葉惠榮, 吳麗華, 張玉娟, 高學(xué)忠, 王西躍, 曹茵
[關(guān)健詞] 人乳腺癌MCF?7細(xì)胞;靈菌紅素;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡
乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤,是女性第二大惡性腫瘤,發(fā)病年齡日趨年輕化,嚴(yán)重威脅女性身心健康[1]。約15%~20%的乳腺癌患者會(huì)發(fā)生骨、肺和腦轉(zhuǎn)移,乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的5年生存率僅為20%[2]。研究與開(kāi)創(chuàng)各類治療乳腺癌的藥物和方法具有十分重要的意義。
靈菌紅素(prodigiosin,PG)是一類天然紅色素家族的總稱,由多種放線菌和細(xì)菌屬產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,PG的生物學(xué)活性主要包括免疫抑制、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾等[3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PG在治療腫瘤方面具有重大潛力,美國(guó)癌癥研究所Melvin等[4]研究發(fā)現(xiàn)PG濃度為2.1 μmol/L時(shí)對(duì)57中不同腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性、對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)明顯毒副作用,提示PG對(duì)腫瘤細(xì)胞作用具有靶向性。既往研究顯示PG能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞[5]、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[6]、口腔鱗癌細(xì)胞[7]、急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞[8]等。然而尚不清楚其對(duì)乳腺癌MCF?7細(xì)胞的凋亡調(diào)控作用和機(jī)制,因此本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討PG調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制。
人乳腺癌細(xì)胞系MCF?7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生命化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。
靈菌紅素Prodigiosin(CAS號(hào) 56144?17?3,Sig?ma公司),MEM培養(yǎng)基(Gibco公司),Bim抗體(#2933,CST公司),β?Tubulin Antibody抗體(#2146,CST公司),CCK8試劑盒(Catalog no.C0009,碧云天公司),TUNNEL試劑盒(Catalog no.12 156 792 910;Roche公司),慢病毒LV?sh Bim購(gòu)自百恩維生物。
培養(yǎng)MCF?7細(xì)胞,使用不同濃度PG培養(yǎng)液處理(0、1、2、4、8、16 μg/mL),于24、48、及72小時(shí)收集細(xì)胞,MTT檢測(cè)細(xì)胞增值率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。RT?PCR及Western Blot檢測(cè)Bim(Bcl?2?interacting mediator of cell death)表達(dá)情況。為了進(jìn)一步明確靈菌紅素通過(guò)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡,構(gòu)建Bim siRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)MCF?7細(xì)胞中Bim表達(dá)情況以確保沉默效率;檢測(cè)MCF?7細(xì)胞中Bim沉默后,PG對(duì)MCF?7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)情況。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF?7細(xì)胞,重懸浮后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔板中。24小時(shí)后分別加入不同濃度的PG培養(yǎng)液處理(0、1、2、4、8、16 μg/mL),每個(gè)濃度組平行4孔。PG處理24、48、及72 h后每孔加入MTT 100 μL,置于培養(yǎng)箱中4 h。棄上清、加入DMSO 100 μL,避光震蕩10 min后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞存活率=測(cè)試組OD平均值/對(duì)照組OD平均值×100%。
消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,依據(jù)說(shuō)明書(shū)將MCF?7細(xì)胞1×105/mL加入96孔板,分別給予不同分組刺激后,移除上清液并無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗,配置TUNEL孵育液并加入MCF?7細(xì)胞中孵育1 h,棄去TUNEL并PBS清洗一遍,加入DAPI(1 μg/mL)避光孵育15 min,加入抗熒光淬滅液,最后熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。
依據(jù)說(shuō)明書(shū)將MCF?7細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板,分別給予不同分組刺激后,移除上清液、PBS清洗、胰酶消化、血清終止,離心后重懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105~1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液至流式細(xì)胞管中,加入Annexin V?FITC 5 μL和10 mg/L碘化丙啶(PI)10 μL,混勻后室溫避光孵育15 min,加入400 μL結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M細(xì)胞數(shù))/(G0/G1+S+G2/M細(xì)胞數(shù))×100%;凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。
收集處理好的各組細(xì)胞、PBS洗滌后提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。羅氏Light?Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min,95℃變性 5 s,60℃退火34 s,40次循環(huán)后,95℃變性15 s,60℃退火1 min,95℃再變性 15 s,GAP?DH 作為內(nèi)參。引物序列為:GAPDH?F:5′?CCA GAA CAT CAT CCC TGC CTC TAC T?3′,GAPDH?R:5′?GGT TTT TCT AGA CGG CAG GTC AGG T?3′;Bim?F:5′?CTG CAG ATA TGC GCC CAG AGA T?3′,Bim?R:5′?CACCAGGCGGACAATGTA ACG?3′。
采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示;組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
MTT法檢測(cè)PG處理后MCF?7細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PG對(duì)MCF?7細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用,抑制作用呈時(shí)間濃度依賴。PG對(duì)MCF?7細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度(IC50)不盡相同,在24、48及 72 h的 IC50值分別為 11.8、6.2、3.9 μg/mL。見(jiàn)圖1。
為了進(jìn)一步檢測(cè)PG對(duì)MCF?7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,我們采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示在PG處理下,處于S期的MCF?7細(xì)胞數(shù)目顯著升高,作用效果呈濃度依賴性,結(jié)果提示PG能影響MCF?7細(xì)胞的增殖周期。PG處理后MCF?7細(xì)胞S期顯著減少、增殖指數(shù)下降,G1期顯著增加,提示PG通過(guò)抑制S期細(xì)胞DNA復(fù)制,從而抑制MCF?7細(xì)胞進(jìn)一步分裂增殖。(圖2)。
