行氣祛瘀湯煎煮工藝研究*

羅偉良，梁曉燕，吳 利

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

行氣祛瘀湯為我院常用于氣滯血瘀的制劑，療效顯著，由神曲、木香、香附、丹參、砂仁、梔子等多味中草藥組方。方中丹參具有祛瘀止痛功效[1]，木香配砂仁可化濕、理氣、調(diào)中、止痛[2]。丹參的水溶性有效成分主要為丹參酚酸B[3]，而木香和砂仁的功效與揮發(fā)油息息相關(guān)[4]。在煎煮行氣祛瘀湯時，丹參酚酸B 會不斷溶出，同時也會不斷分解[5]，揮發(fā)油也易造成損失[6]，合適的浸泡時間、煎煮時間、煎煮溫度、煎煮壓力尤為重要[7]。本研究中以丹參酚酸B、木香揮發(fā)油、砂仁揮發(fā)油的含量為考察指標，選擇浸泡時間、煎煮時間、煎煮溫度、煎煮壓力為考察因素，采用L9（34）正交試驗，改進行氣祛瘀湯中丹參、木香、砂仁的煎煮工藝，以增強其藥效?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KDM 型調(diào)溫電熱套（山東省郅城永興儀器廠）；揮發(fā)油測定儀（上海玻璃儀器廠）；Agilent1100 型高效液相色譜儀，VWD 檢測器，Agilent110LC 型色譜工作站（美國Agilent 公司）；ES-J120 型電子分析天平（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司，精度為0.1 mg）；KQ-50B 型超聲提取器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為50 W）；UV-265 型紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

丹參酚酸B 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111562-201212，供含量測定用）；神曲Massa Medicata Fermentata（批 號 為 170804）、木 香Radix Aucklandiae（批號為170601）、香附Rhizoma Cyperi（批號為170701）、丹參Salvia（批號為170801）、砂仁Amomum villosum Lour（批號為170801）、梔子Gardenia jasminoides Ellis（批號為170501）均購于廣州至信藥業(yè)有限公司，經(jīng)佛山市中醫(yī)院吳利副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

設(shè)立浸泡時間（因素A）、煎煮時間（因素B）、煎煮壓力（因素C）、煎煮溫度（因素D）為主要考察因素，每個因素3 個水平，以丹參酚酸B（F）、木香揮發(fā)油（M）、砂仁揮發(fā)油（S）的含量為考察指標，按L9（34）正交試驗設(shè)計條件煎煮行氣祛瘀湯，將所得湯液定容至250 mL。正交試驗因素水平見表1。

表1 行氣祛瘀湯中丹參酚酸B、木香揮發(fā)油、砂仁揮發(fā)油正交試驗因素水平表

2.2 丹參酚酸B 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-甲酸-水（10 ∶30 ∶1 ∶59，V/ V/ V/ V）；檢測波長：286 nm；流速：1.0 mL/min。

2.2.2 溶液制備

取丹參酚酸B 對照品10 mg，精密稱定，水溶解，制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的對照品溶液。按行氣祛瘀湯的成分先浸泡30 min，煮至水開后再煎煮20 min。吸取2 mL 置500 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。按行氣祛瘀湯中的藥材組方除去丹參，按供試品溶液制備方法制備不含丹參的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取上述3 種溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果陰性對照無干擾，理論板數(shù)按丹參酚酸B計不低于2 000，色譜見圖1。

線性關(guān)系考察：稱取丹參酚酸B 對照品10 mg，置20 mL 容量瓶中，加水至刻度，制備丹參酚酸B 對照品貯備液，分別吸取對照品貯備液，并加水稀釋成質(zhì)量濃度為5，25，100，125，200，300，400，500 μg/mL 系列溶液，各取10 μL 注入高效液相色譜儀，以丹參酚酸B 質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=990.25X-843.32，r=0.999 8（n=8）。結(jié)果表明，丹酚酸B 質(zhì)量濃度在38 ～381 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣測定5 次。結(jié)果丹參酚酸B峰面積的RSD為1.36%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一樣品，依法平行制備供試品溶液6 份，依法進樣測定含量。結(jié)果的RSD為0.98%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于0，1，2，3，4，5，7，9 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果丹參酚酸B 峰面積的RSD為0.36%（n=8），表明供試品溶液在9 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的供試品溶液1 mL，共6 份，分別加入質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算含量及回收率。結(jié)果見表2。

