血清生長停滯特異性蛋白6c.834+7G＞A單核苷酸多態(tài)性與重度子癇前期風(fēng)險增加的相關(guān)性

劉力 張敬蕊 張含 侯曉琳 李瑤 羅茜茜

石家莊市第四醫(yī)院1檢驗科，2 產(chǎn)科（石家莊050000）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病[1]，發(fā)生在妊娠期20周之后，病情的嚴(yán)重程度可呈持續(xù)性進(jìn)展，主要表現(xiàn)為妊娠期出現(xiàn)高血壓并發(fā)蛋白尿，病情嚴(yán)重時可致多個臟器損傷，嚴(yán)重威脅母嬰健康[2-3]。子癇前期患者出現(xiàn)血壓持續(xù)升高、蛋白尿、血清肌酐升高、血小板降低、微血管病性溶血、血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、持續(xù)頭痛或其它大腦或視覺障礙、持續(xù)上腹部疼痛等任一不良情況可診斷為重度子癇前期（severe pre-eclampsia，SPE）[4]。

子癇前期一個重要的病理過程包括子宮螺旋動脈重鑄障礙，缺血缺氧，釋放多種胎盤因子進(jìn)入母體血液循環(huán)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損并激活系統(tǒng)性炎癥[5]。其中，胎盤高表達(dá)生長停滯特異性蛋 白6（growth arrest-specific protein 6，GAS6）[6]。GAS6是三個受體酪氨酸激酶TAM（Tyro-3/Axl/Mer）的配體，在無生長刺激時，抑制細(xì)胞凋亡，屬維生素K 依賴蛋白家族[7]。研究證實GAS6 廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，如生殖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，也可在人血清或血漿中檢測到[8]，GAS6 與血管的穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)、代謝紊亂和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[9]。8個GAS6 單核苷酸多態(tài)性已被證實[10]，并且發(fā)現(xiàn)中風(fēng)與GAS6內(nèi)含子8 中c.834+7G ＞A 密切有關(guān)[11]。GAS6 c.834＋7G ＞A位點中AA 基因型和等位基因A在腦梗死、腦出血及急性心肌梗死的病例組中的頻率顯著低于對照組，提示c.834＋7G ＞A位點AA基因型和A等位基因心絞痛、不穩(wěn)定心絞痛以及急性心肌缺血患者中具有保護(hù)效應(yīng)[12-13]。2015年的一項基于土耳其人的研究證實，c.834+7G/A位點的多態(tài)性與子癇前期之間存在關(guān)聯(lián)[14]。而2017年的另外一項研究表明，中國人群c.834+7G/A位點的多態(tài)性在子癇前期病例組和對照組間沒有明顯差別[15]。

然而GAS6內(nèi)含子c.834+7G/A位點的多態(tài)性是否在中國人群的重度子癇前期患者中有不同基因型的分布，國內(nèi)外無報道。因此本研究選取重度子癇前期患者作為研究對象，將明確GAS6 單核苷酸多態(tài)性是否參與重度子癇前期發(fā)病機(jī)制，可以預(yù)警病情發(fā)展并為基因水平治療干預(yù)提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料本文為病例對照研究，選取2016年到2018年在我院住院的重度子癇前期患者（SPE組）213例，年齡18～40歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：以人民衛(wèi)生出版社第9 版《婦產(chǎn)科學(xué)》對子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)為判定依據(jù)：孕20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg，伴有尿蛋白≥0.3 g/24 h或隨機(jī)尿蛋白定性≥（+）。伴有下面任何一種表現(xiàn)即診斷重度子癇前期：（1）收縮壓≥160 mmHg和（或）舒張壓≥110 mmHg；（2）肝酶異常：血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高于2倍正常值以上；（3）腎功能受損：血肌酐濃度高于2倍正常值以上；（4）血小板計數(shù)持續(xù)性下降，低于100 × 109/L；（5）肺水腫；（6）神經(jīng)系統(tǒng)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者孕前患有高血壓、心臟病、甲狀腺疾病、腎臟疾病以及糖尿病等內(nèi)科疾?。唬?）雙胎；（3）有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史。對照組為正常妊娠臨產(chǎn)婦女350例。本研究得到我院倫理委員會的批準(zhǔn)（20190007）。

