基于UPLC-Q-TOF-MS／MS 技術(shù)的丹參水提液全成分分析

陳嘉慧張雅心劉孟華任妍饒文婷江偉豪鄒威黃志勇周鳳華

（1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510515；3.湖南省婦幼保健院，湖南 長沙410008； 4.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州510630）

丹參來源于唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的作用［1］。 現(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有心血管保護(hù)作用［2］、抗癌［3］、神經(jīng)保護(hù)作用［4］等。 丹參的化學(xué)成分主要為水溶性物質(zhì)，并多具有酚酸型結(jié)構(gòu)，如丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛等；另含有多種脂溶性成分，主要為鄰醌型和鄰羥基對醌型，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參醌等；其他類成分如β-谷甾醇、鼠尾草酚、柳杉酚等；另外尚含有多種糖類成分，如葡萄糖、半乳糖及蔗糖。

目前，針對丹參的研究主要集中在單體成分藥理作用、臨床應(yīng)用、不良反應(yīng)等有關(guān)方面，缺乏關(guān)于丹參水提液中的成分研究集中報(bào)道。 本研究首次采用超高壓液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS／MS）對丹參水提液進(jìn)行分析，總結(jié)歸類其中的化學(xué)成分，對進(jìn)一步研究丹參成分作用、尋找丹參藥物靶點(diǎn)具有參考意義。

1 儀器與材料

丹參飲片（廣西玉林有田藥業(yè)有限公司，批號(hào)180701）由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院張宏偉教授鑒定；腺嘌呤（批號(hào)：A8626，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、腺嘌呤核苷（批號(hào)：A9251，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、原兒茶酸（批號(hào)：03930590，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%）、原兒茶醛（批號(hào)：D108405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96.5%）、咖啡酸（批號(hào)：C0625，質(zhì)量純度＞98%）、丹參酮ⅡA（批號(hào)：T4952，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、丹酚酸A（批號(hào)：97599，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97.5%）、丹酚酸B（批號(hào)：SML0048，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、丹參素（批號(hào)：SML0679，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自默克生命科學(xué)（上海）有限公司；甲醇、甲酸（分析純，廣州光華科技股份有限公司）；水為Millipore 超純水。

Agilent 1290 型高效液相色譜儀-6550Q-TOFMS／MS（美國Agilent 科技公司）；Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件以及MassHunter 色譜工作站；EYELA N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（埃郎科技國際貿(mào)易上海有限公司）；BT25S 型電子分析天平（廣州計(jì)量檢測技術(shù)研 究 院 檢 定 合 格， 編 號(hào) 20080775） 及 ELGA ClassicUV 超純水系統(tǒng)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱定丹參飲片15.0 g，量取100 mL 去離子水，用去離子水浸泡丹參飲片1 h，煎煮1 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到1 g／mL 的藥液。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品，精密稱定，加入甲醇制成各對照品質(zhì)量濃度為0.5 μg／mL 的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件及質(zhì)譜條件

色 譜 條 件： 色 譜 柱： ZORBAX ECLIPSE-C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～10 min，95%A；10 ～38 min，95% ～0%A；38 ～40 min，0%A）；流速為0.5 mL／min；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI 源），在正、負(fù)兩種模式下進(jìn)行掃描；干燥氣體積流量為14 L／min，干燥氣溫度為250 ℃，霧化氣壓力為241 kPa，裂解電壓為175 V，鞘氣流量為11 L／min，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣溫度為65 V，毛細(xì)管電壓為3 500 V，八級(jí)桿射頻電壓為750 V，噴嘴電壓為1 000 V，碰撞能量為20 V。

3 結(jié)果

3.1 丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

在國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，包括CNKI 數(shù)據(jù)庫、萬方資源數(shù)據(jù)庫、維普期刊數(shù)據(jù)庫、Pubmed、ScienceDirect、Web of Science 等檢索丹參成分的有關(guān)文獻(xiàn)，共總結(jié)了254 種丹參中的化學(xué)成分，建立包括化合物名稱、分子式、精確分子量、結(jié)構(gòu)式的丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

