長鏈非編碼RNA淋巴樣增強(qiáng)因子1反義RNA 1調(diào)控miR-339-5p對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用的研究

孫杰 萬里 王俊

（黃石市第二醫(yī)院骨科,湖北黃石 435000）

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨腫瘤，死亡率高[1]。雖然在過去的幾十年里研究人員花費(fèi)了大量的努力，但是患者的總體存活率仍然不令人滿意[2]。因此，了解骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制對改善患者預(yù)后有重要意義。新的證據(jù)表明，非編碼RNAs，如長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）、微小RNA（microRNAs，miRNAs/miR）等，在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制、診斷和預(yù)后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。lncRNAs是一類非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有多種生理和病理功能。miRNAs 是一類短鏈非編碼RNA，通過誘導(dǎo)mRNA裂解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達(dá)，有高度保守性。同時(shí)，lncRNAs 通常通過海綿miRNAs 在各種疾病中發(fā)揮作用[4]。根據(jù)報(bào)道，lncRNA淋巴樣增強(qiáng)因子1反義RNA 1（lymphoid enhancer-binding factor 1 anti?sense RNA 1,LEF1-AS1）在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖和遷移[5]，LEF1-AS1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，發(fā)揮致癌作用[6]。前列腺癌中的LEF1-AS1表達(dá)上調(diào)，沉默的LEF1-AS1 抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[7]。miR-339-5p 在骨肉瘤細(xì)胞中顯著降低，并且其過表達(dá)可抑制骨肉瘤增殖，lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1（nuclear paraspeckle assembly tran?script 1,NEAT1）通過抑制miR-339-5p而在骨肉瘤中充當(dāng)癌基因[8]。然而LEF1-AS1在骨肉瘤中的生物學(xué)意義及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在考察LEF1-AS1和miR-339-5p 在骨肉瘤組織中的表達(dá)，探討LEF1-AS1 和miR-339-5p 在骨肉瘤U2OS 細(xì)胞增殖與凋亡中的生物學(xué)功能，以及LEF1-AS1 的分子調(diào)控機(jī)制，這可能有助于骨肉瘤的早期診斷和靶向治療。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞U2OS 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）相關(guān)試劑盒購自日本TaKa?Ra公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8,CCK-8）購自日本Dojindo 公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Molecular Probes 公司，兔抗P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP?DH）、羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司。

1.2 臨床組織標(biāo)本

納入研究的35 例骨肉瘤組織和瘤旁組織（距骨肉瘤部位至少3 cm 處）均來源于本院。骨肉瘤患者術(shù)前均未接受放、化療。患者手術(shù)切除后立即將組織保存于液氮中。所有實(shí)驗(yàn)和方案獲得患者的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。組織標(biāo)本采用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取，之后用于qRT-PCR檢測。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞U2OS在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為DMEM 培養(yǎng)基，其中包含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素。miR-339-5p 模擬物、miR-339-5p 模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-339-5p 抑制劑（anti-miR-339-5p）、抑制劑陰性對照（anti-miRNC）、LEF1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-LEF1-AS1）、過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1）、LEF1-AS1 小干擾RNA（si-LEF1-AS1）、小干擾RNA 陰性對照（si-NC）由上海Genepharma 公司合成。將細(xì)胞U2OS 接種到6 孔板中，并在融合70%時(shí)使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞用于隨后的分析。

1.4 qRT-PCR檢測LEF1-AS1、miR-339-5p表達(dá)

以Trizol 試劑為基礎(chǔ)的RNA 提取方案用于從組織或細(xì)胞中提取總RNA。按照制造商的說明，通過Prime Script 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用qRTPCR 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，2?ΔΔCt法用于量化LEF1-AS1、miR-339-5p表達(dá)，LEF1-AS1表達(dá)歸一化為GAPDH，miR-339-5p 表達(dá)歸一化為U6。引物序列：LEF1-AS1 5，-AAGGACGAGAGAAAAGCAC-3，（F）和5，-CACACAAAGGGGAAGACC-3，（R），GAP?DH 5，-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3，（F）和5，-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3，（R），miR-339-5p 5，-ACACTCCAGCTGCGGTCCCTGTCCTCCAGGAG-3，（F）和5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，（R），U6 5，-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3，（F）和5，-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3，（R）。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

使用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）工具通過生物信息學(xué)分析預(yù)測LEF1-AS1和miR-339-5p的假定結(jié)合位點(diǎn)。利用pGL3 載體構(gòu)建靶向LEF1-AS1的野生型（WT）或突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告基因。對于螢光素酶報(bào)告基因測定，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，在U2OS 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LEF1-AS1 或MUT-LEF1-AS1 和miR-339-5p 模擬物或miR-NC。轉(zhuǎn)染48 h 后，使用熒光素酶報(bào)告試劑盒分析各組熒光素酶活性。