2.2.4 樣品含量測定

吸取不同條件下制備的行氣祛瘀湯供試品溶液各2 mL，分別置500 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。各取10 μL進樣測定，采用外標法計算樣品中丹參酚酸B 含量。結(jié)果見表3。

表3 行氣祛瘀湯中丹參酚酸B、木香揮發(fā)油、砂仁揮發(fā)油含量正交試驗結(jié)果（ n=9）

表4 丹參酚酸B、木香揮發(fā)油、砂仁揮發(fā)油含量方差分析結(jié)果

2.3 木香與砂仁揮發(fā)油含量測定

按行氣祛瘀湯組方除去砂仁，先浸泡30 min，煮至水開后再煎煮20 min，然后按L9（34）正交試驗設(shè)計法，取不同煎煮條件下的木香揮發(fā)油。以2015 年版《中國藥典（一部）》附錄揮發(fā)油的測定方法測定行氣祛瘀湯中木香揮發(fā)油的含量[8]。按行氣祛瘀湯組方除去木香和砂仁，然后按行氣祛瘀湯的一般方法煎煮，即為空白對照。按2015 年版《中國藥典》揮發(fā)油的測定方法測定空白對照煎煮液中不含揮發(fā)油。分別吸取各條件項下行氣祛瘀湯供試品溶液10 mL，測定各木香揮發(fā)油含量，計算溶出百分率。按行氣祛瘀湯的成方除去木香，同法測定各砂仁揮發(fā)油含量，計算溶出百分率。結(jié)果見表3。

2.4 正交試驗結(jié)果

9 份樣品中丹參酚酸B 含量、木香揮發(fā)油溶出度、砂仁揮發(fā)油溶出百分率測定結(jié)果見表3。根據(jù)正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表4?？梢?，丹參酚酸B 含量的影響程度為B ＞A ＞C ＞D；顯著影響因素為因素B 和因素D，因素C 和因素D 影響不明顯，丹參酚酸B 最佳煎煮工藝為A3B3C1D1。木香揮發(fā)油溶出的影響程度為B ＞A ＞D ＞C。非常顯著影響因素為因素B，顯著影響因素為因素A，因素C 和因素D 影響不明顯，木香揮發(fā)油最佳煎煮工藝為A3B2C1D1。砂仁揮發(fā)油溶出的影響程度為B ＞A ＞C ＞D；非常顯著影響因素為因素B，因素A具有相當影響，因素C 和因素D 影響不明顯，砂仁揮發(fā)油最佳煎煮工藝為A2B1C1D1。綜合分析，行氣祛瘀湯的最佳煎煮工藝為行氣祛瘀湯（除去砂仁和木香）先浸泡丹參和其他藥物30 min，煎藥機煎煮丹參至水開后再煎煮20 min，然后加入已浸泡30 min 的木香，煎煮15 min，再加入已浸泡20 min 的砂仁，再煎煮5 min，木香和砂仁的煎煮過程均在100 ℃的正常大氣壓下完成。

2.5 最佳工藝驗證

稱取5 份行氣祛瘀湯方中藥材（除去砂仁），分別按行氣祛瘀湯最佳煎煮工藝進行煎煮，測定木香揮發(fā)油含量，得木香揮發(fā)油平均溶出百分率為16.77%，RSD為0.25% （n=5）。稱取5 份行氣祛瘀湯方中藥材（除去木香），分別按照行氣祛瘀湯最佳煎煮工藝進行煎煮，測定各湯液的丹參酚酸B 含量和砂仁揮發(fā)油含量，得砂仁揮發(fā)油平均溶出百分率為33.24% ，RSD為0.25%（n=5）；丹參酚酸B 平均質(zhì)量濃度為2 818.00 μg/mL，RSD為0.25% （n=5）?？梢姡袣忪铕鰷械⒎铀酈、木香揮發(fā)油和砂仁揮發(fā)油的最佳煎煮工藝穩(wěn)定可靠，且得到的丹參酚酸B 含量、木香揮發(fā)油和砂仁揮發(fā)油的溶出百分率優(yōu)于其他工藝。詳見表5。

