巨噬細(xì)胞極化中特異性分子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

王樂旬張盛昔吳惠娟韋曲星胡因銘郭姣

（廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心／廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／粵港澳聯(lián)合代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州510006）

巨噬細(xì)胞作為固有免疫的重要組成細(xì)胞，在器官發(fā)育、急慢性炎癥、機(jī)體抵抗病原體、組織修復(fù)和穩(wěn)態(tài)以及免疫調(diào)節(jié)等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用［1］。 巨噬細(xì)胞主要包括兩種：來源于胚胎期卵黃囊的組織定居巨噬細(xì)胞（tissue resident macrophages）和來源于外周血單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞（monocyte-derived macrophages）［2］。 極化（polarization）是巨噬細(xì)胞的重要特點(diǎn)。 根據(jù)其周圍的刺激不同，巨噬細(xì)胞可極化成具有不同表型和功能的細(xì)胞類型。 現(xiàn)在普遍接受的觀點(diǎn)是巨噬細(xì)胞可分為兩型，即M1 型和M2型，M2 又分為M2a、M2b 和M2c 3 個(gè)亞型［1，3］。

M1 型巨噬細(xì)胞，又稱為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（classical activated macrophages），可釋放大量的炎癥因子，具有抗血管形成、抗膠原蛋白合成以及清除病原體的作用［1，4-5］。 M2 型巨噬細(xì)胞，又稱選擇性活 化 的 巨 噬 細(xì) 胞 （ alternatively activated macrophages），可進(jìn)一步分為3 種：M2a 型巨噬細(xì)胞，又稱為損傷修復(fù)巨噬細(xì)胞（wound-healing macrophages），可產(chǎn)生多種抑炎因子，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、膠原蛋白形成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用；M2b 型巨噬細(xì)胞，又稱為調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞（regulatory macrophages），是一類新近發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞，以產(chǎn)生大量IL-10 為特征，具有強(qiáng)大的抑炎和免疫抑制作用；M2c 型巨噬細(xì)胞，也成為獲得性失活巨噬細(xì)胞（acquired deactivation macrophages），產(chǎn)生多種抑炎因子，發(fā)揮免疫抑制、促進(jìn)血管生成、膠原蛋白形成等作用，還具有細(xì)胞吞噬功能，清除死亡的細(xì)胞［1，4-6］。 盡管國內(nèi)外對(duì)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)行了深入的研究，現(xiàn)如今沒有被普遍接受的極化特征性的分子標(biāo)記［4］。

本研究利用骨髓來源的巨噬細(xì)胞，驗(yàn)證不同極化的誘導(dǎo)方法，并檢測不同極化狀態(tài)下的分子標(biāo)記以及相關(guān)信號(hào)通路，為巨噬細(xì)胞極化的體外實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10 周的雄性C57BL／6 小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。

1.2 試劑

F4／80-FITC 熒光抗體、CD206-APC 熒光抗體、CD38-APC 熒光抗體、青／鏈霉素、EDTA 溶液、雞卵清白蛋白（VOA）、VOA 抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 和羊抗兔IgG 購自Thermo Fisher Scientific 公司；封閉抗體anti-mouse CD16／32 為BioXcell 公司產(chǎn)品；LIGHT- Alexa Fluor 647 熒光抗體為R＆D Systems 公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco 產(chǎn)品；重組小鼠M-SCF、INFγ、IL-10、IL-13 和IL-4 為PeproTech 公司產(chǎn)品；紅細(xì)胞裂解液、LPS（O55：B5）購自Sigma-Aldrich 公司；GAPDH 抗體購自ProteinTech 公司；p-p65、p65、p-p38、p38、p-ERK 和ERK 抗體購自Cell Signaling Technology 公司；NC 膜為Millipore 公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光液為武漢聚能慧達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；RNAiso-Plus 試劑為TAKARA 公司產(chǎn)品；CXCL9、CXCL13、CCL17 和CCL1 的ELISA 試劑盒為上海吉泰依科賽生物科技有限公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自TOYOBO 公司；蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、Western 細(xì)胞裂解液為上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

LightCycler 480 熒光定量PCR 儀為Roche 公司產(chǎn)品；5810R 低溫離心機(jī)為Eppendorf 公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000 核酸濃度測定儀為Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；CytoFlex 流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品；Mithras LB-940 酶標(biāo)儀購自德國Berthold公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀為Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.4 骨髓細(xì)胞的提取

