近江牡蠣膜分離聯(lián)產(chǎn)制備多糖多肽及其功能特性研究

楊大俏，王錦旭，李來好，楊賢慶，馬海霞，胡曉

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306;3.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院,廣東 潮州 521041)

牡蠣俗稱蠔或海蠣子，是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是中國四大養(yǎng)殖貝類之一[1]，因其具有很高的藥用價(jià)值[2]，成為中國衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)的第一批既是食品又是藥品的物品。中國擁有豐富的海洋資源，2017年中國牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到487.9萬t，在福建、山東、遼寧、江蘇、浙江、廣東、廣西和海南等地均有相應(yīng)牡蠣養(yǎng)殖[1]。近江牡蠣Crassostrearivularis主要分布于廣東、福建等地，為中國南方沿海主要養(yǎng)殖品種。牡蠣營養(yǎng)價(jià)值豐富，經(jīng)蛋白酶酶解后，所得酶解液中含有小分子活性肽[3-4]、低分子量多糖[5]、?；撬醄6]及多種活性微量元素。

相關(guān)研究顯示，多肽[7]和多糖[8-10]具有多種藥用功能，對牡蠣多糖和多肽的深入研究有利于制藥、功能食品及膳食補(bǔ)充劑等行業(yè)的發(fā)展[5, 11-12]。日本采用高新生物技術(shù)及食品加工技術(shù)研制了多種牡蠣制品，包括片劑、口服液及膠囊。美國、歐洲、澳洲等也將牡蠣功能食品及保健品推向產(chǎn)業(yè)化。隨著牡蠣養(yǎng)殖技術(shù)的提高，國內(nèi)也積極研發(fā)了多種牡蠣保健品。目前，國內(nèi)外對近江牡蠣的研究主要集中在牡蠣多肽的活性及其序列研究，以及牡蠣多糖的提取工藝及結(jié)構(gòu)研究，而關(guān)于聯(lián)產(chǎn)制備牡蠣多糖多肽的抗氧化活性及功能特性的研究較少。

分級膜分離技術(shù)[13]是以壓差為驅(qū)動力，不同分子量的超濾膜具有過濾不同分子和形狀物質(zhì)的性質(zhì)，使用超濾膜在壓力差作用下可分離純化牡蠣酶解液[14]。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜[15]，由己糖醛酸、硫酸多糖和氨基己糖構(gòu)成的糖胺聚糖，具有多種生物活性[16]。本研究中，利用分級膜分離技術(shù)分離近江牡蠣酶解液制備多糖和多肽等功能因子,并檢測其理化特性、體外抗氧化活性及結(jié)構(gòu)，旨在為近江牡蠣活性多糖和多肽的聯(lián)產(chǎn)制備提供理論依據(jù)，以提高生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)近江牡蠣資源的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料

近江牡蠣購自廣東省臺山市。

試驗(yàn)試劑：Alcalase酶(210 AU/mg)、胰蛋白酶(≥250 U/mg，廣州齊云生物技術(shù)有限公司)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、還原型谷胱甘肽(GSH)等試劑均為分析純；三氟乙酸、乙腈、甲醇等均為色譜純。

標(biāo)準(zhǔn)品：還原型谷胱甘肽(相對分子質(zhì)量307.3)、L-氧化型谷胱甘肽(相對分子質(zhì)量612.63)、桿菌肽(相對分子質(zhì)量1422.69)、[Glu]Flbrinopeptide B Human(相對分子質(zhì)量1570.57)、Magainin-Ⅱ(相對分子質(zhì)量2466.9)、抑肽酶(相對分子質(zhì)量6511.83)、細(xì)胞色素C(相對分子質(zhì)量12 500)；平均分子質(zhì)量為1000、5000、10 000、50 000、150 000、410 000、670 000的葡聚糖；1,9-二甲基亞甲基藍(lán)、Gly-Gly-Tyr-Arg、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、硫酸軟骨素、巖藻糖；11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品等；均購自Sigma公司。

