人源豬鏈球菌19 株分離鑒定及毒力基因檢測

易雪麗， 袁朝原， 陳曉穎， 鄧 鷹， 譚 曇， 滕元姬， 羅 斌

豬鏈球菌病為人畜共患病，可通過豬傳人途徑傳播。豬鏈球菌根據(jù)其莢膜多糖抗原分為35個血清型，其中2型致病性最強，是人感染豬鏈球菌病的最主要病原[1]。人感染豬鏈球菌一般以散發(fā)病例多見，在我國多個省市均有散發(fā)病例報道[2-3]，但也曾有過罕見的大流行；1998年在江蘇江陰、2005年在四川資陽分別出現(xiàn)了2次2型豬鏈球菌病大流行，且表現(xiàn)出了罕見的“鏈球菌中毒性休克綜合征”，發(fā)病急驟，來勢兇險，病死率高[4]。2016年在廣西也有人感染豬鏈球菌疫情報道，共引起6例發(fā)病，1例死亡[5]。

豬鏈球菌的致病力主要取決于其毒力因子，對豬鏈球菌毒力因子的研究主要集中于單個毒力因子的致病性方面，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種豬鏈球菌毒力因子，包括莢膜多糖（cps2J）、溶菌酶釋放相關(guān)蛋白（mrp）、細(xì)胞外蛋白因子（ef）、纖粘連蛋白結(jié)合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gapdh）和毒力相關(guān)基因orf2等[6-8]。其中cps2J為主要毒力基因，同時也是豬鏈球菌2型的型特異性基因，可以作為鑒定豬鏈球菌2型的靶基因。目前上海、廣東和四川等地都有致病性豬鏈球菌毒力因子檢測相關(guān)報道[9-11]，百色地區(qū)尚未有相關(guān)報道。為了解本地區(qū)豬鏈球菌對常用抗生素的耐藥及其分子流行病學(xué)特征，本課題收集了右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015－2019年臨床分離的豬鏈球菌，檢測其對常用抗生素敏感性及其毒力基因攜帶情況，為本地區(qū)人感染豬鏈球菌病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源 收集我院2015－2019年從豬鏈球菌腦膜炎患者標(biāo)本中分離的豬鏈球菌19株。其中分離自血液4株，分離自腦脊液15株。所有菌株分離培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版進(jìn)行[12]，分離菌株于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 VITEK MS V3.0（法國生物梅里埃公司）；PCR儀（美國BioRad公司）；電泳及凝膠成像設(shè)備（美國BioRad公司）；哥倫比亞血瓊脂平皿購自鄭州安圖生物公司；純乙腈購自法國生物梅里埃公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國生物梅里埃公司提供；DL-96 STREP購自珠海迪爾生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR SuperMix購自Invitrogen公司；DNA Marker DL 2000購自寶生物工程（大連）有限公 司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定 使用VITEK MS V3.0實施基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)對菌株進(jìn)行鑒定。將菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用一次性接種環(huán)挑取適量細(xì)菌均勻涂布于VITEK MS靶板上，隨后加1 μL基質(zhì)溶液于樣品上，自然晾干。同時以ATCC 8739作為質(zhì)控菌株，采用VITEK MS IVD模式進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)采集和鑒定分析。

1.2.2 藥物敏感性試驗 按照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定豬鏈球菌對8種常用抗生素的敏感性，包括青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、萬古霉素、紅霉素、克林霉素，結(jié)果判讀參照CLSI M100 2019年版中草綠色鏈球菌判斷標(biāo) 準(zhǔn)。

1.2.3 毒力基因檢測 按照說明書使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取豬鏈球菌基因組DNA作為模板，參照文獻(xiàn) [13]合成特異性引物對豬鏈球菌的16S rDNA、cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh進(jìn)行擴增，引物相關(guān)序列及退火溫度見表1。采用50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增，擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min。取7號標(biāo)本擴增產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST比對分析，確定為目的基因后作為陽性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像后與陽性對照進(jìn)行比對，所出現(xiàn)條帶與陽性對照大小相同者為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定

19株菌株經(jīng)VITEK MS鑒定均為豬鏈球菌，鑒定正確率99%以上。

2.2 藥物敏感性試驗

19株豬鏈球菌對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松和萬古霉素100%敏感，對青霉素的敏感率為68.5%，對紅霉素、克林霉素100%耐藥。藥敏結(jié)果見表2。

