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    高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法拆分愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體

    2020-03-20 10:44:50翟明翚陳志偉蘇立強(qiáng)
    分析科學(xué)學(xué)報(bào) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:甘油醚性藥物三乙胺

    翟明翚 韓 爽 王 穎 陳志偉 蘇立強(qiáng)*

    (齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院黑龍江齊齊哈爾 161006)

    手性藥物已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、抗腫瘤、抗病毒及基因工程方面,因此手性藥物是現(xiàn)在國(guó)際新藥市場(chǎng)研究與開發(fā)的一個(gè)重要的方向。但是手性藥物因其對(duì)映異構(gòu)體與相應(yīng)受體的相互作用能力不同,使手性藥物表現(xiàn)出不同的生物活性,可能會(huì)給藥物的療效帶來(lái)不利的影響。為了減少手性藥物對(duì)人體產(chǎn)生的代謝負(fù)擔(dān)或可能產(chǎn)生的毒副作用,對(duì)手性藥物進(jìn)行拆分研究是現(xiàn)在手性藥物研究的重大課題和關(guān)注熱點(diǎn)[1]。

    圖1 愈創(chuàng)甘油醚化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of guaifenesin

    愈創(chuàng)甘油醚(Guaifenesin),化學(xué)名稱為3-(2-甲氧基苯氧基)丙烷-1,2-二醇,該藥能祛痰鎮(zhèn)咳,是多種止咳藥的主要有效成分[2],可治療急性呼吸道感染[3]、支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫、矽肺等病[4]。愈創(chuàng)甘油醚是一種手性藥物,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。臨床上該藥以消旋體形式給藥,關(guān)于此藥的拆分方法僅見(jiàn)毛細(xì)管電色譜法[5-7]。

    毛細(xì)管電色譜法拆分效果好,但是所使用電泳儀價(jià)格昂貴,不易普及。高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法,使用普通液相色譜儀和常規(guī)色譜柱,更容易普及。本文選用沒(méi)有毒性的羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)作為手性添加劑,使用C18色譜柱,采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體進(jìn)行了拆分研究,在優(yōu)化色譜條件下,對(duì)映體達(dá)到基線分離。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    P200Ⅱ高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司),附Echrom98色譜工作站、UV200Ⅱ紫外檢測(cè)器、P200Ⅱ高壓恒流泵;SK1200超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);HI 98128便攜式酸度計(jì)(上海加惠儀器儀表有限公司)。

    色譜純甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);β-環(huán)糊精(β-CD)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司);羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)實(shí)驗(yàn)室制備;超純水由GWB-2超純水器(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)制備。

    愈創(chuàng)甘油醚(武漢祥和化工有限公司)。

    1.2 樣品溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取愈創(chuàng)甘油醚0.0050 g,加水溶解后,轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中并定容至刻度,經(jīng)0.45 μm針筒過(guò)濾器過(guò)濾后備用,使用前超聲脫氣。

    1.3 色譜條件

    色譜柱:Hypersil ODS柱(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(體積比為15∶70∶15)。CM-β-CD的濃度為0.5 g/L,pH=4.26;流速為0.2 mL/min;三乙胺濃度為0.1%(V/V);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):226 nm;進(jìn)樣量:4 μL。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 手性添加劑的選擇

    環(huán)糊精類添加劑具有內(nèi)腔疏水、外腔親水的特性,體積大小合適的藥物對(duì)映體可進(jìn)入空腔與其發(fā)生包合作用,又因其內(nèi)部的手性識(shí)別能力[8],以及空腔邊緣的極性基團(tuán)的作用[9],藥物對(duì)映體與其形成穩(wěn)定性不同的非對(duì)映體包合物,產(chǎn)生的色譜行為差異使藥物對(duì)映體得到分離。本文分別考察了添加劑為β-CD和CM-β-CD時(shí)愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體的拆分情況,結(jié)果見(jiàn)圖2。從色譜圖中可以看出:添加劑為CM-β-CD(圖2(A))時(shí),愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體沒(méi)有分離,而添加劑為CM-β-CD(圖2(B))時(shí),愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體達(dá)到了基線分離。

    圖2 愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體在添加劑β-CD(A)和CM-β-CD(B)中分離色譜圖Fig.2 Guaifenesin separated by β-CD(A) and CM-β-CD(B) as mobile phase additivesdetection wavelength:226 nm;mobile phase:methanol∶acetonitrile∶water=15∶70∶15;pH=4.26;rate:0.2 mL/min.

