秀麗莓莖、葉中原花青素測(cè)定

朱甜甜，胡 玲，童金枝，趙金亮，金 勇，童 麗，孫 敏*

（1.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海西寧 810001）

秀麗莓（Rubus amabilis Focke）屬于薔薇科懸鉤子屬植物，主要分布于青海、甘肅、陜西等地，資源非常豐富，在藏藥中被稱為“甘扎嘎日”，具有清熱解毒的功效，藏醫(yī)典籍《月王藥診》《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》中均有記載。有研究［1-5］表明秀麗莓植物中含有多種化學(xué)成分，主要包括黃酮、萜、鞣質(zhì)，以及少量醌、有機(jī)酸、生物堿等。原花青素是一類(lèi)有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類(lèi)黃酮物質(zhì)，起初稱為黃烷醇類(lèi)或歸于縮合鞣質(zhì)，廣泛存在于各種植物的果皮、種子或果核中，如:葡萄籽、銀杏葉、藍(lán)莓、黑莓等植物。大量研究［6-10］表明原花青素具有抗氧化和自由基清除、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射等藥理學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于各類(lèi)保健食品與化妝品中。原花青素通常是由兒茶素或表兒茶素等單體聚合而成。目前測(cè)定原花青素的方法有多種，如鹽酸-正丁醇法、紫外分光光度法、原子吸收法、鐵鹽催化法［11］、鉬酸銨分光光度法［12］、4- 二甲基氨基肉桂醛（4-Dimethylaminocinnamaldehyde DMAC）法［13］、香草醛 - 強(qiáng)酸法［14］等，由于這些方法反應(yīng)原理不同，有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。因此本研究比較了常用的測(cè)定方法，香草醛法和DMAC法測(cè)定秀麗莓莖、葉中原花青素含量，尋找適合秀麗莓中原花青素的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）秀麗莓于2018年采自青海果洛；兒茶素，純度＞98%（上海麥克林生化科技有限公司）；原花青素B2，純度＞98%（合肥博美生物科技責(zé)任有限公司）；香草醛（上海展云化工有限公司）；DMAC（上海麥克林生化科技有限公司）。鹽酸、硫酸、甲醇、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

（2）UV5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；BS-224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Gynergy HI多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。取兒茶素粉末，以91%乙醇為溶劑，配制成濃度為1 mg/mL，稀釋至2、4、6、8、10 μg/mL 和50、100、150、200、250 μg/mL 分別作為 DMAC 法和香草醛法的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。取原花青素B2，以91%乙醇為溶劑，配制成濃度為1 mg/mL，稀釋至15、30、45、60、75 μg/mL 和150、225、300、375、450 μg/mL 分別作為 DMAC 法和香草醛法的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 秀麗莓莖、葉提取液的制備

秀麗莓莖或葉粉碎，過(guò)40目篩，精準(zhǔn)稱取1 g莖或葉，分別用20 mL丙酮—水（1∶1）浸泡混勻，室溫下超聲30 min，離心取上清，濾渣再加入10 mL丙酮—水（1∶1）超聲30 min離心取上清，合并兩次上清，定容至50 mL。

1.2.3 原花青素含量計(jì)算

原花青素提取量計(jì)算公式:

原花青素提取量（mg/g）=（V×D ×C）/（1 000×S）

式中:V為秀麗莓莖或葉提取液體積（mL）；D為提取液稀釋倍數(shù)；C為樣品提取液的質(zhì)量濃度（mg/mL）；S 為秀麗莓質(zhì)量（g）。

1.2.4 DMAC法

（1）DMAC溶液（0.1%）的配制。以濃鹽酸—蒸餾水—乙醇（91%）按照25∶25∶150（V/V）的比例配制酸性乙醇，該溶液在18～25℃下可以穩(wěn)定一年。精密稱量0.05 g DMAC加入50 mL酸性乙醇，該試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2）DMAC法測(cè)定。取70μL的標(biāo)準(zhǔn)品或者適當(dāng)稀釋的原花青素提取液和210μL DMAC溶液加入到96孔板，放置提前設(shè)置好的酶標(biāo)儀中，在25℃、640 nm波長(zhǎng)［13］下掃描45 min內(nèi)的吸光值，掃描間隔為1 min，摸索最佳孵育時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 香草醛法

（1）顯色劑的配制。均以甲醇為溶劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 mg/mL的香草醛溶液和體積分?jǐn)?shù)為30%的濃硫酸。

（2）香草醛法測(cè)定。取標(biāo)準(zhǔn)品、適當(dāng)稀釋的原花青素提取液按表1分別配制成樣品組、樣品空白組、蒸餾水空白組。搖勻混合液，25℃下避光孵育20 min［14］，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)500 nm波長(zhǎng)［14-15］下測(cè)量吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 香草醛-硫酸法各組溶液配制量表Tab.1 Preparation of vanillin-sulfuric acid solution mL

