金絲小棗多酚的提取及抗氧化性和抑菌活性研究

張兆英，王君，宋立立，張亞楠，李欣

(滄州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 滄州 061001)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中[1]，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗菌、抗動(dòng)脈硬化、降血糖等功效[2，3]。植物多酚的抑菌效果已成為研究熱點(diǎn)之一，植物多酚可作為天然的防腐劑添加到食品中，起到保鮮的效果。動(dòng)物性食品中的蛋白質(zhì)和脂肪可作為微生物的能量來源，動(dòng)物性食品更易滋生有害致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，將植物多酚作為天然防腐劑添加到魚肉、豬肉、牛肉羊肉及其制品中，能有效抑制細(xì)菌及真菌的生長，延緩食品品質(zhì)下降的速度，同時(shí)能保持食品的原有風(fēng)味[4，5]。植物多酚可作為純天然的調(diào)味品添加到醬鹵肉制品中，保持肉制品的色澤穩(wěn)定、鮮亮[6]。植物多酚還能作為調(diào)味品應(yīng)用于果汁、醬油、果醬等食品中，保持食品的顏色[7]。

棗(ZiziphusjujubaMill.)屬于鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物，與桃、李、栗、杏并稱為我國古代“五果”，是我國北方重要的果樹之一，其果實(shí)既可鮮食也可干食[8]。金絲小棗主要以干食為主，皮薄、肉厚、棗核小，是傳統(tǒng)的“藥食同源”食品。棗肉中營養(yǎng)豐富，含有大量糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分，同時(shí)，還含有豐富的多糖、多酚、黃酮、皂苷等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功能，是理想的營養(yǎng)保健品[9]。

目前，針對葡萄多酚、芒果多酚、茶多酚等研究較多[10-12]，關(guān)于金絲小棗多酚抑菌性的研究未見有報(bào)道。植物多酚的提取方法較多，超聲波輔助提取法是經(jīng)常被用到的方法之一，借助超聲波產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”，可以加速多酚的滲透速度[13]。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法提取金絲小棗中的多酚，并對其抗氧化性和抑菌活性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

滄州金絲小棗。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

福林-酚試劑、沒食子酸：南京都萊試劑公司，分析純；Tris、鄰苯三酚、水楊酸、FeSO4：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純；H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4：北京化工廠，分析純；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺溶液、NaNO2、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，分析純；濃鹽酸、無水乙醇：天津市北辰方正試劑廠，分析純；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉、根霉：滄州師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

GZX-9070MBE數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZKW-4電子恒溫水浴鍋、九陽料理機(jī)、AXTD4-低速離心機(jī)、723可見分光光度計(jì)、752紫外可見分光光度計(jì)、FS-250N超聲波清洗器、T-A1004N電子天平。

1.2 樣品預(yù)處理

將金絲小棗清洗干凈，烘干表面水分，切成棗片，于鼓風(fēng)干燥箱中，在溫度60 ℃下，烘干3～4 d后，每隔0.5 h稱重，至恒重即可。將烘干的棗片用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后過40目篩，獲得棗粉，密封干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.1 單因素試驗(yàn)

影響金絲小棗多酚提取的因素較多，針對超聲波輔助提取法，主要影響因素包括：提取劑濃度、超聲時(shí)間、料液比、超聲功率、超聲溫度，因此選擇這5個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)影響因素設(shè)置6個(gè)水平，見表1。

表1 單因素試驗(yàn)表Table 1 Single-factor experiment table

1.3.1.1 超聲時(shí)間

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取10，20，30，40，50，60 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復(fù)3次，取平均值，分析超聲時(shí)間與多酚提取量的關(guān)系。

1.3.1.2 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復(fù)3次，取平均值，分析乙醇濃度與多酚提取量的關(guān)系。

1.3.1.3 料液比

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復(fù)3次，取平均值，分析料液比與多酚提取量的關(guān)系。

1.3.1.4 超聲功率

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為90，120，150，180，210，240 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復(fù)3次，取平均值，分析超聲功率與多酚提取量的關(guān)系。

1.3.1.5 超聲溫度

準(zhǔn)確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，溫度為50，55，60，65，70，75 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復(fù)3次，取平均值，分析超聲溫度與多酚提取量的關(guān)系。

1.3.2 正交試驗(yàn)

選取超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲溫度這5個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)定4個(gè)水平(見表2)進(jìn)行L16(45)的正交試驗(yàn)。按照L16(45)正交試驗(yàn)表(見表3)進(jìn)行編號。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 3 The orthogonal experiment design

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

以沒食子酸為對照品，采用福林-酚法測定多酚含量[14]，稍作修改。精密稱取25 mg沒食子酸，用蒸餾水定容至250 mL，即可得到0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL于7支試管中，加入1.5 mL福林酚試劑，混勻，靜置5 min，加入3 mL 10% Na2CO3，搖勻后加蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應(yīng)1 h，在760 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2 金絲小棗多酚提取量測定