小鼠骨髓提取過程詳見參考文獻(xiàn)［7］。

1.5 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)

用含有青／鏈霉素及10%（φ）的FBS 的DMEM培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后，將未貼壁的細(xì)胞離心，重懸于含有雙抗、10 ng／mL的M-CSF 和10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。 M-CSF 誘導(dǎo)7 d 后，用0.2%的EDTA 消化細(xì)胞；然后常溫1 500 r／min，離心5 min；不含血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；按1.0×106個(gè)／孔，進(jìn)行種板；待細(xì)胞貼壁后（6 ～8 h），參照巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)的方法［1，5］：M0：不加任何刺激因子；M1：100 ng／mL LPS ＋10 ng／mL INF-γ；M2a：20 ng／mL IL-4＋10 ng／mL IL-13；M2b：100 ng／mL LPS＋50 ng／mL 免疫復(fù)合物（IC，VOA 15 μg／mL＋VOA 抗體150 μg／mL，37 ℃孵育30 min）；M2c：10 ng／mL IL-10，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h 或48 h，收集培養(yǎng)上清、mRNA 和蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的檢測和實(shí)驗(yàn)。

1.6 Q-PCR 檢測細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)

mRNA 提取過程詳見參考文獻(xiàn)［8］。 引物由Invitrogen 上海公司合成，序列見表1。 按照Q-PCR試劑盒進(jìn)行加樣、上機(jī)運(yùn)行。GAPDH作為內(nèi)參，將所得Ct值按2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.7 Western blot 檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞蛋白，按照蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜上，用5%BSA（TBST 稀釋）封閉，孵育相應(yīng)蛋白的一抗（p38、ERK、p65、p-p38、p-ERK、p-p65、GAPDH，按照1 ∶1 000稀釋），TBST 洗滌3次，孵育二抗（山羊抗兔，按照1 ∶10 000稀釋），TBST 洗膜4 次，ECL 發(fā)光液顯色，膠片于暗室中曝光，晾干膠片，掃描分析。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測

收集骨髓細(xì)胞、M-CSF 刺激的巨噬細(xì)胞或不同型別的巨噬細(xì)胞，用PBS 洗滌后，加入抗體結(jié)合緩沖液100 μL 和封閉抗體5 μL，振蕩混勻，靜置15 min。 然后分3 組加入抗體：F4／80 組加入1 μL F4／80 抗體，ISO 組加入1 μL 同型對(duì)照抗體，Con 組不加抗生素抗體，混勻后室溫避光孵育20 min，離心，PBS 洗滌1 次，用300 μL 的PBS 重懸，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示。 樣本數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用H檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Q-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

2 結(jié)果

2.1 原代骨髓巨噬細(xì)胞的驗(yàn)證

首先對(duì)骨髓原代細(xì)胞進(jìn)行流式分析，以驗(yàn)證原代細(xì)胞中巨噬細(xì)胞所占的比例。 結(jié)果如圖1 所示，誘導(dǎo)前巨噬細(xì)胞指征性分子（F4／80）陽性率很低，為（4.39±2.33）%。 經(jīng)過M-CSF 7 d 的誘導(dǎo)，骨髓細(xì)胞絕大部分都分化成了巨噬細(xì)胞，F(xiàn)4／80 陽性率為（91.4±5.65）%。 這表明原代骨髓細(xì)胞在M-CSF 誘導(dǎo)下分化成了巨噬細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

2.2 巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)

對(duì)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)12 h，然后通過Q-PCR 檢測不同誘導(dǎo)方式下巨噬細(xì)胞特異性分子的mRNA 水平變化。 結(jié)果如圖2 所示，LPS＋I(xiàn)NF-γ 處理組能夠顯著誘導(dǎo)CXCL9 mRNA 水平的增加；IL-4＋I(xiàn)L-13 處理組能夠顯著刺激CCL17 mRNA 的轉(zhuǎn)錄；LPS＋I(xiàn)C 處理組能夠顯著增加CCL1 和IL-10 的mRNA 水平；IL-10 的處理能夠刺激CXCL13 mRNA 的增加。