試驗(yàn)儀器：Sunrise-basic Tacan吸光酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)；三聯(lián)高壓平板膜設(shè)備(廈門福美科技有限公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津SHINADZU)；Agilent 1100液相色譜儀(美國Agilent)；UPLC-Q-Tof-MS/MS(Agilent 1290/BrukermaXis impact，美國Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 近江牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)酶解制備工藝 取近江牡蠣全臟器→勻漿→均質(zhì)→熱水浸提0.5 h→調(diào)pH至8.0→酶解[17](Alcalase∶胰蛋白酶=0.58%∶0.22%)→煮沸滅酶→離心10 min(9000 r/min)→上清液調(diào)pH至7.0→0.22 μm濾膜除雜→濾液過相對分子質(zhì)量為200 000的膜分離[18]→收集截留液→濾液過相對分子質(zhì)量為8000的膜分離→收集過濾液、截留液→濃縮凍干得各膜分離組分[19]，相對分子質(zhì)量為0～8000的組分記為CRRS-A(多肽組分)，相對分子質(zhì)量為8000～200 000的組分記為CRRS-B(多糖組分)，相對分子質(zhì)量>200 000的組分記為CRRS-C(多糖組分)。

1.2.2 近江牡蠣酶解液膜分離組分含量測定 取CRRS-A、CRRS-B、CRRS-C凍干粉，用水配制成濃度為1 mg/mL的溶液。采用三氯乙酸沉淀法測定多肽含量[20]；采用1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法測定酸性糖含量[21]；將溶液稀釋200倍后采用苯酚-硫酸法及DNS法[22]測定多糖含量；采用尹珊珊[23]的方法測定甲基戊糖含量；采用硫酸-咔唑法[24]測定己糖醛酸含量；采用明膠-氯化鋇比濁法[25-26]測定硫酸基含量；采用Wanger法[27]測定氨基己糖含量。

稱取兩份0.05～0.20 g CRRS-A凍干品于密封瓶中，進(jìn)行酸解(17種氨基酸處理方式相同)、堿解(色氨酸處理方式相同)后參照文獻(xiàn)[28]的方法進(jìn)行氨基酸測定。取CRRS-B、CRRS-C凍干粉經(jīng)三氟乙酸(TFA)酸解后，反復(fù)加甲醇氮?dú)獯祪鬞FA，加入1 mL 0.3 mol/L氫氧化鈉溶液，制得多糖水解液，將多糖水解液與11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品按照文獻(xiàn)[29]的方法進(jìn)行PMP衍生，測定單糖含量。

1.2.3 近江牡蠣酶解液膜分離組分分子量測定 采用高效體積排阻色譜(HPSEC)法[30]測定近江牡蠣CRRS-A(多肽組分)的分子量分布，使用色譜柱TSK-GEL?G2000SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)，在20∶80(0.1% TFA 乙腈∶0.1%TFA 水)、0.5 mL/min、10 μL、紫外檢測器220 nm的條件下洗脫，將標(biāo)準(zhǔn)品及樣品配制成0.25 mg/mL溶液，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(logMW)對保留時(shí)間(t)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及分子量回歸方程：logMW=-0.0037t2-0.0821t+5.6697(R2=0.9912)。用峰面積歸一法計(jì)算CRRS-A多肽組分相對分子質(zhì)量的分布情況。

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)[31]測定近江牡蠣CRRS-B、CRRS-C(多糖組分)的分子質(zhì)量分布，使用色譜柱Tosoh Biosep?G4000SWXL(7.5 mm×300 mm, 5 μm)，在0.2 mol/L硫酸鈉、0.7 mL/min、20 μL、示差折光檢測器等條件下洗脫，將7種標(biāo)準(zhǔn)品及樣品混合配制成0.5 mg/mL的溶液，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(logMW)對保留時(shí)間(t)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及分子量回歸方程：logMW= 8×1021t-13.13(R2=0.9828)。用峰面積歸一法計(jì)算CRRS-B、CRRS-C多糖組分相對分子質(zhì)量的分布情況。

1.2.4 近江牡蠣酶解液膜分離組分體外活性測定 參考文獻(xiàn)[32]的方法略做改進(jìn)，各樣品及陽性對照物BHT和GSH在相同濃度下測定其體外活性，分別在0.05、1、1 mg/mL濃度下測定DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率(K1，%)、羥基自由基清除能力(K2，U/mL)和超氧陰離子清除能力(K3，U/g)：

