龍井茶多酚提取物對(duì)小鼠肝Cyp450酶表達(dá)的影響

呂樂，任紅，孫海燕

1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 博士后創(chuàng)新基地，廣東深圳518055；2深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

茶葉有很好的抗氧化、抗腫瘤、改善心血管疾病等保健功能[1]。茶多酚是其主要活性成分，含量占茶葉干重的15%～30%，主要由兒茶素、黃酮類、酚酸類和花色素四大類物質(zhì)組成[2]。茶葉按照發(fā)酵程度和制法分為全發(fā)酵茶(如滇紅紅茶)、半發(fā)酵茶(如鐵觀音烏龍茶)和非發(fā)酵茶(如綠茶)[3]。Cyp450s廣泛存在于動(dòng)植物和微生物組織中，參與內(nèi)、外源性物質(zhì)代謝。臨床90%以上藥物的代謝都有Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6這四個(gè)亞型的參與[4]。小鼠和人的藥物代謝酶基因具有同源性，即小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22相當(dāng)于人Cyp3A4、Cyp1A2、Cyp2C9和Cyp2D6[5]。Cyp450s個(gè)體差異和變異性大，易受外源物質(zhì)影響[6]。我們前期研究顯示，鐵觀音茶多酚提取物能夠顯著改變小鼠肝Cyp450s的活性和表達(dá)[7]。2015年9月～2017年5月，我們以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，從基因和蛋白水平上，觀察不同劑量和不同給藥時(shí)長龍井茶多酚提取物對(duì)小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與動(dòng)物 二級(jí)龍井茶葉，購于杭州西湖，烘干，粉碎，過80目篩，常溫避光在干燥罐保存。SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠80只，7～8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041]，飼養(yǎng)條件為相對(duì)濕度50%～60%、溫度20～25 ℃，光照/黑暗各12 h。

1.1.2 試劑與儀器 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22多克隆兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Abcam公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；LightCycler 1.5熒光定量PCR儀(Roche公司)；電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、全自動(dòng)凝膠成像儀[Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]；Spectra Max M5e多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 龍井茶多酚的提取方法及成分檢測

1.2.1 龍井茶多酚提取方法 龍井茶多酚提取物的提取參照國家標(biāo)準(zhǔn)(GBT8313-2018)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件稍作調(diào)整：取20 g過篩的龍井茶粉末，按1∶25(w/v)的比例加入70 ℃預(yù)熱的70%甲醇，70 ℃水浴浸提30 min。浸提后，將體系冷卻至室溫，布氏漏斗抽濾，濾渣繼續(xù)重復(fù)浸提2次。合并3次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至濾液原體積的15%～20%，確保甲醇幾乎被除盡，濃縮液采用氯仿3∶1(v/v)萃取一次，分層后棄去氯仿層，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將水萃取層濃縮至原體積的5%，再用適量超純水復(fù)溶。10 000 r/min，低溫離心15 min，上清液冷凍干燥后，常溫避光干燥保存。采用Folin-Ciocalteu法[8]測定龍井茶多酚提取物中總多酚的含量為(123.68±3.39)沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g DW)。

1.2.2 龍井茶多酚成分檢測[9]采用HPLC法檢測龍井茶多酚提取物中的主要酚類物質(zhì)，其中含量較高的成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)288.83 μg/mg(占28.88%)、表沒食子兒茶素(EGC)57.74 μg/mg(占5.77%)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)42.08 μg/mg(占4.21%)、表兒茶素(EC)21.14 μg/mg(占2.11%)等。

1.3 龍井茶多酚提取物對(duì)小鼠肝Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37和Cyp2d22的影響觀察

1.3.1 以龍井茶多酚提取物不同劑量為分組的設(shè)計(jì) 取40只小鼠，隨機(jī)分為空白組、75 mg/kg組、150 mg/kg組、300 mg/kg組，每組10只。龍井茶多酚提取物組給予75、150、300 mg/(kg·d)灌胃，空白對(duì)照組給予超純水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃，各組連續(xù)灌胃7 d。

1.3.2 以龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長為分組的設(shè)計(jì) 取另外40只小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、7 d組、14 d組、28 d組，每組10只。7 d組、14 d組、28 d組以龍井茶多酚提取物150 mg/(kg·d)分別灌胃7、14、28 d，對(duì)照組給予超純水0.1 mL/(10 g·BW)灌胃28 d，在灌胃2 h之后正常進(jìn)食、飲水。

