蚯蚓堆制花生殼的微生物群落結(jié)構(gòu)特征研究

陳玉香 姚 月 趙婷婷 杜召振 徐立新

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 長(zhǎng)春 130022; 2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

0 引言

世界各地廣泛種植花生，年產(chǎn)量約為4 600萬(wàn)t[1]。中國(guó)是世界上最大的花生生產(chǎn)國(guó)，每年生產(chǎn)大約1 300萬(wàn)t花生，占世界總產(chǎn)量的28.3%?；ㄉa(chǎn)量的增加導(dǎo)致生產(chǎn)地區(qū)積累了大量花生殼。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每生產(chǎn)1 kg花生可產(chǎn)生230～300 g花生殼[2]，全世界每年生產(chǎn)大約1 370萬(wàn)t花生殼[1]。目前，研究者正努力尋求回收利用這種農(nóng)業(yè)殘余物的有效途徑。例如，用花生殼制作發(fā)酵產(chǎn)氫的輔助底物[3]、生物活性低聚糖[4]、土壤改良劑[5]?；ㄉ鷼し勰┛捎糜谠鰪?qiáng)環(huán)氧復(fù)合材料的機(jī)械性能和熱性能[6]，花生殼也用作固體燃料[7]或者飼料[4]。但只有少部分花生殼用于燃料等用途，其余幾乎全部作為廢棄物處理[8]。丟棄的花生殼易發(fā)生微生物腐敗，造成嚴(yán)重環(huán)境污染。因此，合理利用花生殼不僅有利于保護(hù)環(huán)境，還可以開發(fā)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化的新途徑。

花生殼主要由多糖和木質(zhì)素組成，與其他農(nóng)業(yè)殘余物不同，花生殼中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常高于40%[4]，增大了降解難度，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。作為分解和利用有機(jī)廢棄物的環(huán)境友好方式，堆肥受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。與無(wú)機(jī)肥相比，堆肥具有促進(jìn)腐殖質(zhì)(土壤有機(jī)質(zhì)的主體部分)形成、改善植物生長(zhǎng)并有效抑制植物病原體等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。由于花生殼具有高木質(zhì)素含量，難于被降解，通過(guò)傳統(tǒng)堆肥方式降解穩(wěn)定花生殼不容易實(shí)現(xiàn)。蚯蚓堆制是一種廣泛使用的降解穩(wěn)定有機(jī)廢棄物的方法，得到的堆制物氮、磷和腐殖酸含量適合用于土壤改良劑[12]。堆制過(guò)程涉及到微生物和蚯蚓的共同作用。微生物在有機(jī)廢棄物的分解和穩(wěn)定中起主要作用，蚯蚓具有促進(jìn)作用。蚯蚓堆制成功用于各種木質(zhì)纖維素類廢棄物，如甘蔗渣[13]、落葉[14]和中藥渣[15]等。迄今為止，關(guān)于蚯蚓堆制花生殼的研究很少。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)蚯蚓不喜食富含木質(zhì)素的有機(jī)廢棄物，在無(wú)其他食物情況下，蚯蚓被迫取食富含木質(zhì)素的物質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致蚯蚓體重下降甚至死亡[16]。

本文探索蚯蚓堆制花生殼的可行性，揭示蚯蚓堆制花生殼過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

1 材料和方法

1.1 底物和蚯蚓物種

花生殼收集自山東省菏澤市某農(nóng)場(chǎng)，并經(jīng)400Y型多功能粉碎機(jī)粉碎處理。牛糞從吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部養(yǎng)殖場(chǎng)收集。將物料風(fēng)干至含水率為15%，然后儲(chǔ)存在干燥的塑料容器中。物料的化學(xué)特征如表1所示。供試蚯蚓為赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)，購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。選擇成年蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)研究。將蚯蚓置于含有牛糞、粉碎的花生殼混合底物中，25℃，15 d，使其適應(yīng)底物。