1.2 方法

1.2.1 血清提取及普通風(fēng)險指標(biāo)檢測入組孕晚期孕婦清晨空腹采集靜脈血，EDTA 抗凝血和促凝血各4 mL，EDTA 抗凝血用于對孕婦GAS6的c.834+7 G ＞A位點進(jìn)行基因分型，促凝血待血液凝固后3 500 r/min 離心15 min，所得血清保存在-80℃冰箱待用。全自動生化分析儀Backman AU5800測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CREA）和尿蛋白。Wofen TOP 700測定D-D二聚體（D-Dimer）。血小板計數(shù)（PLT）由Mindray BC6800評估。

1.2.2 DNA提取及GAS6 c.834+7G ＞A基因分型按照QIAamp DNA blood kit（Qiagen，Germany）說明書從外周血淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA，并保存至-80℃冰箱待用。采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）對GAS6內(nèi)含子c.834+7G ＞A進(jìn)行基因分型，過程簡述如下：以外周血基因組DNA為模板，擴(kuò)增引物序列為：5′-TTCCCTCAAGAAAGAGCCCG-3′和5′-TCTCATCCCAAACCTCCACA-3′，經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生大小為481 bp的產(chǎn)物。擴(kuò)增在MyCycler 熱循環(huán)儀系統(tǒng)（Bio-Rad，United States）中進(jìn)行，條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延長7 min。用限制性內(nèi)切酶Hha I 消化擴(kuò)增產(chǎn)物。消化后PCR 產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠染色，在紫外光下拍攝凝膠圖片并記錄。根據(jù)DNA 片段大小及分布，可對GAS6 c.834+7G ＞A位點進(jìn)行基因分型。基因分型依據(jù)為：有兩個條帶，大小分別為345 bp和136 bp，其基因型為AA型；有3個條帶，大小分別為481 bp、345 bp和136 bp，其基因型為AG型；僅有一個條帶，大小為481 bp，其基因型為GG。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用Levene檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分布及方差齊性檢驗。配對t檢驗和方差分析用于比較病例組和對照組之間計量資料的差異。檢驗對照組人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，以判斷所選人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，從而確定其對整體人群的代表性。χ2檢驗用于決定Hardy-Weiberg 平衡下的基因型分布，對比對照組與患者間等位基因和基因型頻數(shù)差別。采用非條件Logistic 回歸模型計算比值比（OR）及95%置信區(qū)間（95%CI）。用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPE病例對照組普通風(fēng)險指標(biāo)差異明顯兩組間普通風(fēng)險指標(biāo)差異見表1。對年齡、孕周等指標(biāo)做計量資料單因素分析結(jié)果顯示所有指標(biāo)呈正態(tài)分布且方差齊性，其中SPE病例組生產(chǎn)時的孕周、血小板計數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），收縮壓、舒張壓、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 病例組和對照組普通風(fēng)險指標(biāo)差異Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

表1 病例組和對照組普通風(fēng)險指標(biāo)差異Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

注：*P ＜0.05

風(fēng)險指標(biāo)年齡（歲）孕周體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2 ）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）尿蛋白（g/24 h）PLT（109 /L）CREA（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）D-Dimer（ng/L）SPE 組（n=213）28.9±4.4 34.1±3.2* 24.3±4.5 161±17* 104±13* 2.9±1.1* 187±63* 99±45.6* 20.4±9.1 23.3±8.7 4.7±1.1* 對照組（n=350）28.2±4.7 37.6±2.3 25.1±3.6 116±13 78±13 0.08±0.03 297±60 57.6±21.3 13.7±5.6 16.2±6.1 2.2±0.9