3.2 化合物的鑒定

利用Q-TOF-MS／MS 系統(tǒng)，按照保留時(shí)間的先后順序采集丹參水提液中各化學(xué)成分的相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。 對樣品溶液和對照品溶液進(jìn)行分析，得到了丹參水提液基峰離子流圖和對照品離子流圖。 通過總離子流圖及有關(guān)文獻(xiàn)信息，在正負(fù)離子模式下搜集質(zhì)譜信息，得到基峰離子見圖1 和圖2（偏差在±10內(nèi)）。 利用Qualitative Analysis 質(zhì)譜分析軟件以及MassHunter 色譜工作站得到化合物的精確分子量信息及化合物碎片信息，與已建立的丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)信息比對，根據(jù)各化合物一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息推測其裂解過程。 在正負(fù)離子模式下查找丹參化學(xué)成分，總計(jì)72 個(gè)成分，其中包括26 個(gè)酚酸類化合物、36 個(gè)二萜類化合物、5 個(gè)糖類化合物、3 個(gè)有機(jī)酸類化合物和2 個(gè)其他類化合物，見表1。

3.3 丹參水提液中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律解析

3.3.1 酚酸類化合物丹參水提液中鑒定出了26種酚酸類化合物，包括經(jīng)對照品鑒定的11 ～14 號(hào)峰丹參素、咖啡酸、原兒茶酸和原兒茶醛；根據(jù)準(zhǔn)確分子量，參考文獻(xiàn)的質(zhì)譜信息、碎片裂解規(guī)律推斷的阿魏酸（17 號(hào)峰），19～33 號(hào)峰丹酚酸F、異阿魏酸、丹酚酸U／T／H／I／B／D／L／J、丹酚酸A／B 同分異構(gòu)體、紫草酸、異丹酚酸C，和35 ～40 號(hào)峰的丹酚酸E、紫草酸單甲酯、丹酚酸A／C、丹酚酸B 同分異構(gòu)體和9″-Methyl salvianolate B。 其中丹酚酸類化合物分子常以丹參素和咖啡酸為結(jié)構(gòu)單元，形成不同的二聚體、三聚體、四聚體及鹽類衍生物等［41］。

通過化合物的質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)在負(fù)模式下，酚酸類化合物的裂解方式較規(guī)律，如以丹參素基團(tuán)形成的二聚體、三聚體化合物如丹酚酸A／B／C／D／E／F等，通常會(huì)脫去1 個(gè)C9H10O5分子，形成［M-HC9H10O5］-的分子碎片，說明有可能是以某一個(gè)化合物衍生而產(chǎn)生的一系列化合物；而以咖啡酸為基本結(jié)構(gòu)的如阿魏酸、異阿魏酸等則以丟失CO2和H2O基團(tuán)較為明顯。

現(xiàn)以化合物丹酚酸B 為例，結(jié)合參考文獻(xiàn)［44］與本研究鑒定的化合物來解析丹參水提液中酚酸類化合物的裂解規(guī)律。 總的來說，丹酚酸B 的降解機(jī)理較為復(fù)雜，其中可能涉及平行反應(yīng)和多個(gè)連串反應(yīng)［16，45］。 從本文結(jié)果看，丹酚酸B 可能先失去1 個(gè)C9H10O5分子得到m／z519.094 6 離子碎片后，再發(fā)生相同步驟得到m／z321.041 7 離子碎片；也可能是一次失去2 個(gè)C9H10O5分子得到了m／z321.041 7的離子碎片，見圖3。

3.3.2 二萜類化合物丹參水提液中的二萜類化合物主要是正模式下查找，共得到36 個(gè)化合物，其中有通過對照品鑒定為丹參酮ⅡA（70 號(hào)峰）；以及通過已建立的丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)中的質(zhì)譜信息比對推斷得到的3，4-二羥基苯基丙酸（15 號(hào)峰）、內(nèi)丹參酯（16 號(hào)峰）、Saprionide（18 號(hào)峰）、紫丹參丁素（34 號(hào)峰）和41 ～72 號(hào)化合物。 在多級(jí)裂解中，多先失去一分子H2O 而后連續(xù)失去CO 和CO2分子；A 環(huán)易開環(huán)裂解等［27］。

