甘肅武威地區(qū)不同成熟期‘黑比諾’葡萄中的多酚測(cè)定

史肖,張波,牛見明,劉琦,李寧寧,陳欣然,王凱麗,馬騰臻,韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)位于北緯36°46′～39°57′，氣候干旱少雨，光照充足，晝夜溫差大，具有種植釀酒葡萄得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢(shì)和氣候條件[1-2]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為地處河西走廊最東端的武威地區(qū)屬于國(guó)內(nèi)釀酒葡萄種植的最佳地理位置之一，該地區(qū)種植的葡萄具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、自然災(zāi)害小、病蟲害少等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黑比諾是武威地區(qū)種植面積最大的紅葡萄品種，作為該地區(qū)內(nèi)最具代表性的釀酒葡萄種植基地，38°和莫高兩大基地的黑比諾葡萄種植面積已超過一萬畝，并仍在逐年擴(kuò)大[3]。

紅葡萄酒中的多酚類物質(zhì)，對(duì)葡萄酒的色澤、口感、平衡起決定性作用，并且多酚具有很強(qiáng)的抗氧化功效[4-5]。葡萄酒中的多酚主要來源于葡萄漿果，其中果皮是多酚物質(zhì)存在的重要部位，發(fā)酵前的浸漬處理和帶皮發(fā)酵是漿果中多酚物質(zhì)進(jìn)入紅葡萄酒的重要途徑[6]。葡萄多酚可分為花色苷酚與非花色苷酚兩大類，花色苷酚及其衍生物是葡萄酒重要的呈色物質(zhì)，但由于單體花色苷不穩(wěn)定，因而多存在于發(fā)酵過程或新酒中，并且隨著葡萄酒的陳釀，單體花色苷與輔色因子結(jié)合形成聚合花色苷，從而增加葡萄酒色澤的穩(wěn)定性。非花色苷酚除抗氧化功能外，輔色作用是其在葡萄酒品質(zhì)提升中的重要體現(xiàn)，KONG[7]研究發(fā)現(xiàn)，香豆酸和咖啡酸可與花色苷的糖苷部位結(jié)合形成?；ㄉ?，從而使葡萄酒具有更好的顏色品質(zhì)。QINA[8]在研究酚酸對(duì)葡萄酒顏色時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源添加酚酸可提高19%～27%的顏色強(qiáng)度。ZHANG等[9]在模擬酒中研究了原兒茶酸、沒食子酸等5種非花色苷酚作為輔助因子對(duì)二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的輔色作用，其結(jié)果顯示，非花色苷酚濃度越高、溫度(10～20℃)越低，輔色效應(yīng)越強(qiáng)。

釀酒葡萄果實(shí)成熟是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，有報(bào)道指出，葡萄果皮中的花色苷開始合成于轉(zhuǎn)色期，在葡萄漿果接近成熟時(shí)含量最高[10-12]；酚酸、黃酮醇在轉(zhuǎn)色完成后逐漸積累并達(dá)到最大值[13]；白藜蘆醇在幼果期含量較高，當(dāng)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期含量出現(xiàn)下降[14]；李惠清等[15]在進(jìn)行釀酒葡萄轉(zhuǎn)色期內(nèi)花色苷積累的差異性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同葡萄品種中花色苷酚的含量和比例具有組織特異性，其中果皮和果肉中含量最高的花色苷分別為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷；姜壽梅等[16]研究結(jié)果顯示，在從轉(zhuǎn)色開始到轉(zhuǎn)色完成后1～2周時(shí)，葡萄果皮中各非花色苷酚類物質(zhì)含量積累到最高，隨后又開始緩慢下降，在葡萄采收前2周時(shí)，酚酸含量趨于穩(wěn)定、白藜蘆醇含量繼續(xù)降低，其他非花色苷酚含量再次升高，但這種含量波動(dòng)性變化的內(nèi)在原因，該文章并沒有進(jìn)行深入探究。目前關(guān)于葡萄多酚的研究多集中在轉(zhuǎn)色期，而成熟過程中葡萄多酚的研究較少，并且成熟期內(nèi)葡萄多酚的合成積累規(guī)律及代謝變化機(jī)制的研究也鮮有報(bào)道。此外，成熟過程中葡萄多酚的含量及其合成代謝直接決定著最終葡萄酒中多酚的含量，進(jìn)而會(huì)影響到葡萄酒的顏色品質(zhì)與酒體平衡，因此研究這一時(shí)期葡萄多酚含量的變化規(guī)律對(duì)改善葡萄酒品質(zhì)的價(jià)值更大。