2.3 毒力基因檢測

利用合成的特異性引物對提取的豬鏈球菌基因組DNA進(jìn)行擴增后，7號標(biāo)本在預(yù)期位置均出現(xiàn)條帶，見圖1。送擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示與GenBank中登記的目的基因100%同源，以7號標(biāo)本作為陽性對照。根據(jù)豬鏈球菌16S rDNA種特異性基因和6種常見毒力基因檢測結(jié)果顯示，19株均為豬鏈球菌，cps2J型特異性基因檢測結(jié)果顯示19株菌株中有16株均為豬鏈球菌2型。19株中有12株攜帶6個常見毒力基因，4株攜帶5個常見毒力基因，2株攜帶4個常見毒力基因，1株攜帶3個常見毒力基因。所有菌株均攜帶了ef與fbps這2個毒力基因。各樣本毒力基因擴增結(jié)果見表3。

表1 豬鏈球菌基因檢測引物及其產(chǎn)物大小Table 1 Primers used to detect genes in Streptococcus suis and expected product sizes

表2 19 株豬鏈球菌對常用抗生素的藥敏結(jié)果Table 2 Susceptibility of 19 strains of Streptococcus suis to common antibiotics（%）

圖1 毒力基因檢測擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Electrophoretic analysis of virulence genes in 1% agarose gel after PCR amplification

表3 豬鏈球菌毒力基因檢測結(jié)果Table 3 Results of virulence gene detection in Streptococcus suis

3 討論

人感染豬鏈球菌主要是接觸了感染豬鏈球菌的病豬、死豬，病原菌經(jīng)破損的皮膚和黏膜進(jìn)入體內(nèi)致使人感染豬鏈球菌，從事生豬屠宰的人員為豬鏈球菌病高發(fā)人群。豬鏈球菌感染人后以引起腦膜炎為主，患者大多有不同程度發(fā)熱，部分病例有意識障礙、腦膜刺激癥及休克等表現(xiàn)。該病起病急，病程兇險，病死率高且預(yù)后不良，部分病例有不同程度的聽力損害。根據(jù)臨床癥狀不同，將人感染豬鏈球菌分為普通型、腦膜炎型、休克型和混合型。桑福德抗微生物治療指南對于豬鏈球菌感染推薦治療方案為首選青霉素，次選萬古霉素或頭孢曲松；休克型患者常選用青霉素類和氨基糖苷類或喹諾酮類聯(lián)合抗感染以及人工呼吸機支持呼吸、中心靜脈壓監(jiān)測、積極擴容等；腦膜炎型患者更需在抗感染的同時積極降顱壓，給予激素以減輕粘連等治療[2]。

本課題采用了MALDI-TOF MS技術(shù)對19株分離株進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果顯示該技術(shù)可以準(zhǔn)確地鑒定出豬鏈球菌[14]。MALDI-TOF MS技術(shù)對微生物鑒定的理論基礎(chǔ)是將設(shè)備采集的未知樣品蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知菌種的圖譜進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)聚類分析，獲得鑒定結(jié)果[14]。該技術(shù)在細(xì)菌和酵母的鑒定方面已經(jīng)很成熟，同時因為該技術(shù)快速準(zhǔn)確，操作簡便且成本低，所以近年來在全國得到快速普及。隨著MALDI-TOF MS臨床應(yīng)用的普及，大大縮短了臨床病原微生物的鑒定報告時間，為臨床治療爭取了寶貴時間。19株豬鏈球菌的藥敏檢測結(jié)果顯示，所有分離株對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟和萬古霉素敏感率為100%，但是對青霉素的敏感率有所降低，特別應(yīng)注意的是對紅霉素和克林霉素100%耐藥。畜牧業(yè)一直極為關(guān)注豬鏈球菌對常用抗生素的耐藥性。蔡田等[15]研究結(jié)果顯示，豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率高達(dá)98.1%，大部分?jǐn)y帶ermB耐藥基因。胡軍勇等[16]研究結(jié)果同樣顯示豬鏈球菌對林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基呋喃類藥物的耐藥率均在90%以上。本研究結(jié)果與之相符，豬鏈球菌病為人畜共患病，人源分離豬鏈球菌對紅霉素及克林霉素的高耐藥性考慮源自于病豬。豬鏈球菌的致病力主要取決于其所攜帶的毒力因子，有研究結(jié)果顯示，攜帶mrp和ef是豬鏈球菌高致病性的標(biāo)志，本次毒力基因檢測顯示mrp攜帶率為84.2%，ef攜帶率為100%，這一結(jié)果與我國其他地區(qū)的報道相一致[11，17]。此外，fbps攜帶率為100%，要遠(yuǎn)高于李小軍[9]的報道。因此，本地區(qū)流行的豬鏈球菌主要以cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh型為主。

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，豬鏈球菌病的發(fā)生趨勢也呈明顯上升。因此及時掌握本地區(qū)致病性豬鏈球菌對常用抗生素的耐藥性及其毒力因子的流行病學(xué)，對于預(yù)防和控制大規(guī)模暴發(fā)豬鏈球菌病具有重要的意義。