下面以丹參酮ⅡA 為例解析丹參二萜類化合物的裂解規(guī)律［46］，如圖4 所示。 丹參酮ⅡA 在裂解過程中易脫去1 個(gè)H2O 分子并繼續(xù)脫去CO 分子，進(jìn)而形成m／z277 和m／z249 的碎片。

圖1 正離子模式下丹參水提液基峰離子圖Figure 1 Base peak ion map of Danshen water extract under positive ion mode

圖2 負(fù)離子模式下丹參水提液基峰離子圖Figure 2 Base peak ion map of Danshen water extract under negative ion mode

表1 丹參水提液正負(fù)離子模式下的化學(xué)成分Table 1 1Summary of chemical constituents from Danshen water extract in both positive and negative ion modesN

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

圖3 丹酚酸B 質(zhì)譜裂解規(guī)律示意圖Figure 3 The fragment pathway of Salvianolic acid B

圖4 丹參酮ⅡA 裂解規(guī)律示意圖Figure 4 The fragment pathway of Tanshinone ⅡA

3.3.3 糖類丹參作為一種植物，含有較多糖類。根據(jù)已建立的丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)中糖類化合物的裂解規(guī)律［19］，發(fā)現(xiàn)糖類化合物多由C6H12O6分子組成單糖、二糖、三糖或四糖。 在丹參水提液中共發(fā)現(xiàn)了5 種糖類化合物，包括四糖（1 號(hào)峰）、單糖（2 號(hào)峰）、二糖（6、7 號(hào)峰）和三糖（9 號(hào)峰），未能推斷糖類的立體構(gòu)象。

3.3.4 有機(jī)酸類同時(shí)，丹參也含有豐富有機(jī)酸類化合物。 根據(jù)已建立的丹參成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)中的準(zhǔn)確分子量，推測丹參水提液中至少有3 種有機(jī)酸，包括枸櫞酸（3 號(hào)峰）、琥珀酸（5 號(hào)峰）和香草酸（10 號(hào)峰）。 該類化合物含有羧基基團(tuán)，因此在分子離子峰裂解過程中常丟失一分子

3.3.5 其他類經(jīng)對照品鑒定，分別鑒定出4 號(hào)峰、8 號(hào)峰為腺嘌呤和腺嘌呤核苷。

4 討論

丹參在臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、腎功能不全、肝炎等多種疾病。 丹參具有改善外周循環(huán)，提高機(jī)體缺氧能力［47］，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈與外周血管［48-49］，增加冠脈血流量，改善心肌收縮力等作用，臨床上常用于治療冠心病。 此外尚有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和保肝作用。 而丹參中的化學(xué)成分，如丹參酮ⅡA 近年來也被證實(shí)具有多種藥理作用，例如抗帕金森［50］、神經(jīng)保護(hù)［51］、骨骼保護(hù)［52］、抗感染［53］等作用；此外，丹參素能抗乙肝病毒［54］。

丹參的成分中有許多同分異構(gòu)體，如丹參酮I和丹參酮ⅡB、丹酚酸A／B／C／D／E／F／G 等，以及手性化合物，其立體構(gòu)型變化多樣。 在不同溶劑當(dāng)中可能被檢測到的成分結(jié)構(gòu)也不一而足。 本研究通過UPLC-Q-TOF-MS／MS 法，首次分析了丹參水提液中所含有的化學(xué)成分，較傳統(tǒng)方法具有更高的分離度、速度和靈敏度，基本闡明了當(dāng)中的組成，對于丹參水提物成分研究、鑒定有一定價(jià)值。 然而，本文方法也有一定的局限性，未能夠準(zhǔn)確鑒定出各同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，還有一些化合物未能準(zhǔn)確鑒定。 在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)建立定量結(jié)構(gòu)分析的結(jié)構(gòu)鑒定方法，更準(zhǔn)確地分析其中的成分。