本文以甘肅武威地區(qū)38°、莫高2個(gè)釀酒葡萄種植基地的黑比諾葡萄為原料，通過超高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-electraspray ionization-triple quadrupole tandem mass spectrometry, UPLC-ESI-QQQ-MS)和超高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-electraspray ionization tandem mass spectrometry, UPLC-ESI-MS/MS)技術(shù)，研究不同成熟期葡萄果皮中花色苷與非花色苷酚的變化規(guī)律，以期為從原料方面改善武威地區(qū)葡萄酒品質(zhì)及提升黑比諾葡萄酒顏色方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑比諾釀酒葡萄：2017年采自甘肅武威地區(qū)2個(gè)不同釀酒葡萄種植基地：民勤38°釀酒葡萄種植基地(北緯38°，東經(jīng)104°43′)、黃羊鎮(zhèn)莫高釀酒葡萄種植基地(北緯37°42′，東經(jīng)103°19′)，具體采樣時(shí)期如表1所示。

表1 采樣時(shí)期Table 1 Sampling period

1.2 試劑與儀器

試劑：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(Mv-3-O-glu)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%)，美國(guó)Miragen公司；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck有限公司；無水葡萄糖、偏重亞硫酸鈉、次甲基藍(lán)指示劑均為分析純，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

儀器：JJ-2凍干機(jī)，金壇市杰瑞爾電器有限公司；MS3 Digital渦旋儀，德國(guó)Ikams公司；ZWF334振蕩儀，上海智城分析儀器制造有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Poroshell 120 EC-C18色譜柱、Zorbax SB-C18色譜柱，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 成熟度指標(biāo)測(cè)定

總糖、總酸參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006中推薦方法測(cè)定[17]。

1.3.2 花色苷酚的提取與測(cè)定

參照本實(shí)驗(yàn)室陳欣然等[18]的方法并略作修改，具體操作如下。

花色苷酚提取：準(zhǔn)確稱取0.05 g葡萄皮凍干粉，加10 mL含有2%甲酸的甲醇溶液，超聲10 min，渦旋振蕩20 min，離心5 min(13 000 r/min)后，收集上清液至250 mL圓底燒瓶。按上述步驟重復(fù)提取3次，合并上清液并旋蒸至干(120 r/min、25 ℃)，用溶劑(A相∶B相=9∶1)定容至10 mL，于-20℃保存待測(cè)。整個(gè)操作過程注意避光，測(cè)樣前用0.45 μm濾膜過濾。

色譜條件：使用Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm)；流動(dòng)相A：(V甲酸∶V水=0.1∶100)，流動(dòng)相B：(V甲酸∶V甲醇∶V乙腈=0.1∶50∶50)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；梯度洗脫程序：0～27 min(90% A)；27～28 min(44%A-56% B)；28～33 min(90%A-10%B)，洗脫時(shí)間為33 min，流速為0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：ESI正離子模式下，離子源溫度350 ℃；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速12 L/min；干燥氣溫度350℃；離子掃描范圍100～1 000 m/z。

定性分析：通過樣品圖譜信息與保留時(shí)間和譜庫相應(yīng)物質(zhì)信息對(duì)比判定。

定量分析：采用Mv-3-O-Glu標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)法定量，其他花色苷酚以Mv-3-O-Glu當(dāng)量計(jì)。

1.3.3 非花色苷酚的提取與測(cè)定

參照本實(shí)驗(yàn)室王凱麗[19]的方法并略作修改，具體操作如下。

非花色苷酚提?。簻?zhǔn)確稱取2.5 g葡萄皮凍干粉，加入25 mL 90%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙酯水溶液，室溫條件下于搖床中(160 r/min)提取30 min，收集上清液至250 mL圓底燒瓶。按上述步驟重復(fù)提取5次，合并上清液并旋蒸至干(120 r/min、30 ℃)后，用甲醇溶液定容至10 mL，于-20 ℃保存待測(cè)。整個(gè)操作過程注意避光，測(cè)樣前用0.45 μm濾膜過濾。