其中：AB為空白管吸光度值；A為樣品管吸光度值；AD為DPPH自由基反應(yīng)管吸光度值;AS為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；AC為未損傷管(對照管)吸光度；CS1為H2O2標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L);V為取樣量(mL)；F為樣品測試前稀釋倍數(shù)；CS2為維生素C標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.15 mg/mL);D為樣品濃度(g/L)。

1.2.5 近江牡蠣酶解液膜分離組分基本結(jié)構(gòu)鑒定 采用UPLC-Q-Tof-MS/MS法對CRRS-A多肽組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。UPLC色譜參數(shù)為：色譜柱Agilent SB-C18 RRHD(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.2 mL/min；波長為220 nm；流動相A為水，流動相B為甲醇。洗脫程序：0～1 min，15% B；1～4 min，90% B；4～10 min，90% B；10～10.5 min，15% B；10.5～12 min，15% B。MS檢測參數(shù)為：ESI陽離子模式，相對分子質(zhì)量掃描范圍為50 000～2000 000，單電荷狀態(tài)[M+H]+檢測分子質(zhì)量，毛細(xì)管電壓為3500 V，電離電壓為2000 V，脫溶劑溫度為500 ℃，干燥氣溫度為180 ℃，干燥氣流速為4 L/min。

利用傅立葉變換紅外光譜檢測CRRS-B、CRRS-C基本結(jié)構(gòu)，方法參照文獻(xiàn)[31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均經(jīng)過3次重復(fù)操作，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢測平均值顯著性，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 近江牡蠣酶解液3種分離組分的成分

以測定指標(biāo)吸光度值為x軸，以測定指標(biāo)濃度為y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。從表1可見，各測定指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明回歸方程擬合良好。近江牡蠣酶解液膜分離組分CRRS-A、CRRS-B、CRRS-C的成分含量測定結(jié)果如圖1所示，其中，CRRS-A組分多肽含量最高(P<0.05)，為(87.26±1.65)%，除氨基己糖含量以外的其余糖基含量均較低且顯著低于CRRS-B、CRRS-C組分(P<0.05)；CRRS-B組分中的多糖含量最高(P<0.05)，為(75.82±0.28)%，還含有己糖醛酸(5.06±0.60)%、甲基戊糖(31.23±1.29)%、硫酸基(23.47±0.7)%、氨基己糖(2.29±0.04)%，甲基戊糖、硫酸基及己糖醛酸含量均顯著高于CRRS-A、CRRS-C組分(P<0.05)；CRRS-C組分中的多肽與多糖含量相當(dāng)，酸性糖含量相對較高(P<0.05)。說明CRRS-A主要為多肽組分，CRRS-B為含有豐富基團(tuán)的多糖組分，CRRS-C由含多肽鏈的多糖組成(視為多糖組分)，證明8000、200 000超濾膜選取適當(dāng)。

表1 測定指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

Tab.1 Regression equations and correlation coefficients of test indices for southern oysterCrassostrearivularis

測定指標(biāo)(y)test index線性回歸方程regression equation相關(guān)系數(shù)R2correlation coefficient多肽濃度 polypeptidey=0.0469x+0.0010.9991葡萄糖濃度 glucosey=7.4682x-0.00470.9990還原糖濃度 reducing sugary=1.5523x-0.02410.9993甲基戊糖濃度 methyl pentosey=0.1508x+0.21510.9996硫酸基濃度 sulfate radicaly=0.4738x+0.02550.9909己糖醛酸濃度 glucuronicy=0.0075x+0.09690.9993硫酸多糖濃度 glycosaminoglycany=1.2578x+0.00220.9990氨基己糖濃度 glucosamine hydrochloridey = 0.0352x-0.0010.9908

