鍍覆碳基納米薄膜鈦合金的體外抑菌性能初步評(píng)價(jià)*

馬天鷹 柯松 冉天飛 吳芳 何靜 呂明銳 王敏

（中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，重慶 400037）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是骨科領(lǐng)域的革命性進(jìn)步，使許多骨關(guān)節(jié)疾病終末階段的患者得以康復(fù)。假體周圍感染（prosthetic joint infection,PJI）是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后災(zāi)難性的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)失敗的主要原因之一[1]。因PJI進(jìn)行翻修手術(shù)除了會(huì)給患者帶來龐大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也會(huì)在術(shù)后出現(xiàn)更多的并發(fā)癥增加患者的痛苦。隨著手術(shù)技術(shù)的提高和無菌觀念的加強(qiáng)，PJI 發(fā)病率在逐年下降。目前全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)（total hip arthroplasty,THA）感染率為0.5%～2.0%，全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（total knee arthroplasty,TKA）的感染率為1%[2]。但是隨著關(guān)節(jié)置換手術(shù)的總量逐年增加，PJI絕對(duì)數(shù)量也在迅速增長(zhǎng)[3]。通常認(rèn)為PJI最常見的機(jī)制是細(xì)菌通過血行播散或直接定植在假體金屬表面，進(jìn)而在假體/組織界面黏附形成細(xì)菌的生物被膜[4]。而生物膜一旦形成后，抗菌藥物難以起效果，往往需要進(jìn)行清創(chuàng)手術(shù)取出假體，部分患者需進(jìn)行二次甚至多次手術(shù)[5]。生物膜作為細(xì)菌在假體上的主要存在形式，也是PJI 診治的關(guān)鍵難點(diǎn)[6]。因此如何減少細(xì)菌在假體表面黏附是預(yù)防PJI 的研究重點(diǎn)。假體表面結(jié)構(gòu)特性在這一過程中起到?jīng)Q定性的作用。近些年，人們逐漸認(rèn)識(shí)到人工關(guān)節(jié)材料表面微結(jié)構(gòu)，如形貌、成分、能量狀態(tài)、親（疏）水性、電荷和導(dǎo)電特性可決定細(xì)菌的黏附能力[7]。因此對(duì)假體材料表面改性也成為材料抑菌性能研究的熱點(diǎn)。

鈦合金材料和鈷鉻鉬合金材料是骨科領(lǐng)域最常用的植入物材料。鈦合金由于有與人體骨組織基本匹配的彈性模量，且具有抗腐蝕性能好、抗疲勞性能高、對(duì)人體無毒性等優(yōu)點(diǎn)，而得到廣泛應(yīng)用[8]。但合金表面的抑菌性能有很大差異。有研究表明通過對(duì)材料表面改性，如表面化學(xué)組成、表面自由能、表面親水性/疏水性、表面粗糙度等，可改變細(xì)菌在材料表面的黏附情況，從而降低內(nèi)植物術(shù)后的感染風(fēng)險(xiǎn)[9]。

本研究應(yīng)用鍍覆碳基薄膜（sp3 a-C/sp2 a-C:n-TiC）技術(shù)對(duì)鈦合金人工關(guān)節(jié)摩擦表面進(jìn)行改性。該碳基薄膜有高生物相容性與優(yōu)異的自潤(rùn)滑性能，不易斷裂，且硬度高于氧化鋁陶瓷?？墒钩湍?、高生物相容性人工關(guān)節(jié)摩擦界面設(shè)計(jì)理念成為現(xiàn)實(shí)。本團(tuán)隊(duì)使用該種鍍覆碳基納米薄膜鈦合金（以下簡(jiǎn)稱鍍膜鈦合金）材料制作人工髖關(guān)節(jié)球頭產(chǎn)品擬開始臨床試驗(yàn)，但該材料的抑菌性能尚不清楚。本研究擬就該種鍍膜鈦合金和目前臨床最常見的人工關(guān)節(jié)金屬材料鈷鉻鉬合金進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)比較，觀察其抑菌性能。選擇PJI最常見的革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）作為感染病原菌。初步評(píng)價(jià)此種鍍膜鈦合金抑制細(xì)菌增殖和黏附的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鍍覆碳基納米薄膜鈦合金、鈷鉻鉬合金（浙江大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院及中奧匯成科技股份有限公司提供）。發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-3400N，HITACHI公司，日本）。比濁計(jì)（PhoenixSpec，Becton,Dickin?son and Company，美國(guó)）。激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5 Leica 公司，德國(guó)）。細(xì)菌活性測(cè)定試劑盒（L7012live/dead baclight TM viability kit，賽默飛世爾科技，美國(guó)）。