1.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

根據(jù)制造商的方案，使用CCK-8 試劑盒測定細(xì)胞增殖。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞U2OS（2×104個/孔）接種到96孔板中，在48 h時(shí)加入10μl CCK-8。在37℃下孵育4 h 后，使用Bio-Rad 3550 微孔板讀數(shù)器計(jì)算出450 nm 處的吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆能力

將轉(zhuǎn)染后的U2OS 細(xì)胞接種到6 孔板（500 個細(xì)胞/孔），并在37℃、含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。每2 d 更換一次培養(yǎng)基。2 周后，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，將U2OS細(xì)胞用PBS洗滌2次，在甲醇中固定40 min，在室溫下用1%結(jié)晶紫染料染色5 min，并用水漂洗2次，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

根據(jù)制造商的規(guī)程，用Annexin-V-FITC 對細(xì)胞進(jìn)行染色。將3×105個U2OS細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，收獲并用PBS洗滌。然后，將其重懸于100 μl Annexin-V結(jié)合緩沖液中，在室溫下與5 μl Annexin-V-FITC孵育15 min，并用碘化丙錠復(fù)染（終濃度1 μg/ml）。黑暗中于室溫下孵育15 min后，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.9 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測P21和Caspase-3蛋白表達(dá)

通過RIPA 裂解緩沖液從轉(zhuǎn)染后的U2OS 細(xì)胞中提取總蛋白。通過SDS-PAGE 分離等量的蛋白質(zhì)（20 μg），并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在37℃用5%脫脂奶封閉2 h 后，與P21、Caspase-3、GAPDH 一抗（1∶1000稀釋）于4℃孵育過夜，之后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（1∶5000 稀釋）在37℃放置2 h。使用ECL檢測試劑使條帶可視化。通過使用Image J 軟件將P21 和Caspase-3 蛋白條帶的灰度與GAPDH的灰度進(jìn)行比較，來確定相對表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LEF1-AS1、miR-339-5p 在人骨肉瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，35 例骨肉瘤組織中的LEF1-AS1 表達(dá)量高于瘤旁組織，而miR-339-5p 表達(dá)量低于瘤旁組織（P＜0.001，表1）。

2.2 抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的影響

在細(xì)胞U2OS 中轉(zhuǎn)染si-LEF1-AS1 發(fā)現(xiàn)LEF1-AS1 表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染si-NC 細(xì)胞（P＜0.001，表2），表明成功建立抑制LEF1-AS1的細(xì)胞。對細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，抑制LEF1-AS1顯著減少細(xì)胞U2OS 的存活率和克隆形成數(shù)（P＜0.001，表2，圖1C）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，抑制LEF1-AS1 的細(xì)胞U2OS 凋亡率明顯高于si-NC 組（P＜0.001，表2，圖1A）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-NC組比較，抑制LEF1-AS1顯著提高P21和Caspase-3蛋白水平（P＜0.001，表2，圖1B）。

2.3 LEF1-AS1靶向、調(diào)控miR-339-5p

starBase 網(wǎng)站預(yù)測顯示，LEF1-AS1 與miR-339-5p 有靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，與miR-NC 組比較，miR-339-5p 明顯降低WTLEF1-AS1 的熒光素酶活性（P＜0.001），但不影響MUT-LEF1-AS1 的熒光素酶活性（表3）。qRT-PCR檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LEF1-AS1 比轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 明顯減少miR-339-5p 表達(dá)量，轉(zhuǎn)染si-LEF1-AS1 較轉(zhuǎn)染si-NC 顯著增加miR-339-5p 表達(dá)量（P＜0.05，表4）。

2.4 抑制miR-339-5p 能減弱抑制LEF1-AS1 對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用

與si-LEF1-AS1和anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染比較，si-LEF1-AS1和anti-miR-339-5p共轉(zhuǎn)染明顯減少細(xì)胞U2OS 中miR-339-5p 表達(dá)量、P21、Caspase-3 蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率，顯著增加U2OS 細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)（P＜0.05，表5，圖3）。

2.5 過表達(dá)miR-339-5p 能增強(qiáng)抑制LEF1-AS1 對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用

與si-LEF1-AS1 和miR-NC 共轉(zhuǎn)染比較，si-LEF1-AS1和miR-339-5p共轉(zhuǎn)染明顯增加miR-339-5p 表達(dá)量、P21、Caspase-3 蛋白表達(dá)量和凋亡率，顯著減少細(xì)胞U2OS 存活率和克隆形成數(shù)（P＜0.001，表6，圖4）。

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表1 LEF1-AS1、miR-339-5p在人骨肉瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)（）

表1 LEF1-AS1、miR-339-5p在人骨肉瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)（）