2 結(jié)果與分析

2.1 DMAC與兒茶素和原花青素 B2生化反應(yīng)的適宜時(shí)間圖1為45 min內(nèi)DMAC與不同濃度兒茶素、原花青素B2反應(yīng)的吸光度隨時(shí)間變化曲線。由圖1可以看出，DMAC與兒茶素、原花青素B2在25～35 min內(nèi)吸光度數(shù)值比較穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)將以30 min為DMAC與兒茶素、原花青素B2的反應(yīng)時(shí)間。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用DMAC法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2a，得到的回歸方程:y=0.06x+0.029 1（R2=0.995 9）；以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2b，得到的回歸方程:y=0.008 6x+0.085 8（R2=0.997）。

用香草醛法測(cè)原花青素含量，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3a，得到的回歸方程:y=0.004 1x+0.006 6（R2=0.999 8）；以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3b，得到的回歸方程:y=0.001 7x+0.002（R2=0.993 8）。

2.3 原花青素含量的測(cè)定采用香草醛法與DMAC法分別測(cè)得秀麗莓莖、葉的吸光值并將該吸光值代入分別以兒茶素、原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程得到秀麗莓莖、葉中原花青素含量見(jiàn)表2。

表2 秀麗莓莖、葉中原花青素含量（n=3）Tab.2 The content of proanthocyanidins in stems and leaves of Rubus amabilis Focke（n=3）

由表2可以看出，香草醛法測(cè)得的原花青素含量明顯偏高。以兒茶素或者原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品，由DMAC法生成的縮合物摩爾吸光度均高于香草醛法生成的縮合物摩爾吸光度，即DMAC法的靈敏度要高于香草醛法。

2.4 香草醛法與DMAC法測(cè)原花青素反應(yīng)原理DMAC法測(cè)原花青素反應(yīng)原理（圖4），DMAC只與原花青素終端單元酚羥基反應(yīng)［15］，在640 nm處有最大吸收峰。香草醛法測(cè)定原花青素的原理（圖5）是基于酚醛縮合反應(yīng)，原花青素A苯環(huán)上化學(xué)活性較高，在濃酸的催化作用下，其上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮合而形成有色的正碳離子，可吸收可見(jiàn)光，使A環(huán)產(chǎn)生紅色的發(fā)光基團(tuán)，并于λ=500 nm處有最大吸收峰［16］。

3 討論與結(jié)論

原花青素通常是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素等單體縮合而成的聚合體。單體之間通過(guò)C4—C8或C4—C6鍵連接而成的聚合物稱為B型原花青素；單體之間通過(guò) C2—O—C5或C2—O—C7鍵連接而成的聚合物稱為A型原花青素［17］。由于原花青素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，即其單體具有多種異構(gòu)體，且聚合度不同而導(dǎo)致其含量難以測(cè)定［15］。本試驗(yàn)采用香草醛法和DMAC法測(cè)定秀麗莓莖、葉中原花青素含量，兩種方法反應(yīng)原理不同。由香草醛法測(cè)定原花青素的反應(yīng)原理可知香草醛還會(huì)與含有兒茶素單體的非原花青素物質(zhì)反應(yīng)，因此會(huì)導(dǎo)致測(cè)量值偏高。Payne等［18］分別從酚酸、黃酮類(lèi)、黃烷酮類(lèi)、黃酮醇、花色素、異黃酮、芪類(lèi)、黃烷醇中挑選一系列化合物與DMAC反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了DMAC與黃烷醇反應(yīng)的特異性。研究表明，DMAC法比香草醛法專一性強(qiáng)，靈敏性更強(qiáng)。喬洪翔等［19］測(cè)定銀杏葉制劑中原花青素含量，發(fā)現(xiàn)鹽酸—香草醛法測(cè)得銀杏葉制劑中原花青素含量大于真實(shí)值；黃文燁等［15］采用香草醛法和DMAC法測(cè)定山竹果皮、花萼、果肉中原花青素含量，發(fā)現(xiàn)香草醛法測(cè)得的原花青素含量是DMAC法的4倍左右，認(rèn)為香草醛法會(huì)使得測(cè)定結(jié)果偏高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明香草醛法測(cè)得原花青素含量均比DMAC法高。

本試驗(yàn)中分別采用兒茶素、原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品，由不同方法計(jì)算原花青素含量，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算所得的原花青素含量低于以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品的值。據(jù)文獻(xiàn)［18］報(bào)道，在同樣標(biāo)準(zhǔn)品濃度的條件下，由于DMAC與單體和低聚物的反應(yīng)不同，其中DMAC與原花青素B2反應(yīng)的吸光值比與兒茶素反應(yīng)的吸光值低，導(dǎo)致用兒茶素做標(biāo)準(zhǔn)品低估了樣品中原花青素含量，因此采用原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品。由此可知，以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品，采用DMAC法更適合作為檢測(cè)秀麗莓中原花青素含量。