取4 mL的提取液，放置于25 mL容量瓶中，加入12 mL蒸餾水、1 mL福林-酚試劑，混勻，靜置5 min，加入5 mL 10%Na2CO3溶液，混勻后，用蒸餾水定容。40 ℃避光反應(yīng)1 h，在760 nm波長處測定吸光度值。

W=(C×V)/m。

式中：W為多酚提取量(mg/g)；C為提取液多酚濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；m為棗的質(zhì)量(g)。

1.4.3 清除亞硝酸根

取6支試管分別加入濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的多酚溶液2 mL，5 μg/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，然后放到37 ℃恒溫水浴鍋中。30 min后取出，加入0.4%的對氨基苯磺酸2 mL，混勻，放置5 min，再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺1 mL，加蒸餾水至20 mL，混勻，靜置15 min，于538 nm測其吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。

清除率(%)=1-(A1-A2)。

式中：A1為加入提取液后的吸光度值，A2為金絲小棗多酚樣品的吸光度值。

1.4.4 清除羥自由基

采用水楊酸法。取5 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL、10 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，混勻，分別加入濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的金絲小棗多酚提取液2 mL，最后加入2 mL的H2O2，37 ℃下水浴反應(yīng)30 min，于510 nm處測其吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。

清除率(%)=1-(A1-A2)。

式中：A1為加入提取液后的吸光度值，A2為金絲小棗多酚樣品的吸光度值。

1.4.5 清除超氧自由基

采用鄰苯三酚法。取5支試管，分別量取10 mL的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)緩沖溶液，在37 ℃恒溫下水浴反應(yīng)20 min；之后加入3 mL蒸餾水和4 mL濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的多酚提取液，搖勻，立即加入已預(yù)熱的鄰苯三酚1 mL，用0.01 mol/L HCl為參比，于325 nm測吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。

清除率(%)=(A0-A1)/A0。

式中：A0為空白對照(不加提取液)的吸光度值，A1為加入提取液后的吸光度值。

1.5 抑菌試驗(yàn)

1.5.1 菌種的活化

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)12 h；將曲霉、根霉分別接種到土豆蔗糖培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)2～3 d[15]。

1.5.2 抑菌效果測定

用打孔器將濾紙打成直徑為10 mm 的圓片，將其滅菌，備用。將活化后的不同菌種分別接種到培養(yǎng)基中，設(shè)3次重復(fù)。將金絲小棗多酚原液用無菌水稀釋為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 mg/mL不同濃度的稀釋樣品，將滅菌的濾紙片浸入金絲小棗多酚稀釋液中30 min，然后用無菌鑷子取出，平鋪于已接種的培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置3個(gè)濾紙片，以無菌水作空白對照?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h，曲霉和根霉在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察抑菌效果[16，17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以沒食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，得到線性回歸方程為：Y=5.42X+0.0186，R2=0.9992。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of polyphenols

2.2 金絲小棗多酚的提取

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 超聲時(shí)間對金絲小棗多酚提取的影響

圖2 超聲時(shí)間對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖2可知，在超聲時(shí)間為10～40 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長，金絲小棗多酚提取量呈現(xiàn)上升的趨勢；在超聲時(shí)間為40～60 min時(shí)，多酚提取量下降。超聲時(shí)間為40 min時(shí)，多酚提取量最高，為10.95 mg/g。因而，選取40 min作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲時(shí)間。

2.2.1.2 乙醇濃度對金絲小棗多酚提取的影響

圖3 乙醇濃度對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖3可知，在乙醇濃度為40%～50%時(shí)，金絲小棗多酚提取量緩緩上升；當(dāng)濃度為50%～90%時(shí)，多酚提取量急劇下降；乙醇濃度為50%時(shí)，多酚提取量達(dá)到最高，為11.15 mg/g。因此，選取50%作為金絲小棗多酚提取的最佳乙醇濃度。

2.2.1.3 料液比對金絲小棗多酚提取的影響

圖4 料液比對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.4 The effect form solid-liquid ratio on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35時(shí)，金絲小棗多酚提取量分別為10.35，11.80，9.75，7.75，7.10，5.70 mg/g。即在料液比為1∶15時(shí)，金絲小棗多酚提取量最高。因此，選取1∶15作為金絲小棗多酚提取的最佳料液比。

2.2.1.4 超聲功率對金絲小棗多酚提取的影響

圖5 超聲功率對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖5可知，當(dāng)超聲功率為90～150 W時(shí)，金絲小棗多酚提取量逐漸上升；當(dāng)超聲功率為150～240 W時(shí)，金絲小棗多酚提取量呈現(xiàn)平緩的下降。在超聲功率為150 W時(shí)，金絲小棗多酚提取量最高，為11.85 mg/g。因而，選取150 W作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲功率。