表1 初始底物的化學(xué)特征Tab.1 Chemical characteristics of initial substrates

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)次數(shù)為3次。

1.2 蚯蚓堆制體系和取樣方法

在開始堆制時(shí)向花生殼中添加牛糞，以降低花生殼的碳氮比，使其適于蚯蚓堆制。將粉碎的花生殼與牛糞以60∶40的比例混合(基于干質(zhì)量)。蚯蚓堆制在塑料花盆(上口內(nèi)徑為18 cm，下口內(nèi)徑為10 cm，盆高為22 cm)中進(jìn)行。每個(gè)花盆中放入1 000 g混合物料。分為兩種處理：對(duì)照組(CK)，為不接種蚯蚓的混合底物；接種蚯蚓處理組(T)，每個(gè)花盆接種120條赤子愛(ài)勝蚓成蚓(平均體質(zhì)量為0.3 g)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在接種蚯蚓之前，將盛有底物的塑料花盆室溫(25℃)下放置15 d，隔天噴水以進(jìn)行預(yù)堆制。初始混合底物標(biāo)記為T0。所有花盆都用紗網(wǎng)覆蓋并放置實(shí)驗(yàn)室中，室溫保持約25℃。通過(guò)定期噴灑足量的無(wú)菌水，使基質(zhì)含水率保持在55%～65%[15]。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為48 d。將蚯蚓接種于底物后，每隔12 d取樣一次(保證取樣前后各花盆中蚯蚓接種率不變)。CK1、CK2、CK3、CK4和T1、T2、T3、T4均分別表示在第12、24、36、48天取樣。在每個(gè)采樣日，對(duì)成年蚯蚓(成蚓)、幼蚯蚓(幼蚓)和蚓繭進(jìn)行人工分選并記錄數(shù)量。將堆制底物樣品在-70℃下冷凍保存，以進(jìn)行化學(xué)成分和微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3 化學(xué)成分分析

采用重鉻酸鉀和濃硫酸氧化法測(cè)定總有機(jī)碳(TOC)含量[17]。總氮(TN)含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定[18]。用對(duì)應(yīng)的TOC和TN計(jì)算各采樣日期的碳氮比。使用數(shù)字pH計(jì)測(cè)定pH值。將堆制物以1∶10(質(zhì)量比)的比例置于雙蒸水中，振蕩20 min，定性濾紙過(guò)濾，收集濾液用于測(cè)定pH值[19]。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量通過(guò)Van Soest方法測(cè)定[20]。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

采用E.Z.N.A. DNA提取試劑盒(OMEGA Biotek.,美國(guó))，按照說(shuō)明書步驟，分離提取DNA。從0.2 g樣品中提取基因組DNA，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA純度，用于后續(xù)微生物群落分析。細(xì)菌引物序列為V338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和V806R(5′-ATGCAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)[21]。真菌引物序列為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，擴(kuò)增真菌18S rRNA基因的ITS序列[22]。所有PCR反應(yīng)均按文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。純化的PCR產(chǎn)物用于高通量測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。采用微生物生態(tài)學(xué)定量分析方法[24]進(jìn)行序列分析。使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，按照序列一致性為97%將序列聚類成操作分類單元(OTUs)[25]，計(jì)算豐度和多樣性指數(shù)(ACE、Chao 1和Shannon-Wiener)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩因素方差分析用于確定采樣日期和蚯蚓接種對(duì)底物碳氮比變化的影響。單因素方差分析用于分析采樣日期對(duì)成年蚯蚓、幼蚯蚓和蚓繭數(shù)量的影響。采用T檢驗(yàn)比較細(xì)菌和真菌組成在屬水平上的差異。所有結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓堆制過(guò)程中TOC、TN含量和碳氮比的變化