1.4 肝臟Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22 mRNA表達(dá)檢測 采用real-time PCR法。在末次灌胃2 h后處死各組小鼠，迅速分離肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血跡，濾紙拭干水跡，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。稱取-80 ℃凍存的小鼠肝臟組織約50 mg，按Takara UNIQ-10柱式TRIzol法提取總RNA，并測定總RNA濃度。按PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后采用SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行相對(duì)定量。肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，所有操作在冰上進(jìn)行。采用比較閾值法(2-ΔΔCt)法定量。引物序列[10～12]見表1。

表1 Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22引物序列

1.5 肝臟Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。稱取-80 ℃凍存的小鼠肝臟組織約80 mg，加入預(yù)冷的NP40裂解液1 mL，于冰上操作，F(xiàn)astPrep-24勻漿，4 ℃，12 000 r/min，30 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，將樣品蛋白濃度調(diào)整至5 mg/mL，按4∶1加入5×loading buffer，100 ℃加熱5 min，冰上冷卻，離心，混勻，分裝，-80 ℃放置備用。取出-80 ℃凍存的制備好的蛋白樣品，100 ℃再次加熱5 min。冰上冷卻混勻。制膠、上樣5 μL、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(GADPH、Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d22)孵育、二抗孵育、顯影成像。顯影后將所得的蛋白質(zhì)條帶用Image Lab 5.1軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。方差同質(zhì)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差齊性，方差齊時(shí)進(jìn)行單因素方差分析。單因素方差分析后采用LSD進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影響

2.1.1 對(duì)Cyp3a11 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，300 mg/kg組Cyp3a11 mRNA表達(dá)降低，75 mg/kg組、150 mg/kg組Cyp3a11蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。見圖1。

注：A為Cyp3a11的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp3a11的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

2.1.2 對(duì)Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，150 mg/kg組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)均增高(P<0.05)。見圖2。

2.1.3 對(duì)Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，150 mg/kg組、300 mg/kg組Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。見圖3。

注：A為Cyp1a2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp1a2的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖2 不同劑量龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.1.4 對(duì)Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，300 mg/kg組Cyp2d22 mRNA表達(dá)降低，150 mg/kg組、300 mg/kg組Cyp2d22蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。見圖4。

2.2 龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長對(duì)Cyp3a11、Cyp 1a2、Cyp2c37、Cyp2d22的影響

2.2.1 對(duì)Cyp3a11 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 Cyp3a11 與對(duì)照組相比，7 d組Cyp3a11 mRNA及蛋白表達(dá)均降低，28 d組Cyp3a11 mRNA及蛋白表達(dá)均增高(P均<0.05)。見圖5。

注：A為Cyp2c37的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp2c37的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖3 不同劑量龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：A為Cyp2d22的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp2d22的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖4 不同劑量龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.2.2 對(duì)Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 Cyp1a2 與對(duì)照組相比，7 d組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)均增高，28 d組Cyp1a2 蛋白表達(dá)增高(P均<0.05)。見圖6。

注：A為Cyp3a11的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp3a11的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖5 龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長對(duì)Cyp3a11 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：A為Cyp1a2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp1a2的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖6 龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長對(duì)Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.2.3 對(duì)Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 Cyp2c37 與對(duì)照組相比，7 d組Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。見圖7。

2.2.4 對(duì)Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 Cyp2d22 與對(duì)照組相比，7 d組Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)均降低，14 d組Cyp2d22 蛋白表達(dá)增高，28 d組Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)均增高(P均<0.05)。見圖8。

注：A為Cyp2c37的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp2c37的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較*，P<0.05。

圖7 龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長對(duì)Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：A為Cyp2d22的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為Cyp2d22的蛋白相對(duì)表達(dá)水平;與空白組比較，*P<0.05。

圖8 龍井茶多酚提取物不同給藥時(shí)長對(duì)Cyp2d22 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3 討論

茶葉是風(fēng)靡全世界的飲品，尤其受到東方人的喜愛。我國歷來就有“藥茶不能同食”的說法，但始終缺乏全面嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚摵蛯?shí)驗(yàn)依據(jù)。肝臟是藥物代謝的主要場所，肝藥酶是肝臟中藥物生物轉(zhuǎn)化或代謝的主要酶系。國內(nèi)外研究均顯示，Cyp450s變異性較大，易受外源物質(zhì)的誘導(dǎo)或抑制，從而使自身活性發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物代謝速度改變，引起藥效減弱以致治療失敗或藥效過強(qiáng)引起毒性[13]。因此，探明茶多酚對(duì)Cyp450s的誘導(dǎo)或抑制作用，闡明藥茶不能同食的原理，從而盡可能減少茶葉對(duì)藥物代謝的影響，保證臨床藥物濃度維持在安全有效的范圍內(nèi)有著重要的意義。

