miR-622在上皮性卵巢癌組織的表達(dá)差異及其機(jī)制

袁冠華 鄭銳年

廣東省南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院1 婦產(chǎn)科，2 腫瘤內(nèi)科（廣東東莞523000）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，約90%的卵巢癌為上皮性卵巢癌[1]。由于卵巢組織較為隱蔽，早期并沒有明顯的癥狀，多數(shù)患者確診時已經(jīng)為晚期，而且卵巢癌具有侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，預(yù)后效果較差，病死率高[2]。microRNA是在真核生物細(xì)胞體內(nèi)廣泛存在的高度保守短鏈RNA，由22～23個核苷酸組成，通過靶向結(jié)合目標(biāo)靶基因mRNA的3′-UTR 區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡的分子功能[3-4]。近年來，多項研究表明，microRNA 與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程以及患者預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。miR-622 作為近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)microRNA家族重要成員之一，在結(jié)直腸癌[7-8]、胃癌[9]、腎癌[10]、甲狀腺癌[11]、膽管癌[12]、卵巢癌等[13-15]多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞均具有異常表達(dá)，且參與了腫瘤細(xì)胞的惡性演進(jìn)等過程。然而，miR-622 參與卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程等生物分子機(jī)制鮮有報道。本研究主要探究miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白在卵巢癌組織的表達(dá)情況，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)研究miR-622與KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白的調(diào)控關(guān)系，旨在探究miR-622 參與卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生、惡化進(jìn)展的作用機(jī)制，為卵巢癌機(jī)制研究及基因治療提供資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)選取我院于2018年度經(jīng)確診為卵巢上皮性癌患者共80例，卵巢上皮性良性瘤40例，正常卵巢組織30例，每位患者都簽署知情同意書。卵巢上皮性癌選人標(biāo)準(zhǔn)：初次手術(shù)，之前未接受放化療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)確診為上皮性卵巢癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重疾病者，如免疫性疾病患者、嚴(yán)重精神病患者、確診為其他惡性腫瘤患者等。卵巢上皮性良性瘤患者年齡（52.5± 6.5）歲，其中黏液性腺瘤18例，漿液性腺瘤22例。正常卵巢組織患者年齡（57.8 ± 7.3）歲，均取自卵巢切除且病理確診無異?；颊?。

1.2 方法

1.2.1 提取和檢測RNARNA 提取與檢測按照TRIZOL 試劑盒說明書方法提取組織總RNA，并采用紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度與純度，以A280/A260 作為合格標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用miRcute miRNA 第一鏈合成試劑盒對提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cRNA，采用miRcute miRNA qPCR 試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。miR-622 上游引物以及內(nèi)參U6 上游引物分別購自于北京優(yōu)寧康生物公司以及北京嘉美紐諾生物公司。PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃15 min，變性95℃20 s，退火60℃30 s，72℃延伸10 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)，采用2-ΔΔCT方法計算miR-622 相對表達(dá)量。

1.2.2 測量KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相對表達(dá)水平免疫組化實驗應(yīng)用免疫組化SP 法測量組織樣品的KRAS蛋白、MAPK1蛋白以及p-ERK蛋白的相對表達(dá)水平。所有樣品都用10%的中性福爾馬林液進(jìn)行固定，用石蠟包埋后作成4 μm的連續(xù)切片，并進(jìn)行防脫處理，后嚴(yán)格按照SP 法進(jìn)行檢測。參照Prugger 等方法，根據(jù)細(xì)胞染色比例，制定評分標(biāo)準(zhǔn)[16]：0 分為0～1%陽性細(xì)胞、1 分為1%～10%陽性細(xì)胞、2 分為10%～50%陽性細(xì)胞、3 分為50%～75%陽性細(xì)胞、4 分為75%～100%陽性細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度，制定評分標(biāo)準(zhǔn)：0為未染色細(xì)胞、1 分為淡黃色細(xì)胞、2 分為棕黃色細(xì)胞、3 分為棕褐色細(xì)胞。最后將兩種評分兩兩相加計算最后總分，得分范圍為0～7 分。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株來自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，加入1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清，置于培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置條件為恒溫37℃、5%CO2以及95%空氣。應(yīng)用脂質(zhì)體（Lipofectami-neTM3000）作為載體分別將miR-622 模擬物（miR-622 上調(diào)組）、陰性對照物轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞株（miR-622 下調(diào)組），僅以脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染作為空白對照組（miR-622對照組）