表5 行氣祛瘀湯的最佳煎煮工藝驗證試驗結(jié)果

3 討論

行氣祛瘀湯中的丹參作為一般煎煮藥物的代表，其祛瘀止痛的作用與丹參酚酸B 含量密切相關(guān)。試驗中影響丹參酚酸B 含量的因素首先是藥材的浸泡，丹參由于是根和莖類藥物，質(zhì)地堅硬，丹參酚酸B 的溶出較困難[9]，而煎煮前適當浸泡可軟化，煎煮時丹參酚酸B易溶出[10]，浸泡時間過短會造成煎煮時藥材蛋白質(zhì)受熱凝固，淀粉糊化，堵塞溶出通道[11]，浸泡時間過長會導(dǎo)致雜質(zhì)增多[12]；而作為特殊煎煮藥物的砂仁由于質(zhì)地較蘇松，浸泡時間相對較短。其次，煎煮時間的長短對行氣祛瘀湯的療效影響很大[13]。由于藥材質(zhì)地的不同，每種藥物的煎煮時間都不同。丹參酚酸B 為水溶性，但易分解，煎煮時間過長會導(dǎo)致丹參酚酸B 的含量降低，丹參素含量升高[14]；不同煎煮時間對揮發(fā)油的含量影響明顯，木香和砂仁的有效成分都是揮發(fā)油，相對短時間的煎煮，揮發(fā)油就會逸出，長時間的煎煮會導(dǎo)致?lián)]發(fā)油大量散失[15]。本試驗中，丹參質(zhì)地最堅硬，木香次之，砂仁更次，在遵循藥材與溶劑之間溶質(zhì)濃度的平衡關(guān)系，延長煎煮時間會使提取物增多的一般規(guī)律時，選擇每種藥物適當?shù)募逯髸r間。

藥材中的丹參來自全國各地，產(chǎn)地不同[16]，有效成分含量差異較大。丹參堅硬，必須切成厚片才能促進丹參酚酸B 的溶出。砂仁入藥的有陽春砂、綠殼砂和海南砂，品種不同，所含有效成分不同，含量不同[17]，且在試驗時，經(jīng)打碎的砂仁，溶劑更容易浸透，揮發(fā)油溶出更快；木香長圓柱形，不易控制用量，且質(zhì)地堅硬，有效成分不易溶出，需經(jīng)過切成薄片[18]，才能使溶劑易于滲透，有效成分易于溶出。煎煮次數(shù)也同樣影響著行氣祛瘀湯的質(zhì)量，湯劑的煎煮一般以2 ～3 次為宜，第一次煎煮一般能煎煮出藥物有效成分的60%，第二次煎煮時重新構(gòu)建濃度平衡，能煎出30%[19]。試驗中一次煎煮的方法不能使藥材中的有效成分盡出，需要在后續(xù)研究中改良。溶劑用量也會影響丹參酚酸B、木香揮發(fā)油和砂仁揮發(fā)油的濃度，溶劑用量增多可促進藥物有效成分的擴散[20]，但用量過多同樣會給后續(xù)藥液濃縮帶來困難，迫使延長煎煮時間，丹參酚酸B 易分解，揮發(fā)油逸散[21]。

本研究中優(yōu)化了行氣祛瘀湯中作為一般藥物丹參和特殊煎煮藥物木香和砂仁的煎煮方法，但行氣祛瘀湯中還有其他藥物的煎煮需要優(yōu)化，仍需進一步探究，且藥物反應(yīng)更需深入研究，以充分發(fā)揮行氣祛瘀湯的功效。