1.2 試件制作及預(yù)處理

分別切割鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金為直徑15 mm、厚度2 mm的圓片，各16片，見圖1。試件用蒸餾水聲波震蕩洗滌15 min 后于121℃高溫高壓消毒烘干備用。將試件分為2 組：鍍膜鈦合金片為實(shí)驗(yàn)組，鈷鉻鉬合金片為對(duì)照組。使用發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)鍍膜鈦合金的表面形貌進(jìn)行表征分析，見圖2。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供）用新鮮培養(yǎng)基復(fù)蘇后在LB 瓊脂平板上進(jìn)行涂布。后置入溫箱（溫箱環(huán)境設(shè)置為95%N2，5%CO2，37℃）進(jìn)行培養(yǎng)24 h。

1.4 抑菌圈比較

①分別挑取復(fù)蘇培養(yǎng)24 h 后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落置于液體培養(yǎng)基中，搖勻后使用比濁計(jì)滴定菌液濃度為1.0×108CFU/ml。然后取0.5 ml菌懸液，均勻攤布于LB瓊脂培養(yǎng)基，制成實(shí)驗(yàn)平板。②上述2 種金屬材料各2 枚分別放制備好的實(shí)驗(yàn)平板，每塊平板的1、2象限中分別放置鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金。③于37℃溫箱培養(yǎng)24 h 取出，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.5 細(xì)菌黏附掃描電鏡觀察

①分別挑取復(fù)蘇培養(yǎng)24 h 后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落置于液體培養(yǎng)基中，搖勻后使用比濁計(jì)確定菌液濃度為0.5×107CFU/ml。②上述2 種金屬材料各2 枚分別與金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)基、大腸桿菌液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h后，取出金屬試件，無菌PBS 輕吹試件2 遍。加入2%戊二醛（體積分?jǐn)?shù)為2.5%）固定4 h，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，每次10 min。③最后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，離子濺射鍍膜后用電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)和細(xì)菌黏附情況。

1.6 細(xì)菌黏附免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察

①上述金屬試件各2 枚分別放入12 孔板中，分別加入兩種上述實(shí)驗(yàn)菌液0.5 ml（比濁計(jì)確定菌液濃度為0.5×107CFU/ml）。②在37℃恒溫孵育24 h 后，用無菌PBS輕洗試樣4遍，去除表面未黏附的細(xì)菌和雜質(zhì)。③將這些培養(yǎng)后的試件進(jìn)行避光染色：熒光染液SYST09 能使活細(xì)菌發(fā)出綠色熒光，PI 可使死細(xì)菌發(fā)出紅色熒光，L7012live/dead 細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒同時(shí)含有這兩種熒光染液，根據(jù)說明書在室溫黑暗中染色15 min。吸棄染液后用PBS 輕輕洗滌去除非特異性染色。使用免疫熒光共聚焦（Leica 公司，德國(guó)）觀察熒光染色情況。在480～520 nm 處用40倍物鏡觀察，每塊材料隨機(jī)選擇5個(gè)視野面積進(jìn)行觀察。

1.7 菌落形成單位計(jì)數(shù)

①上述金屬試件鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金各10枚。分別放入上述制備好的液體培養(yǎng)基的試管中（每管10 ml，比濁計(jì)確定菌液濃度為0.5×107CFU/ml）。于5%CO2、95%N2，37℃環(huán)培養(yǎng)24 h 后，取出試件PBS輕柔沖洗表面2 次后。②每個(gè)試件放入100 ml 無菌PBS液中超聲洗滌1 min，再將各個(gè)試管的菌液用PBS雙倍稀釋。③取各試管稀釋后菌液100μl 接種到瓊脂培養(yǎng)皿上。37℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表面的形貌觀察

對(duì)鍍覆碳基納米薄膜鈦合金和鈷鉻鉬合金外觀進(jìn)行比較，新型鍍膜鈦合金因?yàn)樘砑犹蓟{米薄膜所以呈現(xiàn)亮黑色（圖1）。對(duì)該種鍍覆碳基納米薄膜鈦合金進(jìn)行電鏡觀察，通過掃描電鏡可以觀察到碳基納米薄膜為碳基鈦合金層與碳基層交替疊加構(gòu)成（圖2），這種新型材料的交替疊加結(jié)構(gòu)有高強(qiáng)度、超潤(rùn)滑、抗疲勞及不易斷裂的優(yōu)點(diǎn)[10]。