從表2可見：近江牡蠣酶解液聯(lián)產(chǎn)制備多肽組分CRRS-A的氨基酸組成相對完整，其中脯氨酸的相對含量達(dá)到(50.61±0.69)%，組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸的相對含量均較高。從表3可見：CRRS-B組分含有葡萄糖最多，為(26.95±0.77)%，還含有氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖，不含鼠李糖、木糖；CRRS-C組分的單糖相對含量普遍低于CRRS-B組分(CRRS-C雜質(zhì)含量較高)，但相對含量數(shù)值趨勢一致，為葡萄糖>氨基葡萄糖>阿拉伯糖>氨基半乳糖>甘露糖>核糖>半乳糖醛酸>葡萄糖醛酸>半乳糖，不含鼠李糖、木糖。可見，CRRS-B為氨基含量豐富且多糖純度較高的多糖鏈。

表2 近江牡蠣酶解液分級膜分離多肽組分CRRS-A的氨基酸組成

Tab.2 Amino acid composition of CRRS-A from southern oysterCrassostrearivularisby fractional ultrafiltration %

氨基酸amino acid相對含量relative content氨基酸amino acid相對含量relative content天冬氨酸Asp4.19±0.56半胱氨酸Cys0.54±0.16谷氨酸Glu4.92±0.83纈氨酸Val?3.74±0.12絲氨酸Ser3.17±0.18蛋氨酸Met?0.77±0.38組氨酸His7.81±0.91色氨酸Trp?0.95±0.19甘氨酸Gly2.55±0.38苯丙氨酸Phe2.03±0.35蘇氨酸Thr?2.79±0.64異亮氨酸Ile?2.40±0.47精氨酸Arg3.93±0.66亮氨酸Leu?3.03±0.51丙氨酸Ala1.20±0.03賴氨酸Lys?4.05±0.67酪氨酸Tyr1.30±0.48脯氨酸Pro?50.61±0.69

注：*為必需氨基酸

Note：*，the essential amino acid

2.2 近江牡蠣酶解液膜分離多肽多糖組分的分子質(zhì)量

從圖2可見：由峰面積歸一法計(jì)算得出，近江牡蠣CRRS-A多肽組分大部分是相對分子質(zhì)量在2000以下的小分子肽，占86.87%；CRRS-B多糖組分的相對分子質(zhì)量為8300～150 000，占99.98%；CRRS-C多糖組分的相對分子質(zhì)量為66 000～7 152 000，占91.33%。

表3 近江牡蠣酶解液分級膜分離多糖組分CRRS-B、CRRS-C的單糖組成及其相對含量

Tab.3 Monosaccharide composition of CRRS-B and CRRS-C from southern oysterCrassostrearivularisby fractional ultrafiltration

單糖monosaccharide相對含量relative content/%CRRS-BCRRS-C甘露糖Man6.10±0.313.89±0.35核糖Rib4.66±0.572.87±0.78鼠李糖Rham——氨基葡萄糖GlcN9.08±0.415.85±0.64葡萄糖醛酸GlcUA2.22±0.221.28±0.15半乳糖醛酸GalUA3.62±0.732.25±0.51葡萄糖Glc26.95±0.7717.75±0.84氨基半乳糖GalN6.91±0.244.40±0.16半乳糖Gal1.50±0.680.80±0.04木糖Xyl——阿拉伯糖Ara8.19±0.475.26±0.31

2.3 近江牡蠣酶解液膜分離組分的基本結(jié)構(gòu)

圖3為近江牡蠣酶解液膜分離多肽組分CRRS-A的總離子流圖。經(jīng)分析，近江牡蠣多肽包含10個組分，對10個組分分別進(jìn)行一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜分析，鑒于版面所限，本研究中僅列出化合物1和化合物2的質(zhì)譜圖，其他化合物的質(zhì)譜圖見電子版附錄1。其氨基酸分別為：化合物1(m/z286.1982)Ala-Pro-Val；化合物2(m/z272.1981)Pro-Arg；化合物3(m/z753.3862)Phe-Cys-Lys-Val-Pro-Ala-Ser；化合物4(m/z770.4047)Ser-Arg-Met-Tyr-Thr-Leu/Ile；化合物5(m/z960.5304)Leu/Ile-Glu-Lys-Gly-Ser-Gly-Lys-Glu-Leu/Ile；化合物6(m/z731.4652)Phe-Asp-Lys-His-Lys-Gly；化合物7(m/z961.5289)Cys-Trp-Lys-Trp-Pro-Gly-Gly-Gly-Ala；化合物8(m/z962.5292)Pro -Leu/Ile-Ser-Ala-Asp-Cys-Ser-Gly-Gly-Arg; 化合物9(m/z872.5385)Pro-Lys-Ser-Leu/Ile-Lys-Gly-Gly-Trp；化合物10(m/z921.5591)Tyr-Gly-Arg-Ser-Trp-Arg-Pro。

