陸地棉開花時間相關(guān)基因GhMYB44的克隆與功能驗(yàn)證

段怡紅,閻媛媛,陳麗婷,李青,張冬梅,孫正文,張艷,馬峙英,王省芬

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北省棉花產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,河北 保定 071001)

我國人多地少，提高復(fù)種指數(shù)和土地利用率始終是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主題之一。短季棉是適合中國一年兩熟和多熟制種植的棉花類型。我國以金字棉為基礎(chǔ)，通過近百年的育種，成功培育了一系列適宜黃河流域和長江流域一年兩熟乃至多熟的短季棉品種，以及適宜內(nèi)陸棉區(qū)耐遲播早熟的短季棉品種。此外，短季棉株型緊湊、植株偏矮、葉量少的特點(diǎn)符合我國目前棉花產(chǎn)業(yè)機(jī)械化、輕簡化發(fā)展的需求，短季棉已成為棉花育種的基本需求之一。然而，我國短季棉種質(zhì)資源狹窄，制約著短季棉育種的快速發(fā)展，利用分子育種的優(yōu)勢，挖掘棉花開花時間調(diào)控基因，有助于短季棉的遺傳改良[1-4]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)上都有一段保守的DNA結(jié)合區(qū)，即MYB結(jié)構(gòu)域。在植物界，人們最早在玉米中發(fā)現(xiàn)了與色素合成有關(guān)的ZmMYBC1[5]。隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的MYB家族成員被鑒定。植物中存在大量的MYB轉(zhuǎn)錄因子，具有多重生物學(xué)功能，如維持光周期，調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)和模式建成，參與抗逆、抗病等一系列生理生化過程。MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物開花過程中也發(fā)揮關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，LHY和CCA1是擬南芥MYB家族中維持和重設(shè)生物鐘的負(fù)反饋調(diào)控因子，生物鐘晝夜節(jié)律根據(jù)LHY、CAA1和TOC1轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化而改變，三者相互作用，從而維持了擬南芥長日照促進(jìn)開花、短日照抑制開花的典型特征[6-7]。Song等[8]也研究了擬南芥中LHY與ELF3基因之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)ELF3突變體植株中LHY的轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(dá)減少，開花時間提前。MYR1和MYR2影響赤霉素合成，并在光強(qiáng)減弱時抑制開花[9]。EMF和FE均是在維管束組織特異表達(dá)的開花抑制子，通過調(diào)控FT響應(yīng)光照和溫度對開花時間的影響[10-11]。CPL3通過FT調(diào)控開花時間[12]。TaMYB72在長日照條件下顯著促進(jìn)水稻開花[13]。對金盞花花芽分化起始時轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn)了MYB轉(zhuǎn)錄子[14]。上述研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子是MADS基因外又一類重要的植物開花時間調(diào)控子。

棉花中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多個MYB基因[15]，GhMYB7和GhMYB9在花及纖維中表達(dá)，并且調(diào)控纖維發(fā)育[16]；GaMYB2在纖維中特異性表達(dá)，在葉片及纖維生長過程中都起作用[17]；GhMYB109在纖維起始時期及伸長的纖維中特異性表達(dá)[18]；GhMYB25在纖維伸長中也起著重要作用[19]；GhMYB52在棉纖維次生壁加厚期優(yōu)勢表達(dá)，參與纖維次生壁加厚過程[20]。重金屬脅迫可短暫抑制GbMYB5基因表達(dá)，PEG、脫落酸和赤霉酸誘導(dǎo)均可增強(qiáng)其表達(dá)[21]；干旱、低溫和高鹽脅迫誘導(dǎo)GhMYB113基因表達(dá)[22]；干旱脅迫誘導(dǎo)GaMYB2基因上調(diào)表達(dá)[23]；GhRAX3響應(yīng)干旱脅迫誘導(dǎo)，使棉花耐干旱脅迫能力下降[24]。目前，有關(guān)棉花MYB基因調(diào)控開花時間的報(bào)道甚少。

