?bào)薜热薣45]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)外源添加信號(hào)分子AI-2可以誘導(dǎo)L.plantarumKLDS1.0391的細(xì)菌素合成，可顯著提高L.plantarumKLDS 1.0391細(xì)菌素編碼基因和群體感應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，參與碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝途徑雙組分調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著上調(diào)。葛菁萍等人[46]通過(guò)在不同細(xì)胞密度下接種副干酪乳桿菌HD 1.7（Lactobacillus paracaseiHD 1.7），確定了細(xì)菌素paracin1.7產(chǎn)生的閾值濃度為106 CFU/mL，基于這一特殊條件，以5種不同細(xì)胞密度的Lactobacillus paracaseiHD1.7分別與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（ATCC 117744）、大腸桿菌（ATCC 25922）、植物乳桿菌（ATCC 8014）、乳酸乳球菌（ATCC 11454）、釀酒酵母（ATCC 2601）進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明與枯草芽孢桿菌的進(jìn)行共培養(yǎng)后可以誘導(dǎo)更多的細(xì)菌素生成，繼而又將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物上清液進(jìn)行純化洗脫，發(fā)現(xiàn)了幾種15 000～45 000大小的多肽。因此，可以推定枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物上清液中存在作為群體感應(yīng)的信號(hào)分子才促進(jìn)了細(xì)菌素paracin 1.7的合成。

綜上所述，乳酸菌可通過(guò)自誘導(dǎo)或?qū)⒛承┨囟ň曜鳛楣才囵B(yǎng)環(huán)境中的刺激因素，啟動(dòng)乳酸菌的QS，從而調(diào)節(jié)細(xì)菌素的合成以實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率。由此也表明，QS在乳酸菌菌體生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)表達(dá)及細(xì)菌素合成的過(guò)程中扮演著重要的角色。

4 展望

環(huán)境中普遍存在的乳酸菌，其作為細(xì)菌素安全可靠的來(lái)源已在食品工業(yè)中受到重視，尤其是AI-2在人為調(diào)節(jié)下細(xì)菌素合成量變化中的潛在作用。然而，群體感應(yīng)作為一種環(huán)境變化響應(yīng)機(jī)制，在不同環(huán)境條件下，會(huì)出現(xiàn)不同的響應(yīng)，因此正向調(diào)控群體感應(yīng)，掌控影響AI-2在細(xì)胞中的生成機(jī)制并實(shí)現(xiàn)利用，還需我們繼續(xù)研究挖掘，以高效發(fā)揮乳酸菌細(xì)菌素對(duì)人類健康的推動(dòng)作用。