色譜條件：使用Zorbax SB C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A：0.2%醋酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.2 mL/min；30℃柱溫；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～5 min(2%～7% B)、5～45 min(7%～30%B)、45～46 min(30%～65%B)、46～47 min(65%～95%B)、47～50 min(95%～2%B)。

質(zhì)譜條件：ESI離子源溫度350 ℃；負(fù)離子模式；霧化氣壓力為30 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；離子掃描范圍50～1 500m/z。

定性分析：通過樣品圖譜信息與保留時(shí)間和譜庫相應(yīng)物質(zhì)信息對(duì)比判定。

定量分析：通過建立各非花色苷酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄皮中非花色苷酚的含量。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2010對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用OriginLab Origin 9.1繪圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行多重比較(Duncan，P<0.05)及相關(guān)性分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟期葡萄成熟度

糖酸比常用來表示葡萄的理論成熟度，也是目前評(píng)價(jià)葡萄成熟度最直觀的指標(biāo)[20]。在葡萄成熟過程中，總糖不斷積累，總酸逐漸降低，造成糖酸比水平的逐漸升高。分析圖1可知，隨著葡萄的成熟，兩供試基地的黑比諾葡萄糖酸比水平均呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)，在采收時(shí)其糖酸比分別達(dá)到整個(gè)變化的最高值32.55(莫高)和39.87(38°)。研究顯示，糖酸比的高低對(duì)葡萄酒的質(zhì)量至關(guān)重要，只有在糖酸比大于20時(shí)，才能具有釀造葡萄酒的質(zhì)量潛力。分析本試驗(yàn)的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，供試2個(gè)產(chǎn)地的樣品均達(dá)到釀制葡萄酒的基本品質(zhì)要求，特別是莫高基地的葡萄樣品，其糖酸比還處于30～35，表明該樣品的成熟度水平較優(yōu)于38°基地樣品(研究認(rèn)為糖酸比超過40可能會(huì)造成葡萄酒的酒精度過高以及酒體不平衡等問題[21])。

圖1 兩個(gè)基地不同成熟期黑比諾葡萄糖酸比Fig.1 The sugar-acid ratio of Pinot Noir grapeat different ripening stages in two bases注：圖中小寫字母表示同一種植基地不同成熟期各水平間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 花色苷酚

花色苷酚的合成與積累開始于轉(zhuǎn)色階段，是賦予葡萄及葡萄酒顏色的主要物質(zhì)，其含量影響著葡萄漿果及葡萄酒的色澤、風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等[22]。本試驗(yàn)初步測(cè)定出5種單體花色苷，分別為花青素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷等，其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在所檢測(cè)出的花色苷中含量最高，這與一些學(xué)者報(bào)道的有關(guān)歐亞種葡萄的花色苷含量特性相似。

由圖2可知，從轉(zhuǎn)色完成(T1)到采收結(jié)束(T4)，38°和莫高2個(gè)供試基地葡萄樣品的花色苷含量變化均呈現(xiàn)先降低后升高再降低的波動(dòng)變化趨勢(shì)，分別從起始(T1)的1 181.86和1 186.33 mg/kg逐漸下降至901.01和566.12 mg/kg(T2)，又迅速積累至1 235.59和1 017.13 mg/kg(T3)，并最終在采收時(shí)回落到821.21和738.76 mg/kg(T4時(shí)期)。這與馬立娜[23]研究中發(fā)現(xiàn)的花色苷在成熟期含量逐漸增加的結(jié)果有一定差別。由圖2-A、2-B可知，在T1到T3時(shí)期內(nèi)，花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷含量變化幅度較小，但到T4時(shí)期，二者含量均大幅降低；圖2-C、2-D分別為花青素-3-O-葡萄糖苷與甲基花青素-3-O-葡萄糖苷在轉(zhuǎn)色完成后的含量變化情況，這兩種單體花色苷含量在葡萄成熟過程中也呈現(xiàn)波動(dòng)變化，并且各個(gè)時(shí)期花青素-3-O-葡萄糖苷與甲基花青素-3-O-葡萄糖苷含量具有顯著性差異(P<0.05)，其中莫高樣品中變化幅度更大；由圖2-E可知，隨著葡萄的成熟，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量變化幅度較小，且在T3時(shí)期含量達(dá)到最大值，但在T4時(shí)期，其含量出現(xiàn)大幅下降，并且顯著低于轉(zhuǎn)色完成時(shí)的含量。此外，由圖2可知，在整個(gè)檢測(cè)階段，武威38°地區(qū)葡萄樣品中總花色苷酚含量明顯高于莫高地區(qū)，例如在T2時(shí)期，38°地區(qū)樣品為后者的1.59倍；采收時(shí)其含量為后者的1.11倍。分析5種單體花色苷酚在各時(shí)期含量后發(fā)現(xiàn)，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，在T5時(shí)期含量最高，為同時(shí)期花青素-3-O-葡萄糖苷的3.51倍，花翠素-3-O-葡萄糖苷的1.80倍，甲基花青素-3-O-葡萄糖苷的1.25倍和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷的1.09倍。