圖1 GAS6 c.834+7G ＞A位點三種基因型頻率Fig.1 Genotype frequencies of GAS6 c.834+7G ＞A

2.2 SPE病例對照組各基因型及等位基因分布差異明顯PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后，GAS6 c.834+7G ＞A位點3 種基因型電泳結(jié)果如圖1A，按照PCR 產(chǎn)物經(jīng)酶處理后電泳結(jié)果將所有受試者進(jìn)行基因分型。經(jīng)過基因分型發(fā)現(xiàn)（圖1B），GAS6 c.834+7G ＞A的基因型AA、AG和GG在350例對照組人群中則分別是27.4%（96/350）、52.6%（184/350）和20.0%（70/350），在213例SPE 患者中的表達(dá)分別是20.6%（44/213）、28.2%（60/213）和51.2%（109/213）。其中基因型AA和AG 從對照組到SPE組有明顯下降趨勢（圖1B）。SPE組等位基因A和G頻率分別為34.9%（149/426）和65.1%（277/426）；對照組中分別為53.7%（376/700）和46.3%（324/700）。等位基因A和G進(jìn)行χ2檢驗（表2），發(fā)現(xiàn)其在SPE 組和對照組之間存在差異（χ2= 37.364，P＜0.05）。將基因型進(jìn)行χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，其在SPE組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 61.109，P＜0.05）。由于基因型分為3型，將其進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)（表2），基因型AA和AG在SPE 組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 2.107，P= 0.147），AA和GG在SPE 組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=27.327，P＜0.05），AG和GG在PE 組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 56.724，P＜0.05），AA和AG+GG在PE 組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 3.250，P= 0.071），AG和AA+GG在SPE 組與對照組間有顯著意義（χ2=32.110，P＜0.05），GG和AA+AG在SPE 組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=59.340，P＜0.05）。

2.3 等位基因G和基因型GG可能與重度子癇前期風(fēng)險增加有關(guān)從表3可以看出，SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點等位基因G 頻率（0.651）高于對照組（0.463）（P＜0.05），SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點基因型GG 頻率（0.512）明顯高于對照組（0.200）（P＜0.05），提示等位基因G及基因型GG可能為風(fēng)險因素。

3 討論

表2 3 種基因型兩兩比較結(jié)果Tab.2 Comparative analysis among three genotypes例

表3 SPE 組和對照組基因型和等位基因頻率Tab.3 Genotype and allele frequencies in SPE and control groups例（%）

經(jīng)χ2檢驗，健康對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P= 0.749）。單因素分析后重點考慮基因型的影響，利用Logistic 線性回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果選取AA為比對參考（表3），則AG、GG及AG+GG的OR（95%CI）分別為0.711（0.449～1.128）、3.397（2.131～5.416）和1.452（0.967～2.180）。如果選取AG為比對參考（表3），則AA、GG及AA+GG的OR（95%CI）分別為：1.406（0.887～2.228）、4.775（3.143～7.256）和2.827（1.962～4.071）。等位基因Logistic 分析發(fā)現(xiàn)，如果選取A為比對參考，則G的OR（95%CI）為2.157（1.683～2.766）。

統(tǒng)計分析結(jié)果表明（表3），SPE 組等位基因G及GG 基因型頻率明顯高于對照組（GG：0.512vs.0.200；G：0.651vs.0.463），提示等位基因G及基因型GG為風(fēng)險因素。

為了明確GAS6 c.834+7G ＞A的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與重度子癇前期（SPE）風(fēng)險增加的相關(guān)性，本研究按照病例對照實驗方法對受試者GAS6 c.834+7G ＞A進(jìn)行了基因分型。結(jié)果顯示（表3），基因型AA、AG和GG在213名SPE 患者中的頻率排布為AA ＜AG ＜GG，基因型GG 占大部分（51.2%，表2），350名對照者三種基因型的頻率為GG ＜AA ＜AG，基因型AG 占優(yōu)勢（52.6%）。可以看出，SPE 組基因型等位基因向G 偏移，多為純合型GG（占51.2%），對照組基因型等位基因向A 偏移，多為雜合型AG（占52.6%），提示等位基因G及基因型GG為風(fēng)險因素。