表2 抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的影響（，n=9）

表2 抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的影響（，n=9）

圖1 抑制LEF1-AS1對U2OS凋亡集落形成P21、Caspase-3的影響

圖2 LEF1-AS1靶向miR-339-5p

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）

表4 LEF1-AS1調(diào)控miR-339-5p的表達(dá)（，n=9）

表4 LEF1-AS1調(diào)控miR-339-5p的表達(dá)（，n=9）

注：與pcDNA3.1組比較，△P＜0.05；與si-NC組比較，▲P＜0.05

3 討論

lncRNAs 是一組不編碼蛋白質(zhì)的功能RNA。盡管缺乏蛋白編碼能力，但lncRNAs幾乎在關(guān)鍵生物學(xué)和病理過程的各個方面都發(fā)揮了作用[9]。最近的研究證實(shí)，lncRNAs在骨肉瘤中的表達(dá)失調(diào)與疾病的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[10]，可以作為腫瘤抑制基因和致癌基因發(fā)揮作用，如lncRNA 重編程調(diào)節(jié)器（regulator of reprogramming,ROR）[11]、生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（growth arrest specific 5，GAS5）[12]、FOXD2-AS1（fork?head box D2 adjacent opposite strand RNA1）[13]。已有證據(jù)表明，LEF1-AS1的異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生中起重要作用。例如，與匹配的正常組織相比，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的LEF1-AS1 明顯上調(diào)，LEF1-AS1 水平升高預(yù)示著食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良[14]。LEF1-AS1在肺癌中被上調(diào)，其過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲的增強(qiáng)[15]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LEF1-AS1表達(dá)明顯上調(diào)，敲除LEF1-AS1可顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，包括增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。這些結(jié)果顯示，LEF1-AS1 可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的致癌因子。本研究qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與瘤旁組織比較，骨肉瘤組織中的LEF1-AS1表達(dá)量明顯升高。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制LEF1-AS1明顯降低骨肉瘤細(xì)胞U2OS的存活率和克隆形成數(shù)，并顯著提高凋亡率、P21 和Caspase-3 蛋白水平。說明與前述研究[14-16]一致，LEF1-AS1 同樣在骨肉瘤中扮演著癌基因的角色，下調(diào)其表達(dá)有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，LEF1-AS1 可能是骨肉瘤的關(guān)鍵靶標(biāo)。

圖3 抑制miR-339-5p能逆轉(zhuǎn)干擾LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS凋亡集落形成及P21、Caspase-3的影響

表5 抑制miR-339-5p能逆轉(zhuǎn)干擾LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

表5 抑制miR-339-5p能逆轉(zhuǎn)干擾LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

表6 過表達(dá)miR-339-5p能增強(qiáng)抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

表6 過表達(dá)miR-339-5p能增強(qiáng)抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

圖4 過表達(dá)miR-339-5p能增強(qiáng)抑制LEF1-AS1對細(xì)胞U2OS凋亡集落形成及P21、Caspase-3的影響

lncRNAs 可以作為骨肉瘤的必要的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNAs（competing en?dogenous RNAs,ceRNAs）的功能，使miRNAs 能夠抑制mRNA 的表達(dá)[17]，如MAFG 反義RNA1（MAF BZIP Transcription Factor G antisense RNA 1,MAFG-AS1）對miR-339-5p 的靶向調(diào)控[18]。miRNAs 的失調(diào)在各種癌癥中普遍存在，包括骨肉瘤[19]。miR-339-5p 已被證實(shí)在各種癌癥中起著抑癌作用。根據(jù)報(bào)道，肺腺癌[20]、卵巢癌[21]、胰腺癌[22]中的miR-339-5p 表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-339-5p可抑制肺腺癌[20]、卵巢癌[21]細(xì)胞的侵襲和遷移，miR-339-5p 低表達(dá)是胰腺癌[22]細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)的主要因素。本研究骨肉瘤組織中miR-339-5p表達(dá)顯著下調(diào)，與Zhang等[8]的報(bào)道相同，miR-339-5p 可能抑制骨肉瘤進(jìn)展。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，LEF1-AS1 可能靶向miR-339-5p，隨后的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一觀點(diǎn)。另外還發(fā)現(xiàn)，干擾LEF1-AS1 對細(xì)胞U2OS 增殖的抑制作用，和其對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，可被抑制miR-339-5p 表達(dá)所減弱，或被過表達(dá)miR-339-5p 所增強(qiáng)，說明miR-339-5p是LEF1-AS1的功能性靶基因，LEF1-AS1 影響骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的功能是通過靶向調(diào)控miR-339-5p的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，lncRNA LEF1-AS1 在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，以及促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-339-5p 的表達(dá)有關(guān)，為骨肉瘤提供了潛在的生物標(biāo)志物。