圖1 金屬試件大體觀察：右側(cè)為鈷鉻鉬合金試件，左側(cè)為鍍膜鈦合金試件，規(guī)格（直徑15 mm，厚度2 mm）

圖2 通過掃描電鏡可觀察到碳基鈦合金層與碳基層交替疊加（B），放大后可看到鍍膜碳基納米薄膜的主要構(gòu)成（A）,包括鍶基層、鋰緩沖層、鈦-碳漸變層等[11]

2.2 抑菌圈觀察

鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)24 h，試件表面細(xì)菌形成生物膜和抑菌圈情況，見圖3?？捎^察到金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿中，鍍膜鈦合金表面無生物膜形成（圖3Aa）、鈷鉻鉬合金表面部分形成生物膜（圖3Ab）；在大腸桿菌培養(yǎng)皿種情況類似，鍍膜鈦合金表面無明顯生物膜形成（圖3Ba）、鈷鉻鉬合金表面形成部分生物膜（圖3Bb）。且鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中均未形成明顯抑菌圈。

圖3 鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金表面抑菌情況比較

2.3 掃描電鏡結(jié)果

圖4 是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在兩種材料表面培養(yǎng)24 h后的掃描電鏡照片?？捎^察到兩種材料表面都有細(xì)菌生長(zhǎng)。在鍍膜鈦合金表面，金黃色葡萄球菌呈圓形或橢圓形，少量、散在分布。在鈷鉻鉬合金表面，呈大量、團(tuán)聚葡萄串珠樣分布。在鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金表面，大腸桿菌均呈短桿狀，散在分布。

2.4 免疫熒光結(jié)果

為了解更詳細(xì)的黏附情況，進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)。圖5、6 是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在鍍膜鈦合金及鈷鉻鉬合金表面培養(yǎng)24 h 的熒光染色結(jié)果。可以觀察到金黃色葡萄球菌和大腸桿菌與合金共培養(yǎng)24 h后，在鍍膜鈦合金表面細(xì)菌黏附更少。

圖4 鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金在細(xì)菌中培養(yǎng)后進(jìn)行掃描電鏡觀察表面細(xì)菌黏附情況

2.5 菌落形成單位計(jì)數(shù)

兩種細(xì)菌在鍍膜鈦合金黏附后的菌落計(jì)數(shù)要明顯小于鈷鉻鉬合金。兩者菌落計(jì)數(shù)有顯著差異性（P＜0.05）。大腸桿菌在兩種合金黏附后的菌落計(jì)數(shù)要明顯小于金黃色葡萄球菌（P＜0.05，表1）。

3 討論

合金表面鍍膜技術(shù)是一種在金屬表面鍍硬質(zhì)薄膜從而增加合金機(jī)械強(qiáng)度降低摩擦的表面修飾技術(shù)[12]。非晶碳（a-C）由于摩擦系數(shù)低，硬度高，有良好的耐磨、化學(xué)惰性和生物相容性在金屬鍍膜技術(shù)中受到廣泛關(guān)注[13]。但由于殘余應(yīng)力大，表面硬度梯度高等原因，導(dǎo)致附著力減弱，在薄膜和襯底之間易引起分層[12]。薄膜分層和縫隙腐蝕的問題嚴(yán)重影響了其應(yīng)用[14]。我項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在偏序電壓下利用磁控濺射技術(shù)在鈦合金（Ti6Al4V）上沉積了有交替碳層和碳-鈦復(fù)合層的納米復(fù)合薄膜，即“a-C/a-C:Ti 納米復(fù)合膜”。該種鍍膜方式可較好地解決薄膜和襯底之間易分層的問題。同時(shí)有高生物相容性與優(yōu)異的自潤(rùn)滑性能，且硬度高于氧化鋁陶瓷，可達(dá)20 GPa。與我團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)的高耐磨聚乙烯材料配伍使用，可顯著減少磨屑的發(fā)生[10,11]。但目前該材料的體外抑菌性能尚未評(píng)價(jià)。為此我們進(jìn)行了本研究。