A-花翠素-3-O-葡萄糖苷；B-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷；C-花青素-3-O-葡萄糖苷；D-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷；E-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷；F-總花色苷?qǐng)D2 兩個(gè)基地不同成熟期黑比諾花色苷酚的含量Fig.2 The content of anthocyanin phenols in Pinot Noir at different ripening stages in two bases

花色苷的合成主要通過前體物質(zhì)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為各類花色苷，并受溫度的調(diào)節(jié)[24]。有研究報(bào)道，葡萄中花色苷的含量在20 ℃時(shí)會(huì)顯著提高，在30 ℃時(shí)花色苷的積累則會(huì)有所降低或是趨于停止。通過查閱當(dāng)?shù)氐臍庀筚Y料我們發(fā)現(xiàn)，武威38 °基地所處區(qū)域，同年第3季度雖晝夜溫差(12 ℃)較莫高基地所在區(qū)域更大(10 ℃)。具體到本試驗(yàn)過程中花色苷含量的變化，我們分析這可能是供試區(qū)域花色苷含量出現(xiàn)波動(dòng)的原因之一。而比較2個(gè)不同地區(qū)的樣品發(fā)現(xiàn)，各類單體花色苷的含量也基本保持與總花色苷相同的變化規(guī)律，特別是在T2時(shí)期之后，各單體花色苷含量在武威38°地區(qū)葡萄樣品中均明顯偏高。例如，T2和T3時(shí)期，其花色苷含量分別是同期莫高基地葡萄皮樣花色苷含量的1.59倍和1.21倍。上述不同基地各類花色苷表現(xiàn)出的差異，除可能受前述溫度因素影響外，還可能與不同地區(qū)土壤養(yǎng)分以及當(dāng)?shù)氐墓庹盏纫蛩赜嘘P(guān)。研究認(rèn)為，每個(gè)地區(qū)由于地域性各具特點(diǎn)，土壤質(zhì)地和土壤中所含的礦質(zhì)元素和化學(xué)物質(zhì)也都各不相同，武威莫高和38°地區(qū)雖在行政區(qū)劃上屬于武威市管轄，但是莫高葡萄種植基地位于武威東南部，而38°在武威北部，兩者之間的直線距離為130 km。同時(shí)，38°地區(qū)地處騰格里沙漠邊緣，其自然環(huán)境也與同區(qū)域的武威莫高有較大區(qū)別。因此推測(cè)這可能是導(dǎo)致同一葡萄品種在不同地區(qū)產(chǎn)生品質(zhì)差異的原因之一。同時(shí)，在花色苷的合成過程中，光照的影響也很重要。對(duì)照兩地的氣象數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，同年第3季度，38°基地所在區(qū)域陰雨天氣維持時(shí)間較長(zhǎng)，其中8月份陰雨天氣長(zhǎng)達(dá)20 d左右，因此38°基地的黑比諾葡萄受光照時(shí)長(zhǎng)應(yīng)該比同期莫高基地的更少，但具體的內(nèi)容還需做進(jìn)一步的研究。

2.3 非花色苷酚

非花色苷酚是指除花色苷酚以外的酚類物質(zhì)，具有增強(qiáng)葡萄酒色度和穩(wěn)定顏色的作用[25]。本試驗(yàn)共檢測(cè)出27種非花色苷酚，其中酚酸類8種、黃烷醇類6種、黃酮醇類12種和芪類1種，2個(gè)基地各類非花色苷物質(zhì)總量如圖4所示。由圖3、圖4-E可知，從T1到T4時(shí)期，總非花色苷酚含量均呈先升高后下降再升高的變化趨勢(shì)，其中38°基地葡萄樣品的變化幅度更大(38°：32.96%～69.41%；莫高：13.23%～56.55%)，且均在完全轉(zhuǎn)色兩周后(T2)含量達(dá)到最大(38°：873.89 mg/kg；莫高：336.47 mg/kg)。