杭州西湖龍井是一種著名的綠茶，已有研究表明，與其他不同發(fā)酵程度茶葉相比，西湖龍井的綠茶多酚含量較高，其成分以兒茶素為主，主要含有EGCG、EGC、ECG、EC四種，其中尤以EGCG含量最高[1]。目前國內(nèi)外對(duì)綠茶多酚的研究主要集中在其抗氧化及抗腫瘤作用上，但對(duì)其影響肝藥酶進(jìn)而干擾同服底物藥物的代謝作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過給予小鼠不同劑量和不同服用時(shí)間的龍井茶多酚提取物，分別從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上對(duì)龍井茶多酚提取物對(duì)小鼠肝Cyp450s四種主要亞型Cyp3a11、Cyp1a2、Cyp2d22和Cyp2c37的作用進(jìn)行了探討。

本研究結(jié)果表明，龍井茶多酚提取物中的主要酚類物質(zhì)含量最高的是EGCG，占28.8%，其次含量較高的分別有EGC、ECG和C等物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，150 mg/kg組和300 mg/kg組Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)均降低，但150 mg/kg組Cyp1a2 mRNA及蛋白表達(dá)均增高，表明150 mg/kg和300 mg/kg龍井茶多酚提取物均能夠顯著抑制小鼠肝Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2c37 mRNA及蛋白表達(dá)，上調(diào)Cyp1a2的mRNA及蛋白表達(dá)，150 mg/kg組龍井茶多酚提取物能顯著性提高Cyp1a2的蛋白表達(dá)水平；在時(shí)效關(guān)系的研究中，隨著給予茶多酚提取物的時(shí)間由7 d逐漸延長到28 d，龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp3a11和Cyp2d22的作用由抑制轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)，對(duì)Cyp2c37的抑制作用逐漸消失，但并未表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，而隨著給藥時(shí)間的延長龍井茶多酚提取物對(duì)Cyp1a2的誘導(dǎo)作用未發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，龍井茶多酚提取物的攝入量和時(shí)間均能影響小鼠肝Cyp450s酶的表達(dá)，75 mg/kg龍井茶多酚提取物對(duì)該酶四種亞型幾乎無影響，150 mg/kg和300 mg/kg龍井茶多酚提取物對(duì)小鼠肝Cyp450s酶呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)或抑制作用，且隨著給藥時(shí)間的延長，這種誘導(dǎo)或抑制作用也會(huì)發(fā)生改變，繼而會(huì)加快或減慢與茶葉同服藥物的體內(nèi)代謝過程，從而使血藥濃度產(chǎn)生波動(dòng)，不利于藥效的發(fā)揮。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為“藥茶不能同食”的傳統(tǒng)說法提供了較為全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

有研究報(bào)道稱低劑量EGCG能夠抑制Cyp3A4的活性，但也有研究報(bào)道稱短期的高劑量EGCG對(duì)Cyp3A4有顯著的誘導(dǎo)作用[14,15]，但對(duì)于茶多酚提取物影響肝藥酶的作用少見系統(tǒng)研究。本課題組前期曾對(duì)黃山毛峰茶多酚提取物對(duì)肝藥酶的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，連續(xù)給予7 d 75、150和300 mg/(kg·d)黃山毛峰茶多酚提取物，均能顯著誘導(dǎo)小鼠Cyp3a11 mRNA和蛋白表達(dá)[16]。本研究結(jié)果則提示，與黃山毛峰茶多酚提取物對(duì)小鼠Cyp3a11的誘導(dǎo)作用不同，龍井茶多酚在連續(xù)給予7 d時(shí)能夠抑制Cyp3a11的表達(dá)，但隨著給予時(shí)間延長到28 d，龍井茶多酚和黃山毛峰一樣，顯示出對(duì)Cyp3a11的誘導(dǎo)作用，表明茶葉的種類、飲用量、引用時(shí)間等均會(huì)對(duì)肝藥酶產(chǎn)生不同的影響。茶多酚提取物中含多種茶多酚單體成分，這些成分對(duì)Cyp450s酶的影響是互相疊加還是互相拮抗，究竟哪一種單體成分起到關(guān)鍵的作用，這些問題都有待進(jìn)一步的深入研究。