CRRS-B凍干粉末呈淡黃色，CRRS-C凍干粉末顏色稍深。圖4為CRRS-B和CRRS-C的紅外光譜圖。從圖4可見：CRRS-B中，3423.35 cm-1處為O-H伸縮振動，2924.09 cm-1處為C-H伸縮振動，這是糖類化合物的典型吸收峰，1548.84 cm-1和1651.07 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是酰胺鍵(肽鍵)特征吸收峰[33]，1600～1650 cm-1處是糖類化合物C=O伸縮振動峰，1080.14 cm-1處有一吸收峰，結(jié)合717.52 cm-1處為吡喃環(huán)對稱伸縮振動，推斷CRRS-B為吡喃型，1151.50 cm-1處為-C-O伸縮振動峰，說明CRRS-B含有叔醇，1238.30 cm-1處有吸收峰，推斷其含有乙酸酯，1651.07 cm-1處為C=C伸縮振動，2852.72 cm-1處為-CH2對稱伸縮振動峰，1400.32 cm-1處為-OH彎曲振動峰；CRRS-C中，在3327.20 cm-1和2933.70 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是糖類化合物的特征峰，1666.50 cm-1處為C=C伸縮振動，1454.30 cm-1處為-CH3或芳烴的側(cè)面環(huán)伸縮振動峰，1400.30 cm-1處為-OH彎曲振動峰，1242.10 cm-1處為-O-C(O)-C伸縮振動峰，1029.90 cm-1處為C-O伸縮振動，931.62 cm-1處為吡喃環(huán)的非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰，1539.60 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰。紅外光譜再次證明了CRRS-B、CRRS-C為結(jié)構(gòu)相似的多糖，糖苷鍵類型為吡喃型，且由峰型可判斷，CRRS-C含多肽鏈多于CRRS-B(與“2.1”節(jié)結(jié)果一致)。

2.4 近江牡蠣酶解液膜分離組分體外活性

從圖5可見：與抗氧化劑BHT和GSH相比，各組分DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力存在顯著性差異(P<0.05)，CRRS-A組分具有較高的DPPH自由基、羥基自由基及超氧陰離子清除能力，分別為(93.80±0.87)%、(67.29±5.47)U/mL、(116.67±3.22) U/g，與BHT、GSH 兩個抗氧化劑相比，DPPH自由基清除能力與BHT及GSH相當(dāng)(P>0.05)，但其羥基自由基清除能力與超氧陰離子清除能力顯著高于BHT和GSH(P<0.05)；CRRS-B組分的羥基自由基清除能力、超氧陰離子清除能力顯著高于BHT(P<0.05)，但顯著低于GSH(P<0.05)；CRRS-C組分的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力均顯著低于GSH(P<0.05)。綜上，近江牡蠣酶解液分級膜分離組分具有較高的抗氧化活性，依次為CRRS-A>CRRS-B>CRRS-C，因此,CRRS-A、CRRS-B可作為天然抗氧化劑。

3 討論

3.1 聯(lián)產(chǎn)制備牡蠣多糖多肽的優(yōu)勢分析

關(guān)于多種物質(zhì)同時(shí)提取或聯(lián)產(chǎn)的研究，國內(nèi)主要集中在油料作物和中草藥活性成分的提取研究，針對更高效地利用海洋生物資源的工藝研究還較少；國外研究在這一方面幾乎還是空白，尤其是對于高蛋白海洋生物而言。近江牡蠣的多糖多肽通常以糖鏈或肽鏈的方式連接于蛋白分子或碳水化合物上，形成糖蛋白或糖胺聚糖，本研究中運(yùn)用酶解工藝將糖復(fù)合物分解為糖鏈或肽鏈，并將蛋白分解為肽段，得到的多糖多肽具有不同的理化性質(zhì)。膜分離方法具有提取效率高、設(shè)備簡單、低能耗、無污染和無相變的優(yōu)點(diǎn)，故可用于分離分子量差異較大的牡蠣多糖多肽。