圖3 兩個(gè)基地不同成熟期黑比諾非花色苷物質(zhì)含量的熱圖比較Fig.3 Comparison of thermal map of non-anthocyanin phenols content in Pinot Noir at different ripening stages in two bases

通過對(duì)檢出酚類物質(zhì)進(jìn)行熱圖化處理(圖3)，可以看出隨著兩基地黑比諾葡萄的成熟，各非花色苷單體含量呈不同的變化趨勢(shì)，其中兒茶素、表兒茶素、楊梅素、新落婦苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在各時(shí)期相對(duì)含量較高，而原兒茶酸、水楊酸、反式-肉桂酸、山奈酚、木樨草素等含量相對(duì)較低。同時(shí)，由數(shù)據(jù)可知，酚酸類物質(zhì)在葡萄果皮中的含量均很低，而黃酮醇類物質(zhì)含量相對(duì)較高，這個(gè)結(jié)果與王凱麗[19]在其他葡萄品種中的研究發(fā)現(xiàn)相似，但各單體非花色苷的含量及其隨成熟過程含量的變化略有差異，分析這可能與葡萄品種以及環(huán)境因素有關(guān)。有研究顯示，光照和溫度可能會(huì)影響葡萄果實(shí)中酚酸的含量積累，韓鈺[26]在檢測(cè)疆內(nèi)炎熱地區(qū)赤霞珠葡萄果皮中酚類物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒食子酸含量在生長(zhǎng)過程中與其他研究人員的發(fā)現(xiàn)有較大不同。同時(shí)，SPAYD等[27]試驗(yàn)表明，位于陰面的果實(shí)中的酚類物質(zhì)的含量均低于位于陽面的葡萄果實(shí)，但是在生長(zhǎng)季中氣溫偏高的時(shí)期，由于光照使果實(shí)表面溫度以及果實(shí)周圍的溫度過高，將對(duì)果實(shí)品質(zhì)帶來不利的影響。而BAPTISTA等[28]研究也表明，不同產(chǎn)地內(nèi)的葡萄多酚物質(zhì)盡管在組成上較為相似，但是含量卻有明顯差異，這種不同除表現(xiàn)在地理方位因素外，還與不同地區(qū)下光強(qiáng)或光質(zhì)強(qiáng)度有關(guān)。而綜合葡萄植株的生長(zhǎng)狀況，年均溫、降雨量、相對(duì)濕度、土壤條件、負(fù)載量等因素，這些均會(huì)對(duì)葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的影響作用，并最終影響葡萄與葡萄酒中多酚潛能。當(dāng)然，關(guān)于葡萄酒中的多酚含量還會(huì)與相應(yīng)的生產(chǎn)及陳釀工藝有關(guān)，這些都將會(huì)造成其多酚類物質(zhì)含量和組成的差異，影響每款葡萄酒的特征和風(fēng)格。

2.3.1 酚酸類

酚酸是苯丙氨酸在苯丙烷類代謝合成的僅含一個(gè)苯環(huán)的多酚類物質(zhì)，對(duì)葡萄酒的色澤具有重要作用。植物體內(nèi)酚酸按其分子結(jié)構(gòu)可分為7個(gè)碳原子的羥基苯甲酸(hydroxybenzoic acids，HBA)以及9個(gè)碳原子的對(duì)羥基肉桂酸(hydroxycinnamic acids，HCA)兩類[29]。熱圖中由上至下，從沒食子酸到阿魏酸為酚酸類物質(zhì)，由圖3、圖4-A可知，隨著葡萄的成熟，2個(gè)基地葡萄酚酸類物質(zhì)的總量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，38°基地葡萄酚酸含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，而莫高基地葡萄酚酸含量先下降后上升再下降，并且2個(gè)基地的黑比諾酚酸含量均在T1時(shí)期最大，在T3、T4時(shí)期出現(xiàn)第2次高峰，但均顯著低于T1時(shí)期。姜壽梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄在成熟過程中，酚酸含量為“升—降—升”的趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)色完成時(shí)酚酸含量最高，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。比較各單體酚酸物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)產(chǎn)地不同時(shí)期酚酸類物質(zhì)中丁香酸含量相對(duì)最高，分別占同期酚酸類物質(zhì)總含量的42.18%和63.92%，其次為香草酸(分別為27.18%和28.43%)，而反式肉桂酸含量最低，僅占酚酸類物質(zhì)總量的0%～1.01%。