開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期，受溫度、光周期等多種環(huán)境因子的調(diào)控，并在基因的調(diào)節(jié)作用下完成[25]。研究棉花開花時間相關(guān)基因的功能，探究其作用及調(diào)控機(jī)制，對于改良棉花生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)等方面具有重要作用[26]。本課題組前期首次完成了來自中國、美國、澳大利亞等主要植棉國419份陸地棉核心種質(zhì)的基因組重測序?；? 665 030個SNP的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于D03染色體的一個MYB基因與開花時間顯著關(guān)聯(lián)[27]。本研究對該MYB基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)棉花基因組中含有兩個序列相似度高的基因序列，分別位于D03和A02染色體，進(jìn)一步對該基因進(jìn)行了克隆和功能研究，研究結(jié)果將為棉花早熟分子育種提供重要的基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花材料TM-1、哥倫比亞型擬南芥、本氏煙草均由本課題組保存。試驗(yàn)所用pMD18-T載體、大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京天根生化科技有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3103為自制，植物表達(dá)載體35spGreen由本實(shí)驗(yàn)室保存。

植物RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，熒光定量試劑盒購自US EVERBRIGHT?INC公司，2×PhantaTMMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技公司，限制性內(nèi)切酶購自賽默飛公司，2×TaqPCR Master Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生物科技有限公司。引物合成與測序均由金唯智公司完成。

1.2 處理及取樣方法

棉花種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室，在植株生長到2片真葉(二葉期)時開始取樣，到五葉期結(jié)束，每次選取長勢均勻一致的植株最新生長出的一片真葉用于基因的實(shí)時定量表達(dá)試驗(yàn)和基因克隆。擬南芥種植于23 ℃植物培養(yǎng)室，16 h光照，8 h黑暗，在苗期進(jìn)行取樣，用于基因表達(dá)分析。所取材料立即投入液氮中冷凍，然后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆

從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(https://cottonfgd.org/)下載基因序列并設(shè)計(jì)引物(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20 μL：模板1 μL，前后引物各1 μL，2×PhantaTMMaster Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將得到的目的條帶用膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取菌斑進(jìn)行PCR檢測，陽性克隆用于測序。保存測序正確的單克隆菌液以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Ex PASy網(wǎng)站上的Compute p I/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)對目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析，并用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ cdd.shtml)對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/Vh8qXc/models/)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。從CottonFGD網(wǎng)站(https://cottonfgd.org/)搜索GhMYB44基因的同源序列，利用Mapchart軟件繪制基因在染色體上的分布圖，借助MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.5 GhMYB44表達(dá)分析

采用cotton FGD網(wǎng)站(https://cottonfgd.org/)提供的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析GhMYB44a和GhMYB44b基因在棉花各組織部位及不同脅迫條件下的表達(dá)模式。

1.6 表達(dá)載體構(gòu)建

以測序正確的陽性克隆質(zhì)粒為模板，利用引物GhMYB44-F和GhMYB44-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(體系和程序同1.3方法)，獲得GhMYB44a和GhMYB44b基因片段，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和BamHⅠ酶切目的基因片段、超表達(dá)載體35S pGreen和亞細(xì)胞定位載體35S pGreen-GFP，采用T4連接酶16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并送公司測序。將測序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.7 GhMYB44的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建目的基因與GFP的融合表達(dá)載體35S:GhMYB44a-GFP和35S:GhMYB44b-GFP，用電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28 ℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600為1.0～1.2左右時，50 mL菌液收集菌體并重懸于50 mL緩沖液中，緩沖液包括：50 μL 乙酰丁香酮(200 μmol·L-1)、0.101 6 g MgCl2·6H2O、0.097 g 嗎啉乙磺酸、1 mol·L-1NaOH 150 μL，用ddH2O定容至50 mL，室溫放置3 h。本氏煙草種植于23 ℃植物培養(yǎng)室，16 h光照，8 h黑暗，選取長勢良好，葉片肥厚的煙草植株，將靜置的菌體懸浮液用1 mL的一次性注射器吸取出來，從煙草葉片下表皮慢慢注射，讓菌液充滿整個煙草葉片，黑暗避光48 h，撕取表皮細(xì)胞制片，在玻片上滴加DAPI染料，使用OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡FV10I觀察葉片中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.8 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

構(gòu)建植物超表達(dá)載體35S:GhMYB44a和35S:GhMYB44b，用電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，并轉(zhuǎn)化擬南芥[28]。轉(zhuǎn)基因擬南芥后代種植于營養(yǎng)土，在植株生長至兩片子葉平展后，葉面噴施除草劑Basta篩選陽性苗。待植株葉片稍大時，用CTAB法[29]提取擬南芥葉片基因組DNA，對目的基因進(jìn)行PCR檢測。待植株開花時，統(tǒng)計(jì)植株蓮座葉數(shù)目，觀察植株的生長狀態(tài)。