3.2 牡蠣多糖多肽的抗氧化活性分析

Hao等[34]發(fā)現(xiàn)，組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等氨基酸對提高牡蠣抗氧化活性起到重要作用。由于本研究中CRRS-A具有較高含量的脯氨酸(50.61%)及組氨酸(7.81%)，且脯氨酸參與構(gòu)成膠原蛋白肽，可初步判斷CRRS-A具有抗氧化活性。Seo等[35]酸解太平洋牡蠣Crassostreagigas得到的抗菌肽相對分子質(zhì)量為5500，Wang等[36]酶解牡蠣Crassostreatalienwhanensis得到兩種抗氧化肽，相對分子量分別為518、440，且Ug等[37]指出，當(dāng)魚蛋白水解肽分子量低于1000時(shí)具有較高的抗氧化活性。天然多肽通常含有較多自由基結(jié)合位點(diǎn)，且分子量越小，其抗氧化能力越強(qiáng)(結(jié)合位點(diǎn)越多)，本研究中CRRS-A的相對分子質(zhì)量在2000以下，占86.87%。由于CRRS-A的相對分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于CRRS-B、CRRS-C，因此，CRRS-A的體外抗氧化活性大于CRRS-B及CRRS-C，與體外抗氧化測定結(jié)果一致。

Umayaparvathi等[7]試驗(yàn)得出牡蠣Saccostreacucullata的抗氧化肽具有較高DPPH、羥基自由基、超氧陰離子清除能力，分別為(85.70±0.37)%、(79.32±0.65)%、(81.6±0.3)%。徐兆剛等[38]酶解河蚌蛋白，得到DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力分別為89.98%、82.29%及51.08%的河蚌肽，得出其具有較好的綜合抗氧化活性，河蚌蛋白肽可作為天然抗氧化劑。本研究中得出，CRRS-A具有較高的DPPH自由基、羥基自由基及超氧陰離子清除能力，分別為(93.80±0.87)%、(67.29±5.47)U/mL、(116.67±3.22)U/g，CRRS-B的糖基相對含量高于CRRS-C，多糖純度較高，且分子質(zhì)量小于CRRS-C，故其體外抗氧化活性優(yōu)于CRRS-C，又與同濃度BHT相比，CRRS-B的體外抗氧化活性優(yōu)于BHT；CRRS-C為雜質(zhì)含量較多的混合物，具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，因而其與自由基作用效果不明顯。

本研究成果可為開發(fā)利用近江牡蠣活性多肽多糖以制備輔助抗氧化產(chǎn)品提供理論和技術(shù)參考，但研究方法多為體外結(jié)合化學(xué)試驗(yàn)，缺少必要的生物手段，因此，需進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞試驗(yàn)及動物模型活性研究，完善該項(xiàng)膜分離分級分離技術(shù)應(yīng)用。

4 結(jié)論

(1)近江牡蠣酶解液分級膜分離相對分子質(zhì)量為0～8000的組分CRRS-A主要由多肽組成，含量達(dá)到(87.26±1.65)%，相對分子量<2000，由10種化合物組成，具有較高的體外抗氧化活性，DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力較強(qiáng)，超氧陰離子清除能力高于抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)，達(dá)到(116.67±3.22) U/g，可作為天然抗氧化劑。

(2)相對分子質(zhì)量為8000～200 000的組分CRRS-B含有(75.82±0.28)%的多糖，還含有己糖醛酸(5.06±0.60)%、甲基戊糖(31.23±1.29)%、硫酸基(23.47±0.7)%、氨基己糖(2.29±0.04)%，相對分子量范圍8300～150 000，為吡喃型多糖化合物，體外抗氧化能力總體優(yōu)于抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，劣于還原型谷胱甘肽(GSH)。

(3)相對分子質(zhì)量>200 000的組分CRRS-C為吡喃型糖蛋白，分子量為66 000～7 152 000，體外抗氧化活性較差，利用價(jià)值不高。