2.3.2 黃烷醇類

黃烷醇是指經(jīng)植物類黃酮代謝途徑合成的黃烷醇單體，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中C3環(huán)上存在羥基，因而也稱黃烷-3-醇[30]。熱圖中由上至下，從兒茶素到原兒茶素B1為黃烷醇類物質(zhì)，如圖3、圖4-B所示，試驗(yàn)共檢測(cè)出6種黃烷醇類物質(zhì)，其中兒茶素(9.63～98.78 mg/kg)、表兒茶素(2.39～50.00 mg/kg)是主要的黃烷醇，在兩個(gè)基地中分別占同時(shí)期黃烷醇總量的9.12%～79.66%和12.46%～70.34%。從T1到T4時(shí)期，38°基地黑比諾在T1時(shí)期黃烷醇總含量達(dá)到最大(74.73 mg/kg)，之后迅速下降，降低了64.93%，在T4時(shí)期，又急劇升高，其總含量與T1時(shí)期接近；莫高基地黃烷醇總量先急劇上升，在T2時(shí)期最高(336.47 mg/kg)，隨后又大幅降低，但在采收時(shí)呈上升趨勢(shì)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，不同的黃烷醇單體，其含量變化規(guī)律也不相同，這與溫鵬飛等[31]的研究結(jié)果相近。DOWNEY等[32]研究表明，葡萄果實(shí)中黃烷醇類物質(zhì)的含量受環(huán)境因素的影響較大，包括光照強(qiáng)度、溫度、土壤類型、灌溉條件和果實(shí)成熟度等，并且與各化合物自身的穩(wěn)定性也有很大的關(guān)系，結(jié)合兩基地的實(shí)際環(huán)境條件，這可能也是引起黃烷醇含量差異的重要原因。

2.3.3 黃酮醇類

黃酮醇是葡萄與葡萄酒中的重要酚類化合物，其與葡萄酒的苦味、色澤密切相關(guān)。通常情況下，黃酮醇類物質(zhì)主要以糖苷的形式存在于自然界中，但有時(shí)也會(huì)以游離態(tài)的形式存在[33]。熱圖中由上至下，從槲皮素到異鼠李素-3-O-葡萄糖苷為黃酮醇類物質(zhì)，分析圖3、圖4-C可知，在葡萄成熟過程中，38°基地葡萄樣品中黃酮醇總量呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，T2時(shí)含量達(dá)最高值(834.48 mg/kg)，而莫高基地葡萄樣品中黃酮醇總量持續(xù)緩慢增加，采收時(shí)其含量為244.79 mg/kg。楊梅素和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷是檢出含量最高的兩類黃酮醇，但其在2個(gè)基地的葡萄樣品中變化趨勢(shì)差異較大，在38°葡萄樣品中先增加后減少再增加，T2時(shí)期含量最高(分別為584.71和71.12 mg/kg)，而在莫高葡萄樣品中先下降后上升。本試驗(yàn)共檢測(cè)到12種黃酮醇類化合物，包括楊梅素、山奈酚、蘆丁、槲皮素及其衍生物等，占非花色苷酚總量的82.23%，是葡萄中主要的非花色苷酚類物質(zhì)，這與姜壽梅等[16]的研究結(jié)果類似。

2.3.4 芪類

芪類是指在植物體內(nèi)經(jīng)苯丙烷類和二苯乙烯類代謝途徑合成的，主要包括白藜蘆醇及其衍生物[34]。本試驗(yàn)檢測(cè)出的芪類為白藜蘆醇。由圖3、圖4-D可知，莫高基地黑比諾葡萄皮中白藜蘆醇含量從T1到T4總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與姜壽梅等[16]在西拉葡萄果皮中的研究結(jié)果一致。并且其含量在不同時(shí)期相比于其他酚類物質(zhì)變化較小。而38°基地樣品中白藜蘆醇先大幅降低，最低只有1.17 mg/kg，隨后升高至8.95 mg/kg，且相比T1時(shí)期降低了69.19%。