表1 鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)（）

表1 鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)（）

人工關(guān)節(jié)假體周圍感染病原菌分布的相關(guān)研究顯示：革蘭氏陽性球菌是人工關(guān)節(jié)感染的主要菌種。來自Mayo 醫(yī)院的數(shù)據(jù)顯示人工關(guān)節(jié)感染病例中，革蘭氏陽性球菌占76%，其中金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌占45%。近些年來，革蘭氏陰性桿菌感染率逐漸上升，而革蘭氏陰性桿菌中以大腸桿菌最為常見[15]。故本研究選擇金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為研究對(duì)象。

本研究結(jié)果顯示，在金屬合金試件與細(xì)菌培養(yǎng)皿共培養(yǎng)抑菌圈大小比較實(shí)驗(yàn)中并沒有顯示明顯抑菌圈的存在及差異，但可看到在鈷鉻鉬合金表面部分形成生物膜而在鍍膜鈦合金表面未形成生物膜。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：①金屬材料本身并無直接抗菌性能；②鍍膜鈦合金相對(duì)鈷鉻鉬合金較為不易被細(xì)菌黏附。同時(shí)在掃描電鏡及熒光染色實(shí)驗(yàn)中也可直觀觀察到鍍膜鈦合金表面黏附金黃色葡萄球菌和大腸桿菌較鈷鉻鉬合金少。細(xì)菌菌落形成單位計(jì)數(shù)定量分析也同樣表明鍍膜鈦合金形成菌落數(shù)量較鈷鉻鉬合金少（P＜0.05）。

細(xì)菌黏附于金屬表面是一個(gè)復(fù)雜的過程，除了受細(xì)菌之間自身結(jié)構(gòu)（如黏附蛋白、鞭毛、胞外多糖及受體等結(jié)構(gòu)）的影響，也與金屬材料表面的理化性質(zhì)（如表面形貌、表面電荷、親疏水性等）有較大關(guān)系[16]?；诖耍胍獪p少人工關(guān)節(jié)表面細(xì)菌黏附可通過引入抗菌成分（如銀離子、抗生素、抗菌肽等）制作假體抗菌涂層；也可通過改變材料表面的理化性質(zhì)[17]。而目前假體表面抗菌涂層可較好的提供暫時(shí)性局部抗菌效果，但并不意味著PJI完全杜絕?？咕煞忠胍矌硇碌膯栴}，如銀離子人體毒性，目前也不常規(guī)推薦作為人體內(nèi)抗菌制劑的應(yīng)用[18]?？股仡愅繉拥闹饕獑栴}則是難以維持有效抗菌時(shí)間及誘導(dǎo)耐藥[19]。宿主成骨細(xì)胞和細(xì)菌在假體-骨整合界面競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系決定了感染是否發(fā)生。因此通過表面改性能的方式增加成骨細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)長(zhǎng)入從而減少細(xì)菌的黏附仍是比較理想的途徑。本研究結(jié)果顯示鍍覆碳基納米薄膜鈦合金相比鈷鉻鉬合金有更強(qiáng)的抑菌性能。分析原因主要與鍍覆碳基納米薄膜鈦合金表面改性后碳基層覆蓋從而有更低的表面粗糙度不利于細(xì)菌黏附有關(guān)。此外，也有研究表明納米化結(jié)構(gòu)可促進(jìn)成骨細(xì)胞長(zhǎng)入，從而競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌黏附[20]，但本研究為體外實(shí)驗(yàn)無法驗(yàn)證。

圖5 熒光染色觀察金黃色葡萄球菌在鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金表面培養(yǎng)24 h后黏附情況

圖6 熒光染色觀察大腸桿菌在鍍膜鈦合金和鈷鉻鉬合金表面培養(yǎng)24 h后黏附情況

本研究存在以下局限：①未就鍍膜鈦合金抑菌性能的具體機(jī)制作深入研究；②本研究選擇的菌種相對(duì)局限。臨床上，人工關(guān)節(jié)假體周圍感染還有很多其他種類感染源，如真菌感染，常見菌株為白色念珠菌；③目前尚未進(jìn)行鍍膜鈦合金動(dòng)物體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還需對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性及體內(nèi)組織的生物安全性系統(tǒng)研究。

綜上，我團(tuán)隊(duì)研發(fā)的有超高強(qiáng)度及耐磨特性的鍍覆碳基納米薄膜鈦合金相較鈷鉻鉬合金有更加良好的體外抑菌性能。可作為人工關(guān)節(jié)金屬材料的較佳選擇。但是其體內(nèi)抑菌效果尚需進(jìn)步一研究。