蚯蚓堆制過(guò)程中TOC、TN含量的變化如表2所示。初始物料TOC質(zhì)量比為412.69 g/kg。在蚯蚓堆制結(jié)束時(shí)，蚯蚓處理組和對(duì)照組的TOC質(zhì)量比分別為328.63、359.81 g/kg。在整個(gè)蚯蚓堆制過(guò)程中TOC含量呈下降趨勢(shì)，同一處理組不同時(shí)間的樣品間有顯著性差異(p<0.05)。蚯蚓處理組與對(duì)照組之間也存在顯著差異(p<0.05)。蚯蚓處理組TOC含量下降速度明顯快于對(duì)照組。許多研究也報(bào)道了堆制過(guò)程中TOC含量的減少情況[26-27]，這主要是由于有機(jī)碳在分解過(guò)程中以CO2的形式釋放，一方面是蚯蚓以及微生物呼吸作用；另一方面是因?yàn)門OC的礦化作用。TN含量在蚯蚓堆制過(guò)程中呈上升趨勢(shì)。最初底物的TN質(zhì)量比為10.92 g/kg。堆制結(jié)束時(shí)，蚯蚓堆制組和對(duì)照組的TN質(zhì)量比分別為24.77、15.54 g/kg。在初始階段，蚯蚓處理組與對(duì)照組之間的TN含量沒(méi)有顯著差異。從第36天開始，蚯蚓處理組與對(duì)照組的TN含量存在顯著差異(p<0.05)。ARUMUGAM等[26]報(bào)道，TN含量的增加可能與蚯蚓分泌粘液、含氮排泄物質(zhì)、促生長(zhǎng)激素和酶有關(guān)。在蚯蚓處理組觀察到更高的TN含量，這與ARUMUGAM等觀點(diǎn)一致。在整個(gè)堆制過(guò)程中碳氮比呈下降趨勢(shì)(圖1)。初始底物的碳氮比約為37.00。第12天CK和T處理的碳氮比分別為34.12和31.91。第36天，CK和T處理的碳氮比分別為25.01和19.77。第48天，相應(yīng)的值分別為23.17和13.28。碳氮比降低是由于在蚯蚓堆制過(guò)程中TOC含量的降低和TN含量的增加[26]，碳氮比降低也歸因于有機(jī)氮的礦化速率低于有機(jī)碳的礦化速率[28]。接種蚯蚓顯著降低碳氮比(F(1,20)=409.795,p<0.001)。此外，蚯蚓的作用與采樣時(shí)間有關(guān)(F(4,20)=1.271×103,p<0.001)，蚯蚓處理與采樣時(shí)間之間存在顯著的交互作用(F(4,20)=85.210,p<0.001)?？梢杂锰嫉缺碚鞫阎莆锪系某墒於取?duì)于堆制物，碳氮比低于20是可接受的[29]。第36天時(shí)，蚯蚓堆制物料的碳氮比低于20.00。然而在對(duì)照組中該比率大于20.00，表明堆制物料不穩(wěn)定。第48天，蚯蚓處理組的碳氮比小于15.00，而對(duì)照組中則為23.17。堆制物碳氮比為15或更低，則適合于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[30]。本結(jié)果表明，蚯蚓對(duì)花生殼的降解穩(wěn)定具有促進(jìn)作用。

表2 堆制過(guò)程中TOC、TN含量的變化Tab.2 Changes in TOC and TN during vermicomposting g/kg

注: 同一列不同小字字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

圖1 蚯蚓堆制過(guò)程中底物的碳氮比變化曲線Fig.1 C/N ratios of substrates during vermicomposting

2.2 蚯蚓堆制過(guò)程中蚯蚓數(shù)量的變化

在堆制期間每次取樣時(shí)，將蚓繭和幼蚓取出并置于另外的容器中培養(yǎng)。在每個(gè)采樣日記錄成蚓、幼蚓和蚓繭的數(shù)量(表3)。在堆制過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有蚯蚓死亡，到蚯蚓堆制結(jié)束時(shí)，死亡率為19%。一般來(lái)說(shuō)，堆制系統(tǒng)中，蚯蚓的存活主要取決于其所能獲得底物化學(xué)成分[31]。此外，有機(jī)物的分解產(chǎn)物如氨、氮氧化物、二氧化碳、有機(jī)酸和其他中間化合物也可能導(dǎo)致蚯蚓死亡[32]。除了上述原因外，花生殼中高含量木質(zhì)素也可能導(dǎo)致蚯蚓死亡。木質(zhì)素含量對(duì)蚯蚓存活的不利影響已被報(bào)道[16]。盡管有少量蚯蚓死亡，蚯蚓處理組中花生殼的分解速率仍比對(duì)照組快得多。在蚯蚓堆制過(guò)程中，蚓繭和幼蚓的出現(xiàn)表明該蚯蚓品種對(duì)花生殼類底物具有一定適應(yīng)性，可以采用蚯蚓堆制降解穩(wěn)定花生殼。