2.2.1.5 超聲溫度對金絲小棗多酚提取的影響

圖6 超聲溫度對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.6 The effect of ultrasonic temperature on polyphenolsextraction from Ziziphus jujuba

由圖6可知，當(dāng)超聲溫度為50～55 ℃時(shí)，金絲小棗多酚提取量逐漸增加；在超聲溫度為55～75 ℃時(shí)，多酚提取量下降。在超聲溫度為55 ℃時(shí)，金絲小棗多酚提取量達(dá)到12.05 mg/g。所以，選取55 ℃作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲溫度。

2.2.2 正交試驗(yàn)

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiment

由表4正交試驗(yàn)結(jié)果可知，超聲波輔助法提取金絲小棗多酚的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間30 min、乙醇濃度50%、料液比1∶15、超聲功率210 W、超聲溫度50 ℃，此條件下，金絲小棗多酚提取量為12.45 mg/g。5個(gè)因素對多酚提取量的影響程度不同，因素主次順序?yàn)椋毫弦罕?乙醇濃度>超聲功率>超聲溫度>超聲時(shí)間。

2.3 金絲小棗多酚的抗氧化性試驗(yàn)

2.3.1 清除亞硝酸根

由圖7可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除亞硝酸根的能力增強(qiáng)；當(dāng)多酚濃度為0.20 mg/mL時(shí)，清除能力最強(qiáng)，對亞硝酸根的清除率最高，為99.8%；當(dāng)多酚濃度為0.25 mg/mL時(shí)，其清除率略有下降。

圖7 多酚濃度對清除亞硝酸根的影響Fig.7 The effect of polyphenols concentration on scavenging of nitrite

2.3.2 清除羥自由基

圖8 多酚濃度對清除羥自由基的影響Fig.8 The effect of polyphenols concentration on scavenging of hydroxyl radicals

由圖8可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除能力逐漸增強(qiáng)；在多酚濃度為0.15 mg/mL時(shí)，其對羥自由基的清除率達(dá)到99.3%。當(dāng)金絲小棗多酚濃度大于0.15 mg/mL時(shí)，其清除能力隨多酚濃度的增加變化平緩。

2.3.3 清除超氧自由基

圖9 多酚濃度對清除超氧自由基的影響Fig.9 The effect of polyphenols concentration on scavenging of superoxide free radicals

由圖9可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其對超氧自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)金絲小棗多酚濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL時(shí)，其清除率分別為44.30%、49.70%、53.90%、53.50%、54.10%。

2.4 金絲小棗多酚抑菌活性試驗(yàn)

植物多酚能夠破壞微生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使膜的流動(dòng)性降低，通透性增加，對微生物的細(xì)胞形態(tài)造成不可逆的改變，從而起到殺菌的作用[18-20]。

表5 不同濃度金絲小棗多酚提取液抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of polyphenol extract with different concentration from Ziziphus jujuba

注: “-”表示無抑菌效果，菌落正常生長。

由表5可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，抑菌圈逐漸加大，表明金絲小棗多酚的抑菌能力與其濃度相關(guān)。金絲小棗多酚對4種菌均有抑制效果，抑制作用大小順序?yàn)椋呵?枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>根霉。金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉3種菌的最小抑菌濃度為0.15 mg/mL；對根霉的最小抑菌濃度為0.20 mg/mL。金絲小棗多酚對細(xì)菌和真菌都有不同程度的抑制作用。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取金絲小棗多酚，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到金絲小棗多酚的最佳提取工藝：超聲時(shí)間30 min、乙醇濃度50%、料液比1∶15、超聲功率210 W、超聲溫度50 ℃，此條件下多酚提取量為12.45 mg/g。影響金絲小棗多酚提取的因素主次順序?yàn)椋毫弦罕?乙醇濃度>超聲功率>超聲溫度>超聲時(shí)間?？寡趸栽囼?yàn)顯示，金絲小棗多酚對亞硝酸根、羥自由基和超氧自由基具有清除作用，并且，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除能力增強(qiáng)。通過抑菌試驗(yàn)可以看出，金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉、根霉4種菌都有不同程度的抑制作用，且抑制效果隨金絲小棗多酚濃度的增加而更加明顯。說明金絲小棗多酚對真菌和細(xì)菌都能起到抑制作用。金絲小棗多酚可作為天然的防腐劑添加到動(dòng)物性食品中，延長食品的保鮮期，亦可作為調(diào)味品添加到果汁、糕點(diǎn)等食品中，保持食品的色澤穩(wěn)定。