    2.2 流動(dòng)相中CM-β -CD濃度對(duì)拆分的影響

    圖3 CM-β-CD濃度對(duì)分離的影響Fig.3 Effect of concentrations of CM-β-CD on the resolution

    一方面,藥物對(duì)映體與吸附在固定相上的CM-β-CD發(fā)生包合作用;另一方面,藥物對(duì)映體與游離的CM-β-CD發(fā)生包合作用,兩方面作用均形成非對(duì)映體包合物,從而產(chǎn)生色譜行為差異使藥物對(duì)映體得到拆分[10]。藥物對(duì)映體與CM-β-CD的主-客體作用是立體選擇性的,而且是可逆的。包合物的形成和擴(kuò)散存在一種平衡,CM-β-CD的濃度可影響這種平衡,進(jìn)而影響包合物穩(wěn)定常數(shù)的差異及其在固定相表面作用的差異,影響對(duì)映體的拆分效果,從圖3中可以看出CM-β-CD濃度的變化對(duì)分離度的影響。CM-β-CD濃度較低時(shí),形成的對(duì)映體包合物的穩(wěn)定性差,吸附作用弱,分離效果差;CM-β-CD濃度的增加,主客體之間的相互作用的機(jī)會(huì)增多,有利于增強(qiáng)它們之間的相互作用,立體選擇性增強(qiáng),形成的對(duì)映體包合物穩(wěn)定性的差異及吸附作用的差異擴(kuò)大,分離度Rs增大;當(dāng)CM-β-CD的濃度過(guò)高時(shí),游離的CM-β-CD吸附在固定相表面,與對(duì)映體包合物競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn),降低了包合物在固定相上的吸附作用,分離度下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CM-β-CD的最佳濃度為0.5 g/L。

    2.3 有機(jī)修飾劑對(duì)分離的影響

    有機(jī)修飾劑的極性影響CM-β-CD與對(duì)映體的包絡(luò)平衡[11],因此可以通過(guò)添加合適的有機(jī)修飾劑改變包合物的形成常數(shù),以改善分離。本實(shí)驗(yàn)選用甲醇和乙腈作為有機(jī)修飾劑,考察了不同配比的有機(jī)修飾劑對(duì)藥物對(duì)映體的拆分情況,結(jié)果見(jiàn)表1。相同的條件下,在不同的有機(jī)修飾劑中的分離效果不同,可能的原因是:乙腈對(duì)愈創(chuàng)甘油醚的洗脫能力較弱,CM-β-CD與藥物對(duì)映體形成的包合物的穩(wěn)定性增強(qiáng),色譜行為差異擴(kuò)大,藥物對(duì)映體分離效果好,但是CM-β-CD在乙腈含量較高的乙腈-水體系中的溶解度低,影響分離;甲醇的極性較強(qiáng),在乙腈-水體系中加入適量的甲醇,可以增加CM-β-CD在體系中的溶解度,藥物對(duì)映體與CM-β-CD發(fā)生包合作用的機(jī)會(huì)增多,并且保持流動(dòng)相的極性,改變了流動(dòng)相的洗脫能力[12],生成的非對(duì)映體絡(luò)合物保留值差異增大,分離度提高;在甲醇含量較多時(shí),甲醇進(jìn)入CM-β-CD空腔降低了疏水作用,使愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體被置換到水相中,不能形成穩(wěn)定的包合物,所以分離度較低;當(dāng)甲醇、乙腈、水的體積比分別為15∶70∶15和20∶70∶10時(shí),分離度Rs>1.5,拆分對(duì)映體藥物效果良好。但當(dāng)流動(dòng)相比例為20∶70∶10時(shí),對(duì)映體色譜峰出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。綜合考慮峰形和分離度,選擇流動(dòng)相中甲醇∶乙腈∶水=15∶70∶15進(jìn)行拆分。