1.2.4 Western Blot實驗細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)Western Blot實驗細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，用蛋白裂解液（PIPA）對細(xì)胞進(jìn)行裂解并分別提取3 組細(xì)胞的總蛋白，用Bradford 法測定細(xì)胞蛋白濃度，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過水浴變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶對PVDF 膜封閉1～2 h，分別加入KRAS、MAPK1 以及p-ERK 一抗以及適量封閉液，放置4℃冰箱過夜。加入二抗，室溫下孵育2 h，在暗室采用ECL 化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測，壓片顯影。顯示結(jié)果于X 光片，掃描圖片，并計算結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計，計量資料采用表示，比較兩者之間差異采用t檢驗方法，比較三者之間差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-622以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在3 組組織的表達(dá)3 組組織的miR-622表達(dá)以及多種蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），卵巢癌組織中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白均明顯高于正常卵巢組織以及良性瘤組織（P＜0.05），而良性瘤組織與正常卵巢組織差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 MiR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在卵巢癌組織表達(dá)與相關(guān)關(guān)系卵巢癌組織中的miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK 蛋 白表 達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤病理類型無關(guān)（P＞0.05），F(xiàn)IGO 處于Ⅲ-Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），此外，KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表達(dá)（P＜0.05）。見表2。

表1 miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在不同組織的表達(dá)Tab.1 The expression of miR-622，KRAS，MAPK1，p-ERK in different issure±s

表1 miR-622 以及KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白在不同組織的表達(dá)Tab.1 The expression of miR-622，KRAS，MAPK1，p-ERK in different issure±s

注：與正常卵巢組織對比，*P ＜0.05

指標(biāo)正常卵巢組織良性瘤組織卵巢癌組織F 值P 值例數(shù)30 40 80 miR-622 相對表達(dá)2.02±0.22 2.05±0.21 2.45±0.41* 60.33＜0.001 KRAS蛋白/分1.67±0.49 1.75±0.51 3.89±1.12* 126.81＜0.001 MAPK1蛋白/分1.62±0.45 1.64±0.49 4.05±1.58* 62.77＜0.001 p-ERK蛋白/分1.17±0.22 1.21±0.24 3.08±1.19* 104.93＜0.001

表2 miR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between miR-622 and KRAS，MAPK1，p-ERK，pathological parameters of ovarian cancer±s

表2 miR-622 與KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between miR-622 and KRAS，MAPK1，p-ERK，pathological parameters of ovarian cancer±s

注：*P ＜0.05

FIGO 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期病理類型漿液性腺癌黏液性腺癌分化程度高分化中低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移否是28 52 59 21 29 51 45 35 2.01±0.15 2.89±0.49* 2.40±0.30 2.50±0.34 2.38±0.31 2.52±0.33 2.28±0.23 2.62±0.41* 3.52±0.89 4.26±1.15* 3.59±0.91 4.19±1.13* 3.48±0.86 4.30±1.18* 3.51±0.89 4.27±1.15* MAPK1蛋白/分4.01±1.50 4.09±1.54 4.11±1.56 3.99±1.48 3.68±1.22 4.42±1.82* 4.01±1.35 4.09±1.69 3.99±1.45 4.11±1.59 3.61±1.32 4.49±1.72* p-ERK蛋白/分3.01±1.00 3.15±1.16 3.18±1.21 2.98±0.95 2.78±0.82 3.38±1.34* 3.04±0.95 3.12±1.21 3.01±0.91 3.15±1.25 2.58±0.73 3.58±1.43*

2.3 MiR-622 調(diào)控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)Western Blot檢測結(jié)果顯示，3組樣本的miR-622 以及多種蛋白相對表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與miR-622對照組相比，miR-622上調(diào)組中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），而miR-622 下調(diào)組中的KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白水平表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 miR-622 調(diào)控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)Tab.3 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622±s

表3 miR-622 調(diào)控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)Tab.3 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622±s

注：*P ＜0.05

指標(biāo)miR-622對照組miR-622下調(diào)組miR-622上調(diào)組F值P值miR-622相對表達(dá)2.68±0.51 0.23±0.09* 12.55±1.12* 1 161.85＜0.001 KRAS蛋白0.53±0.05 0.24±0.03* 0.78±0.11* 248.20＜0.001 MAPK1蛋白0.62±0.08 0.31±0.03* 0.94±0.13* 111.42＜0.001 p-ERK蛋白0.59±0.05 0.15±0.01* 0.89±0.12* 372.60＜0.001