越來越多的研究表明GAS6-Axl 系統(tǒng)參與維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、遷移、粘附和吞噬[9，16-17]。臨床數(shù)據(jù)表明子癇前期具有家族傾向性，但遺傳方式尚不明確[18]。GAS6 基因存在至少8個單核苷酸多肽位點[10，19]，有學(xué)者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病組GAS6 c.834+7G/A位點的A 等位基因頻率低于正常對照組[20-21]，而有研究發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動脈綜合征患者GAS位點的AA 基因型和A 等位基因檢出率低于對照組[12]。又鑒于GAS在血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮著重要作用，所以該位點的單核苷酸多態(tài)性可能與子癇前期的臨床表現(xiàn)相關(guān)[22]。OZAKPINAR 等的研究證實，834+7G/A位點的多態(tài)性與子癇前期之間存在關(guān)聯(lián)，基因位點A可能有保護(hù)作用[14]。而YE 等[15]的一項研究表明，834+7G/A位點的多態(tài)性在子癇前期病例組和對照組間沒有明顯差別，而是另一個位點834+1332C/T 與PE 風(fēng)險相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，SPE病例組GG 基因型是最常見的，SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點基因型GG 頻率（0.512）明顯高于對照組（0.200）（P＜0.05）；且相對于AA 基因型，GG 基因型患病的風(fēng)險提高約3.4倍（OR= 3.397，95%CI：2.131～5.416），完全落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%置信區(qū)間（OR= 3.508，95%CI：1.352～9.102）內(nèi)；基因型AA和AG 頻率也明顯低于對照組。相比于基因型AG，基因型AA和GG 患病的風(fēng)險分別提高約1.4倍（OR= 1.406，95%CI：0.887～2.228）和4.8倍（OR= 4.775，95%CI：3.143～7.256），提 示GAS6 c.834+7G/A位點的基因型GG和SPE的風(fēng)險增加有關(guān)，即GG 基因型為風(fēng)險指標(biāo)。SPE 組GAS6 c.834+7G ＞A位點等位基因G 頻率（0.651）高于對照組（0.463）（P＜0.05），且與等位基因A 比較，等位基因G 患病的風(fēng)險提高2.2倍（OR= 2.157，95%CI：1.683～2.766），同樣落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%CI（OR= 2.118，95%CI：1.330～3.371），提示GAS6 c.834+7G/A位點的等位基因G和SPE的風(fēng)險增加有關(guān)，即等位基因G 具有風(fēng)險指標(biāo)。進(jìn)一步分析OZAKPINAR 等[14]的其他數(shù)據(jù)可以得出相似的結(jié)論，因此本實驗河北省育齡婦女的研究結(jié)果和OZAKPINAR 等的結(jié)果一致。綜上所述，GAS6 c.834+7G ＞A 等位基因G和基因型GG 與重度子癇前期的風(fēng)險增加有關(guān)。

重度子癇前期臨床表現(xiàn)包括患者血壓升高，肝臟腎臟功能損害，肺水腫，神經(jīng)系統(tǒng)異常等，具體實驗室指標(biāo)包括：蛋白尿、血肌酐，血小板計數(shù)、轉(zhuǎn)氨酶等[2，23]。本研究也比較了病例對照組中上述風(fēng)險指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)雖然大多數(shù)（如孕周、血小板計數(shù)、收縮壓、舒張壓、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 等）差異明顯，但其中一些指標(biāo)即使在病例組也與正常值參考范圍有重疊。這個現(xiàn)象提示風(fēng)險指標(biāo)預(yù)警可能并不絕對，且都是出現(xiàn)重度子癇前期病癥后表現(xiàn)出的風(fēng)險指標(biāo)預(yù)警。而GAS6 c.834+7G ＞A基因型可以在疾病發(fā)生之前進(jìn)行預(yù)警，將高危孕婦納入重點保護(hù)范圍，為可能的疾病發(fā)生提供及早及時的防治策略。

YE等[15]基于四川人群的研究表明，GAS6 c.834+7G ＞A位點的多態(tài)性在子癇前期（包括中度及重度）病例組和對照組間沒有明顯差別。分析YE等[15]對照組發(fā)現(xiàn)GAS6 c.834+7G ＞A位點的等位進(jìn)A 基因頻率（0.26）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于OZAKPINAR 等[14]統(tǒng)計的正常土耳其人及本研究結(jié)果中A 基因頻率（0.54），提示人群的遺傳異質(zhì)性可能會影響結(jié)果。而本研究基于本地區(qū)育齡婦女亦有可能有遺傳異質(zhì)性，期待更大規(guī)模納入中國各個不同地區(qū)的回顧性分析解決這一問題。

綜上，基于河北省育齡婦女的研究證明GAS6 c.834+7G ＞A的多態(tài)性與重度子癇前期風(fēng)險增加有關(guān)，且等位基因G和基因型GG可能是重度子癇前期的風(fēng)險因素，GAS6 c.834+7G ＞A的多態(tài)性基因分型可用于重度子癇前期的預(yù)后預(yù)斷。