    表1 流動(dòng)相中有機(jī)修飾劑對(duì)分離的影響Table 1 Effect of organic modifier on the resolution

    2.4 流動(dòng)相pH值對(duì)分離的影響

    pH值較低時(shí),CM-β-CD帶負(fù)電荷,愈創(chuàng)甘油醚含有可電離的羥基帶正電荷,pH值的變化影響它們的電離狀態(tài)。但是考慮到色譜柱的使用范圍,考察pH值范圍為3.50~4.50(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)pH值為4.26時(shí),CM-β-CD的羧甲基發(fā)生電離作用帶負(fù)電荷,愈創(chuàng)甘油醚的羥基帶正電荷,兩者產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電作用,手性識(shí)別能力最強(qiáng),形成的非對(duì)映體包合物的色譜行為差異最大,分離效果最好。

    2.5 三乙胺對(duì)分離的影響

    本實(shí)驗(yàn)使用三乙胺和冰HAc形成緩沖體系,調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,以達(dá)到提高分離度的目的。同時(shí),愈創(chuàng)甘油醚的醚鍵與C18柱上的硅羥基產(chǎn)生氫鍵,三乙胺作為改性劑,與C18柱上的硅羥基結(jié)合,可減少其拖尾[13],改善峰形,進(jìn)而改善分離。但是三乙胺濃度的增加,又會(huì)降低對(duì)映體包合物在固定相上的吸附,使分離度下降。在優(yōu)化的pH值條件下,考察了流動(dòng)相中三乙胺體積濃度在0.04%~0.12%范圍對(duì)于分離的影響(圖5),結(jié)果表明當(dāng)三乙胺含量為0.10%時(shí),分離度Rs最大。

    圖4 pH值對(duì)分離度的影響Fig.4 Effect of pH on the resolution

    圖5 三乙胺體積濃度對(duì)分離的影響Fig.5 Effect of volume concentrations of triethylamine on the resolution

    2.6 流速對(duì)分離的影響

    藥物對(duì)映體與手性添加劑CM-β-CD動(dòng)態(tài)包合的過(guò)程相對(duì)較慢,當(dāng)流速較快時(shí),游離的CM-β-CD和所形成的非對(duì)映體包合物在固定相上的吸附作用弱,愈創(chuàng)甘油醚與CM-β-CD形成的包合物穩(wěn)定性變差,導(dǎo)致分離效果不好;隨著流速的降低,保留時(shí)間延長(zhǎng),穩(wěn)定性增強(qiáng),吸附作用增強(qiáng),分離度提高,但速度過(guò)慢,擴(kuò)散作用又會(huì)帶來(lái)不利影響,使分離度降低。本文考察了0.1 mL/min至0.5 mL/min流速對(duì)分離的影響,結(jié)果表明當(dāng)流速為0.2 mL/min時(shí),分離效果最好。

    2.7 方法的重現(xiàn)性

    在優(yōu)化色譜條件下,重復(fù)進(jìn)樣5次,兩對(duì)映體保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.25%和0.27%,重現(xiàn)性好。

    3 結(jié)論

    本文通過(guò)優(yōu)化色譜實(shí)驗(yàn)條件,實(shí)現(xiàn)了愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體基線分離,成功建立高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法拆分愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體的方法,為該藥的進(jìn)一步研究,提供了一種有效的分離手段。該方法選擇性高,操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),容易普及,可廣泛應(yīng)用于手性藥物的拆分研究中。

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