A-酚酸；B-黃烷醇；C-黃酮醇；D-芪類物質(zhì)；E-總非花色苷?qǐng)D4 兩個(gè)基地不同成熟期黑比諾各類非花色苷酚的含量Fig.4 The content of various non-anthocyanin phenols in Pinot Noir at different ripening stages in two bases

2.4 相關(guān)性分析

為探究黑比諾葡萄成熟度、花色苷酚總量、非花色苷酚總量及各類非花色苷酚含量之間的關(guān)系，故對(duì)兩基地葡萄的糖酸比、花色苷酚總量、非花色苷酚總量以及四類非花色苷酚含量分別進(jìn)行相關(guān)性分析，其結(jié)果見表2、表3。由表2可知，38°基地黑比諾葡萄的糖酸比與其葡萄皮中花色苷酚和非花色苷酚總量均為負(fù)相關(guān)，花色苷酚總量與非花色苷酚總量為顯著負(fù)相關(guān)(0.5≤|r|<0.8)。四類非花色苷酚含量之間也具有一定的相關(guān)性，其中酚酸和黃烷醇以及酚酸和黃酮醇均為高度正相關(guān)(0.8≤|r|<1)，芪類與黃烷醇為顯著正相關(guān)，說明各類非花色苷酚在葡萄成熟過程中的合成與代謝會(huì)受到其他酚類物質(zhì)的影響。由表3可知，莫高基地黑比諾葡萄的糖酸比與花色苷酚總量呈中度負(fù)相關(guān)(0.3≤ |r|<0.5)，與非花色苷酚總量呈顯著正相關(guān)，且花色苷酚總量與非花色苷酚總量呈高度負(fù)相關(guān)，同時(shí)酚酸與黃烷醇和黃酮醇均具有一定的相關(guān)性。

綜合分析表2、表3可知，糖酸比與花色苷酚和非花色苷酚總量均有較高的相關(guān)性，表明在葡萄成熟過程中，葡萄皮中多酚類物質(zhì)的合成代謝具有一定的內(nèi)在規(guī)律，KENNEDY等[35]研究表明，酚類物質(zhì)的生物合成和積累與葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，特別是成熟度密切相關(guān)，葡萄的成熟度不同，其果實(shí)內(nèi)酚類物質(zhì)的含量也不同，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。此外，花色苷酚與非花色苷酚含量表現(xiàn)出很高的負(fù)相關(guān)，表明非花色苷酚與花色苷酚合成代謝過程中具有一定的相互制約的關(guān)系，但其內(nèi)在的影響機(jī)制仍不清楚，還需進(jìn)一步深入探究。

表2 38°基地黑比諾葡萄各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of indexes of Pinot Noirgrape in 38° base

表3 莫高基地黑比諾葡萄各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of indexes of Pinot Noirgrape in Mogao base

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了甘肅武威地區(qū)內(nèi)38°、莫高2個(gè)釀酒葡萄種植基地不同成熟期黑比諾葡萄的糖酸比以及果皮中花色苷與非花色苷酚的變化規(guī)律。研究結(jié)果表明：

(1)從轉(zhuǎn)色完成到采收過程中，葡萄漿果的糖酸比逐漸升高，并且在T3時(shí)期，兩基地的葡萄已基本達(dá)到最佳采收期；

(2)花色苷酚研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)色結(jié)束后葡萄果皮中花色苷酚含量呈現(xiàn)先減小后增大再減小的波動(dòng)變化規(guī)律，并且T3時(shí)期的花色苷酚含量相對(duì)較高；

(3)非花色苷酚研究結(jié)果顯示，2個(gè)基地非花色苷酚含量差異較大，其含量呈現(xiàn)先增大后減小再增大的變化趨勢(shì)，最高含量大多集中在葡萄成熟的前中期；

(4)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在葡萄成熟過程中，糖酸比與花色苷酚和非花色苷酚總量均有較高的相關(guān)性，總花色苷酚與總非花色苷酚之間呈高度負(fù)相關(guān)，酚酸的變化對(duì)果實(shí)中黃烷醇和黃酮醇的積累有一定的影響，且芪類與黃烷醇為顯著正相關(guān)。