3 討論

圖1 miR-622 調(diào)控KRAS、MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)Fig.1 The expression of KRAS、MAPK1、p-ERK controlled by miR-622

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，據(jù)統(tǒng)計研究，晚期患者 5年生存率不到30%[17-18]。由于缺乏早期有效的篩查方法，大多數(shù)病人在確診后都已到晚期，癌細(xì)胞已廣泛轉(zhuǎn)移。因此，卵巢癌早期的診斷以及治療方法是當(dāng)前探索的當(dāng)務(wù)之急。近年，microRNAs是各個領(lǐng)域研究的重點(diǎn)方向之一，microRNA是在真核生物細(xì)胞體內(nèi)廣泛存在的高度保守短鏈RNA，由22～23個核苷酸組成，通過靶向結(jié)合目標(biāo)靶基因mRNA的3′-UTR 區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡的分子功能。miR-622 作為近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)microRNA 家族重要成員之一，并且在多種惡性腫瘤有廣泛的研究報道[19]。然而，miR-622在卵巢癌的國內(nèi)外研究報道較少。至于miR-622是如何參與卵巢癌細(xì)胞的發(fā)生、惡性演進(jìn)等鮮有研究報道。

在本研究中，結(jié)果顯示miR-622在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)水平高于卵巢良性上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織，miR-622在卵巢癌組織的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、病理類型以及分化程度無關(guān)，僅與FIGO 分期以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)IGO處于Ⅲ～Ⅳ期miR-622表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miR-622表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)移狀態(tài)，這可能與miR-622 上調(diào)能夠促進(jìn)卵巢細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白在卵巢癌組織表達(dá)水平高于良性腫瘤組織和正常組織，F(xiàn)IGO 處于Ⅲ～Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，KRAS、MAPK1、p-ERK 三種蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)的FIGO 處于Ⅰ～Ⅱ期以及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，此外還發(fā)現(xiàn)KRAS蛋白在中低分化以及黏液性卵巢癌呈高表達(dá)。KRAS在卵巢癌組織呈高表達(dá)，這與KURMAN 等[20]報道的KRAS基因突變在卵巢癌中較常見，多見于低分化，低FIGO 分期和黏液性組織類型一致，突變后的KRAS蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)。MAPK1 與p-ERK蛋白在卵巢癌組織呈高表達(dá)可能與MAPK/ERK信號通路被激活有關(guān)。實驗結(jié)果顯示KRAS、MAPK1、p-ERK 三種蛋白可能都參與了卵巢癌惡化演進(jìn)過程[21-22]。

MAPK/ERK信號通路是真核細(xì)胞普遍存在的信號通路，主要負(fù)責(zé)連接細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的通道。據(jù)統(tǒng)計，1/3 人類腫瘤發(fā)生與該通路的突變或激活密切相關(guān)，MAPK/ERK信號通路的激活可以引起腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性演進(jìn)。本實驗結(jié)果顯示，通過調(diào)節(jié)SKOV3細(xì)胞miR-622表達(dá)升高，可以調(diào)控細(xì)胞MAPK1、p-ERK蛋白表達(dá)升高，可能與MAPK/ERK信號通路的激活有關(guān)，具體機(jī)理有待下一步探究。研究還發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中的miR-622表達(dá)水平也明顯高于正?；蛄夹粤鼋M織，而且miR-622能夠調(diào)控MAPK1以及p-ERK蛋白的表達(dá)，顯示miR-622 與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。KRAS 基因突變在卵巢癌中較常見，KRAS 作為卵巢癌靶向基因之一，與卵巢癌的發(fā)生與惡性演進(jìn)密切相關(guān)。研究結(jié)果表明調(diào)節(jié)SKOV3細(xì)胞miR-622表達(dá)升高，能夠調(diào)控KRAS 基因蛋白表達(dá)的上升，進(jìn)一步驗證miR-622 與卵巢癌發(fā)生與惡性演進(jìn)相關(guān)。張志方等[13]研究表明調(diào)節(jié)細(xì)胞miR-622 上升能夠促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，miR-622在上皮性卵巢癌組織中呈高表達(dá)，能夠調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中KRAS、MAPK1、p-ERK多種蛋白的表達(dá)，并且參與卵巢癌的發(fā)生以及惡性演進(jìn)。