為檢測(cè)PG對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡的影響,我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示PG能促進(jìn)MCF?7細(xì)胞凋亡,并呈劑量濃度依賴性。對(duì)照組MCF?7細(xì)胞凋亡率約 3.6%,1、2、4 μg/mL的 PG處理MCF?7細(xì)胞24小時(shí)后,其早期凋亡率呈濃度梯度上升趨勢(shì),此外PG促凋亡效果呈劑量依賴性(圖 3)。
上面研究顯示PG能夠促進(jìn)MCF?7細(xì)胞凋亡,然而其具體機(jī)制不清。Bim是重要的凋亡相關(guān)蛋白,因此我們檢測(cè)PG是否通過(guò)Bim從而調(diào)控凋亡。RT?PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PG能夠促進(jìn)MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim mRNA及蛋白的表達(dá),并且呈濃度、時(shí)間依賴性(圖4)。
鑒于PG能夠上調(diào)MCF?7細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bim的表達(dá),我們推測(cè)PG可能通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們采用特異性Bim小干擾siRNA沉默MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim表達(dá),將Bim?siRNA及對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染MCF?7細(xì)胞,24小時(shí)后加入PG處理。RT?PCR及Western Blot結(jié)果顯示Bim?siRNA轉(zhuǎn)染后,MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim RNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示Bim?siRNA能抑制PG對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用,MCF?7細(xì)胞細(xì)胞早期凋亡率明顯減少,提示PG通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡(圖 5/6)。
乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤,研究顯示乳腺癌發(fā)病率已躍升至女性惡性腫瘤的第二位、并且具有年輕化趨勢(shì)。乳腺癌的高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)嚴(yán)重威脅著女性的身心健康,其預(yù)防和治療已成為國(guó)際急需解決的難題。
PG一類由多種細(xì)菌、放線菌產(chǎn)生的具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其分子結(jié)構(gòu)特征是含有一個(gè)三吡咯環(huán)的大共軛體系骨架。PG具有抗腫瘤活性、免疫抑制活性和抗微生物活性,因而得到廣泛的研究。1977年Fullan等[9]首次證實(shí)PG在體內(nèi)具有抗腫瘤活性,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有抗腫瘤活性。鑒于PG良好的抗腫瘤活性,藥物學(xué)家已經(jīng)合成了多種PG衍生物,如GX15?070具有更好的免疫抑制活性和更低的毒性,已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ試驗(yàn)[10]。既往研究顯示PG能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性,其能對(duì)包括結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、淋巴細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用。Yenkejeh等[5]發(fā)現(xiàn)PG能抑制原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、效果呈劑量依賴性,并且PG是通過(guò)抑制survivin蛋白從而發(fā)揮其促凋亡活性。Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PG通過(guò)激活JNK通路及抑制AKT/mTOR通路,從而促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡。Campàs等[11]發(fā)現(xiàn)PG能誘導(dǎo)慢性B細(xì)胞淋巴瘤性白血病患者的B細(xì)胞凋亡,細(xì)胞半數(shù)抑制率IC50位116±25 nM。Cheng等[7]發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞中PG通過(guò)P62/LC3?I/LC3?II通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡。此外PG還通過(guò)激活P38?MAPK磷酸化,從而誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡[12]。PG還具有拓?fù)洚悩?gòu)酶的雙重活性,能誘導(dǎo)單鏈和雙鏈DNA裂解,從到引起細(xì)胞周期阻滯,此過(guò)程伴或不伴有細(xì)胞凋亡[13]。
本文研究了PG抗乳腺癌的藥效作用,及其抗癌機(jī)制做了初步探討。MTT結(jié)果顯示PG能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、且與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān),作用24小時(shí)的IC50值為24 μg/mL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PG能通過(guò)抑制S期MCF?7細(xì)胞DNA復(fù)制使其停滯與G2期,從而抑制其進(jìn)一步分裂增殖。隨后本研究采用流式細(xì)胞儀及TUNNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PG調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡的作用,流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低濃度的PG在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡并不明顯,但隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)以及藥物濃度升高,MCF?7細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì),提示PG誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡呈時(shí)間、藥物濃度依賴性。
Bim的全稱是Bcl2 interaction mediator of cell death,Bim接到凋亡刺激后就會(huì)與LC8一起從復(fù)合體上解離出來(lái)游離在胞漿中,并拮抗LC8和Bcl2的功能、從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。既往研究顯示Bim具有抗腫瘤活性,表達(dá)與多種惡性腫瘤,如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及非小細(xì)胞肺癌等,Bim表達(dá)上調(diào)能引起腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。為了研究Bim在PG誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡中的作用,本研究采用RT?PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PG能誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞中Bim高表達(dá),提示PG可能通過(guò)Bim發(fā)揮其促凋亡作用。進(jìn)一步我們采用siRNA將MCF?7細(xì)胞中Bim沉默,流式細(xì)胞檢測(cè)顯示Bim沉默能抑制PG對(duì)MCF?7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
綜上所述,本研究通過(guò)干擾RNA等試驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)靈菌紅素與MCF?7細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)程,并且靈菌紅素能通過(guò)上調(diào)Bim,從而抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。研究提示靈菌紅素作為新型抗腫瘤藥物,具有一定的應(yīng)用前景,其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。