表3 蚯蚓堆制期間成蚓、幼蚓和蚓繭的數(shù)量Tab.3 Number of adult earthworms, juvenile earthworms and cocoons during vermicomposting

2.3 微生物群落的豐富性和多樣性

每個(gè)處理組的細(xì)菌和真菌稀釋曲線表明，樣本量足以表征兩種處理方式下微生物多樣性的差異(圖2)。為分析樣品微生物群落的豐富性和多樣性，設(shè)置97%相似度水平下，每種處理的OTUs數(shù)量如表4所示。在初始混合底物中，細(xì)菌和真菌的OTUs數(shù)量分別為1 154和111。在第12天采集的樣本中，對(duì)照組和蚯蚓堆制組中細(xì)菌的OTUs數(shù)量分別為1 354和1 382，真菌的OTUs數(shù)量分別為104和165。這表明與對(duì)照組相比，蚯蚓處理組的OTUs數(shù)量增加。在第2次采集樣品中，蚯蚓處理組真菌的OTUs數(shù)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組。然而，蚯蚓處理組中細(xì)菌的OTUs數(shù)量略低于對(duì)照組。這與MOODY等[33]的觀點(diǎn)不同：MOODY等認(rèn)為，蚯蚓可以選擇性地以某些真菌為食，從而導(dǎo)致堆制物中真菌多樣性有一定下降。在蚯蚓堆制過(guò)程中，ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)的變化趨勢(shì)與OTUs數(shù)量變化趨勢(shì)一致(表4)。對(duì)于細(xì)菌，Shannon-Wiener指數(shù)在堆制期間隨時(shí)間沒(méi)有顯著變化，該值約為5。然而對(duì)于真菌，蚯蚓處理組的Shannon-Wiener指數(shù)遠(yuǎn)高于相應(yīng)對(duì)照組。初始底物中真菌的Shannon-Wiener指數(shù)為1.33，在第1次采樣時(shí)，蚯蚓處理組的Shannon-Wiener指數(shù)為2.56，對(duì)照組中為1.42。在堆制結(jié)束時(shí)，蚯蚓處理組和對(duì)照組的Shannon-Wiener指數(shù)分別為2.59和1.66。這表明蚯蚓的存在增加了真菌的多樣性。本研究結(jié)果與中藥渣蚯蚓堆制獲得的結(jié)果不同[34]，文獻(xiàn)[34]中蚯蚓堆制物料的細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)高于6。然而，在本研究中，觀察到細(xì)菌活性受到些許抑制，這可能是由于所使用的底物不同。

圖2 細(xì)菌16S rRNA和真菌18S rRNA序列的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of sequences of bacterial 16S rRNA and fungal 18S rRNA depicting effect of 3% dissimilarity on number of OTUs identified in samplings

2.4 微生物群落的相似性

采用聚類分析可更好地了解每種處理組微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性(圖3)。在樹狀圖中分離出2個(gè)分支，第1個(gè)分支代表蚯蚓處理組的細(xì)菌或真菌群落，第2個(gè)分支是對(duì)照組和初始混合底物中的細(xì)菌或真菌群落。蚯蚓處理的細(xì)菌相似度為82%(圖3a)，初始底物的細(xì)菌組成更接近于對(duì)照組。對(duì)于真菌(圖3b)，初始底物與對(duì)照組相似度達(dá)到88%，蚯蚓處理組為87%。該結(jié)果表明初始底物的微生物組成與對(duì)照組的微生物組成更為相似，蚯蚓在改變微生物的組成中起重要作用。