蛋白水平上，培養(yǎng)上清中CXCL9 的水平在LPS＋I(xiàn)NF-γ 處理組中最高，IL-4＋I(xiàn)L-13 組能顯著增加上清中CCL17 的蛋白水平，LPS＋I(xiàn)C 組能夠刺激CCL1蛋白的表達(dá)和分泌，IL-10 處理組能夠增強(qiáng)CXCL13的蛋白表達(dá)（圖3）。 此外，上清中的IL-10 的水平在LPS＋I(xiàn)C 處理組中是最高的（圖3）。

圖1 流式檢測原代巨噬細(xì)胞的比例Figure 1 Proportion of primary macrophages tested by flow cytometry

圖2 不同處理對(duì)巨噬細(xì)胞中相關(guān)分子mRNA 水平的變化的影響Figure 2 Changes of mRNA levels of related molecules in macrophages by different treatments

2.3 巨噬細(xì)胞極化的表面分子分析

結(jié)果如圖4 所示，LPS 能夠顯著誘導(dǎo)CD38 蛋白的表達(dá)并定位在細(xì)胞膜上。 本課題組也檢測了作為M2 巨噬細(xì)胞的常用分子標(biāo)記CD206 蛋白［1］。 結(jié)果顯示，IL-4＋I(xiàn)L-13 處理以及IL-10 處理能夠增強(qiáng)其表達(dá)。 另外，LPS＋I(xiàn)C 能夠刺激LIGHT 蛋白的表達(dá)（圖4）。 結(jié)果表明，在流式分析中，CD38 蛋白可作為M1 巨噬細(xì)胞特異性的分子標(biāo)記；LIGHT 蛋白可作為M2b 巨噬細(xì)胞特異性的分子標(biāo)記。

圖3 不同處理對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中相關(guān)分子蛋白水平的變化的影響Figure 3 Changes of protein levels of related molecules in macrophages by different treatments

圖4 流式細(xì)胞儀檢測不同型別巨噬細(xì)胞中表面分子的表達(dá)Figure 4 Expressions of surface molecules in different macrophage subtypes by flow cytometry

2.4 不同刺激對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響

對(duì)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果如圖5 所示，LPS＋I(xiàn)NF-γ 以及LPS＋I(xiàn)C 能夠誘導(dǎo)p38 的活化；ERK蛋白在LPS＋I(xiàn)C 處理下被激活；磷酸化的p65 蛋白在LPS＋I(xiàn)NF-γ 處理組中表達(dá)最高。

圖5 不同刺激對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響Figure 5 Effect of different stimulation on cell signaling pathway

3 討論

巨噬細(xì)胞因其在器官發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持、組織修復(fù)、抵抗病原菌和腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面扮演著重要作用而備受關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)［2］。 鑒于巨噬細(xì)胞幾乎存在于所有的組織器官中［2］，近年來的研究不僅從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)揭示其極化狀態(tài)及功能，還從體外實(shí)驗(yàn)中研究其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。 在體外實(shí)驗(yàn)中，LPS＋I(xiàn)NF-γ 誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞，IL-4＋I(xiàn)L-13誘導(dǎo)M2a 型巨噬細(xì)胞，LPS＋I(xiàn)C 誘導(dǎo)M2b 型巨噬細(xì)胞以及IL-10 誘導(dǎo)M2c 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)方法是主流的極化方法［1，3-5，7］。 本研究證實(shí)，在體外實(shí)驗(yàn)中，CXCL9 和CD38 蛋白主要在M1 巨噬細(xì)胞中表達(dá)，CCL17 主要在M2a 巨噬細(xì)胞中表達(dá)，CCL1 和LIGHT 蛋白主要在M2b 巨噬細(xì)胞中表達(dá)， 而CXCL13 主要在M2c 巨噬細(xì)胞中表達(dá)。