1.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥目的基因表達(dá)分析

按照北京艾德萊RNA試劑盒說明書提取RNA，保證所得RNA的OD260/280為1.8～2.1，OD260/230大于1.8。使用TaKaRa RR047A和RR6110A試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量使用SYBR Green分析法，所用試劑盒為Fast Super EvaGreen qPCR Master Mix，儀器為Applied Biosystems 7500實(shí)時定量PCR儀。PCR反應(yīng)體系包括：2×Super EvaGreen Master Mix 5.0 μL，前后引物各0.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，10×ROX reference dye(B) 0.1 μL，ddH2O 2.9 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 50 s，40個循環(huán)。以擬南芥At-TUB2為內(nèi)參基因。每個樣品進(jìn)行3次試驗(yàn)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法[30]分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用SPSS11.0軟件處理數(shù)據(jù)，Graphpad Prism 7.00軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMYB44基因克隆及生物信息學(xué)分析

以棉花TM-1葉片的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到1 000 bp左右的特異性條帶，測序結(jié)果顯示為兩條基因序列，長度為987和984 bp，同源性達(dá)98%，蛋白序列相似度達(dá)95%(圖1A)。兩者的結(jié)構(gòu)域非常保守，蛋白的差異性位于C端，但保守域與C端的相對位置不同，可能導(dǎo)致功能的差異。通過cottonFGD數(shù)據(jù)庫(https://cottonfgd.org/blast/)比對發(fā)現(xiàn)，兩個基因位于D03和A02染色體(圖1C)，分別命名為GhMYB44a和GhMYB44b。通過ExPASy網(wǎng)站預(yù)測，GhMYB44a編碼蛋白的分子量為37.1 kD，等電點(diǎn)為8.93；GhMYB44b編碼蛋白分子量為37.2 kD，等電點(diǎn)為9.15。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GhMYB44a和GhMYB44b在A03和D02染色體上沒有相似度很高的同源序列，只與A11和D11染色體上的兩個基因有較高的同源性，說明本研究克隆的兩條序列是不同的基因，且各自在基因組中都是單拷貝(圖2)。

A: 氨基酸序列比對，紅框所示為MYB區(qū)域；B: 蛋白三級結(jié)構(gòu)；C: 兩個基因在D03與A02染色體的位置。A: Alignment analysis of amino acid sequences, and red frames show MYB domains; B: 3D structure of protein; C: Chromosome location of the two genes in D03 and A02 chromosomes.圖1 GhMYB44a和GhMYB44b的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatic analysis of GhMYB44a and GhMYB44b

圖2 GhMYB44a和GhMYB44b同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of GhMYB44a and GhMYB44b

2.2 GhMYB44a和GhMYB44b在煙草中的亞細(xì)胞定位分析

為確認(rèn)GhMYB44在細(xì)胞中的位置，在煙草表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)，結(jié)果顯示GhMYB44a和GhMYB44b蛋白均位于細(xì)胞核中，這與轉(zhuǎn)錄因子定位于核內(nèi)的特征相一致(圖3)。

圖3 GhMYB44蛋白煙草亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of GhMYB44 protein in tobacco

2.3 GhMYB44在棉花不同組織及不同脅迫條件下的表達(dá)分析

利用Cotton FGD(https://cottonfgd.org/)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對兩個基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩個基因在不同組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出差異，GhMYB44a在陸地棉的根、莖、葉、雌蕊中表達(dá)，GhMYB44b在莖、葉、花托、雌蕊中表達(dá)，但兩個基因均在葉片中高表達(dá)(圖4)。GhMYB44a和GhMYB44b均不響應(yīng)冷熱脅迫，但受PEG快速誘導(dǎo)，且在PEG處理12 h時表達(dá)量仍保持較高水平；在鹽脅迫條件下，GhMYB44a不表達(dá)，而GhMYB44b在12 h時受誘導(dǎo)高表達(dá)(圖5)，由此推斷，GhMYB44a比GhMYB44b對干旱脅迫可能更加敏感，而GhMYB44b參與鹽脅迫反應(yīng)。

圖4 GhMYB44基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of GhMYB44 in different tissues

圖5 不同脅迫條件下GhMYB44的表達(dá)分析Fig.5 Expression difference analysis of GhMYB44 under different stresses