CXCL9 屬于CXC 趨化因子家族成員，可由包括巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞合成和分泌，與靶細(xì)胞上的受體CXCR3 結(jié)合，在免疫細(xì)胞趨化中起重要作用［9-10］。M1 巨噬細(xì)胞可大量合成和分泌CXCL9，但考慮到其他細(xì)胞也可分泌CXCL9，在體內(nèi)研究中一般不將CXCL9 作為M1 的分子標(biāo)記［1，5，11］。 本研究證實(shí)，和其他幾個(gè)組相比，在LPS ＋I(xiàn)NF-γ 聯(lián)合誘導(dǎo)組中，CXCL9 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平都顯著升高。 這表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，CXCL9 可指示巨噬細(xì)胞向M1 型方向極化。 和CXCL9 一樣，CXCL13 也屬于CXC 趨化因子家族成員，可由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等分泌，可與炎癥免疫細(xì)胞上表達(dá)的CXCR5 結(jié)合，調(diào)控靶細(xì)胞的功能及趨化［12］。 文獻(xiàn)報(bào)道M2c 巨噬細(xì)胞可分泌大量的CXCL13，并將其作為M2c 細(xì)胞的分子標(biāo)記［1，4，11］。 本研 究 結(jié) 果 證 實(shí)，和 其 他 處 理 組 相 比，CXCL13 在IL-10 處理中的mRNA 和蛋白水平是最高的。

CCL1 是第1 個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CC 趨化因子家族成員［1］。 除了單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞外，T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和DC 細(xì)胞都可以分泌CCL1［1］。 有研究顯示，CCL1 不僅是M2b 巨噬細(xì)胞特異性分泌，而且也是其維持極化狀態(tài)的關(guān)鍵因子［1，13］。 在本研究中，和其他幾個(gè)處理組相比，LPS ＋I(xiàn)L 處理組中CCL1 的mRNA 和蛋白水平是最高的。 另外，作為CC 趨化因子家族的另一成員，CCL17 可由巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌，與T 淋巴細(xì)胞上的CCR4結(jié)合，并誘導(dǎo)其趨化［14］。 研究顯示，M2a 巨噬細(xì)胞可大量分泌CCL17［5，15］。 在本研究中，和其他幾個(gè)處理相比，IL-4＋I(xiàn)L-13 處理組中CCL17 的mRNA 和蛋白水平是最高的。

LIGHT，又被稱為TNFSF14 或CD258，主要表達(dá)在T 淋巴細(xì)胞以及未成熟的DC 細(xì)胞上，發(fā)揮激活免疫細(xì)胞的作用［16］。 自從2006 年報(bào)道以來，越來越多的研究顯示在區(qū)別不同極化巨噬細(xì)胞時(shí)，LIGHT 蛋白是M2b 巨噬細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記［1，13，17-18］。 本研究證實(shí)LIGHT 蛋白主要是在M2b巨噬細(xì)胞中表達(dá)。 結(jié)果提示，在體外實(shí)驗(yàn)中區(qū)別不同型別巨噬細(xì)胞時(shí)，LIGHT 可以將M2b 巨噬細(xì)胞鑒定出來。

CD38 是表達(dá)在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞膜表面的一種蛋白分子，具有重要的生理和病理作用［19］。 最近研究顯示，在不同型別的巨噬細(xì)胞中，CD38 蛋白主要在M1 巨噬細(xì)胞中表達(dá)［5，20］。 流式結(jié)果證實(shí)，CD38 蛋白主要是在M1 型巨噬細(xì)胞中表達(dá)。 這提示CD38 蛋白可以作為M1巨噬細(xì)胞流式檢測的特異性分子標(biāo)記。

IL-10 是一種具有強(qiáng)大抑炎功能的細(xì)胞因子，作為區(qū)別M1 和M2 巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)記已被廣泛接受［1，3-4］。 但是，在高表達(dá)IL-10 的M2 巨噬細(xì)胞中，M2b 巨噬細(xì)胞表達(dá)量最高［5］。 另外，相對(duì)M2 巨噬細(xì)胞，M1 巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-10 的水平是降低的，但和M0 巨噬細(xì)胞相比，其表達(dá)IL-10 的水平也是升高的［5］。 本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。 這表明，如果單獨(dú)利用IL-10 鑒定其中一個(gè)型別，往往會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)。所以，如果想利用IL-10 作為巨噬細(xì)胞極化的一個(gè)分子標(biāo)記，最好和其他分子標(biāo)記一起使用。

綜上，在體外實(shí)驗(yàn)中從mRNA 水平或／和蛋白水平上檢測巨噬細(xì)胞的極化，可用CXCL9 作為M1 的特征性分子，CCL17 作為M2a 的特征性分子，CCL1 作為M2b 的特征性分子，CXCL13 作為M2c 的特征性分子；從流式檢測的角度，可用CD38 蛋白作為M1 的特征性分子，LIGHT 作為M2b 的特征性分子。