2.4 GhMYB44在棉花花芽分化時期的表達(dá)分析

花芽分化的起始標(biāo)志著植物生殖生長的開始，一般發(fā)生于苗期。為了探究GhMYB44是否參與開花時間調(diào)控，本研究檢測了棉花從兩葉期到五葉期葉片中GhMYB44的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，GhMYB44在葉片中的表達(dá)量一直較高，在四葉期基因的表達(dá)量達(dá)到高峰，表明該基因可能是開花時間促進(jìn)子。

2.5 GhMYB44基因的功能分析

通過噴施除草劑Basta初步篩選獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(圖7)，進(jìn)一步對抗除草劑植株進(jìn)行PCR檢測，獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株，經(jīng)后代篩選獲得純合株系。提取純合株系陽性植株葉片RNA進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)GhMYB44a和GhMYB44b在轉(zhuǎn)基因株系中高表達(dá)，說明兩個基因均被成功轉(zhuǎn)入到擬南芥基因組中并表達(dá)(圖7)。

圖6 GhMYB44在棉花花芽分化不同時期葉片中的表達(dá)Fig.6 Relative expression of GhMYB44 in the cotton leaves of of different flower bud differentiation stages

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定及目的基因表達(dá)分析Fig.7 Identification and expression analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

將轉(zhuǎn)基因純合株系在23 ℃長日照條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型提前抽薹且轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉數(shù)目顯著少于野生型，早花現(xiàn)象顯著。轉(zhuǎn)GhMYB44a擬南芥抽薹時平均輪作葉片數(shù)為10.2，而轉(zhuǎn)GhMYB44b擬南芥抽薹時平均葉片數(shù)為11.4，前者的早花現(xiàn)象更加明顯(圖8、圖9)。且GhMYB44a表達(dá)量越高的植株，早花表型越明顯，說明該基因?qū)﹂_花時間的促進(jìn)作用具有數(shù)量特征，而GhMYB44b的表達(dá)量與開花時間基本沒有關(guān)聯(lián)。

注：**表示與野生型之間差異在 P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: ** indicates significant difference compared with WT.圖8 轉(zhuǎn)GhMYB44a擬南芥表型鑒定Fig.8 Phenotypic identification for over-expressing GhMYB44a Arabidopsis

注：**表示與野生型之間差異在 P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: ** indicates significant difference compared with WT.圖9 轉(zhuǎn)GhMYB44b擬南芥表型鑒定Fig.9 Phenotyping identification for over-expressing GhMYB44b Arabidopsis

3 討論

植物葉片感知環(huán)境的變化，并在適宜的時候開花、產(chǎn)生后代，開花過程決定著生殖生長的成功與否，是植物發(fā)育過程中的重要階段。隨著地球人口的不斷增長，高效利用有限的土地資源是科學(xué)家一直努力的方向?？s短作物生長周期，是解決土地問題的有效方法之一。克隆參與開花時間調(diào)控的基因并研究其功能對于改良作物熟性具有重要意義。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中具有多重生物學(xué)功能，目前，有關(guān)棉花MYB基因的研究主要集中在纖維發(fā)育和抗逆過程[16-24]，對其調(diào)控棉花開花時間的報(bào)道甚少。本研究從棉花基因組中克隆了兩個序列高度相似的GhMYB44a和GhMYB44b基因，二者都能促進(jìn)擬南芥早開花，但GhMYB44a的功能更強(qiáng)，這可能與蛋白結(jié)構(gòu)在C端存在差異有關(guān)。絕大部分R2R3 MYB蛋白的C端都具有轉(zhuǎn)錄激活功能域特征，決定著蛋白的穩(wěn)定性、與DNA結(jié)合的強(qiáng)度以及互作蛋白類型等[31-32]。此外，GhMYB44a和GhMYB44b基因不僅響應(yīng)PEG脅迫，而且GhMYB44b還受鹽脅迫的誘導(dǎo)，這與前人報(bào)道的植物在逆境條件下(如干旱、高鹽、低溫等)會提前開花結(jié)實(shí)[33]相一致。本研究首次報(bào)道MYB基因調(diào)控棉花開花時間，豐富了MYB基因的功能，加深了對棉花開花時間調(diào)控的認(rèn)識。棉花基因組較大，含有500多個MYB基因，前人研究表明，MYB常以二聚體或多聚體形式發(fā)揮功能，因此挖掘GhMYB44a和GhMYB44b的互作蛋白及其調(diào)控的靶基因，對于深入了解MYB基因如何調(diào)控開花時間具有重要意義，也是今后研究的重點(diǎn)。