非度量多維尺度(NMDS)分析表明，蚯蚓堆制組的微生物群落結(jié)構(gòu)與初始底物、對(duì)照組不同(圖4)。細(xì)菌(圖4a)和真菌(圖4b)均分為兩組，一個(gè)是蚯蚓處理組，另一個(gè)是對(duì)照組與初始底物。NMDS1顯示蚯蚓處理組微生物群落與對(duì)照組和初始底物的不同。此外，對(duì)照組中的NMDS2比蚯蚓處理組的變異性更大。圖4a中，蚯蚓堆制組中的T1遠(yuǎn)離T2、T3和T4，這一現(xiàn)象表明，蚯蚓堆制初期與后期的細(xì)菌組成有差異，這也說(shuō)明了蚯蚓對(duì)花生殼分解的促進(jìn)作用與時(shí)間有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了樹狀圖所顯示的結(jié)果。

表4 97%相似水平下16S rRNA和18S rRNA基因文庫(kù)的操作分類單元數(shù)及群落豐富度和多樣性指數(shù)的比較Tab.4 Comparison of operational taxonomic units (OTUs) richness and diversity indices of 16S rRNA and 18S rRNA gene libraries for clustering at 97% identity

注:括號(hào)中的數(shù)據(jù)表示置信區(qū)間。

2.5 微生物群落的組成

表5顯示了門分類水平的微生物組成。對(duì)于細(xì)菌，在兩種處理組優(yōu)勢(shì)微生物門類是Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi，占細(xì)菌總量的88%～95%。其中以Proteobacteria最多，其次為Actinobacteria。在其他堆制體系中，Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes也經(jīng)常作為優(yōu)勢(shì)微生物出現(xiàn)[35-36]。PARTANEN等[37]認(rèn)為在堆制過(guò)程中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌通常是Chloroflexi。Actinobacteria是成熟堆制物的一類代表性細(xì)菌[38]，并且被認(rèn)為是重要的木質(zhì)纖維素降解物[39]。在本研究蚯蚓處理組中，Actinobacteria的相對(duì)豐度隨著時(shí)間的推進(jìn)而增加，蚯蚓處理組底物的降解速度快于對(duì)照組，并且在堆制過(guò)程結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，這表明堆制物成熟。Bacteroidetes能夠降解包括纖維素和幾丁質(zhì)在內(nèi)的大分子[40]。在許多研究中證明了Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在有機(jī)物的降解，硫、氮和碳循環(huán)中也起到了重要作用[41]。但是PENG等[42]證實(shí)，Bacteroidetes不利于好氧堆肥，因?yàn)樗梢詫⒛举|(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為小分子脂肪酸鏈，從而降低堆肥的pH值。與對(duì)照組相比，F(xiàn)irmicutes的豐度在蚯蚓處理組呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)irmicutes可產(chǎn)生纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶和其他胞外酶，并代謝多種底物，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、木質(zhì)素、纖維素、糖和氨基酸[43]。值得注意的是，與對(duì)照組相比，堆制初期蚯蚓處理組Saccharibacteria的相對(duì)豐度迅速增加。AWASTHI等[44]在堆制明膠工業(yè)污泥過(guò)程中添加高劑量生物炭發(fā)現(xiàn)Saccharibacteria的存在，認(rèn)為生物炭與初始堆制底物混合，可以確保有效的孔隙率和通風(fēng)狀況，提高微生物活性。在本研究中，蚯蚓在堆制物料內(nèi)的爬行改善了氧的通透性，其作用類似于生物炭的添加。因此，蚯蚓處理組Saccharibacteria的相對(duì)豐度迅速增加。對(duì)于真菌，在蚯蚓處理組和對(duì)照組中，Ascomycota和unclassfied_k_Fungi是主要的微生物門類。這些結(jié)果與AWASTHI等[44]研究結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，Ascomycota在好氧堆制過(guò)程中普遍存在[45]。Ascomycota的豐度隨著時(shí)間的推進(jìn)而減少，而unclassfied _k_Fungi呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。

圖3 細(xì)菌和真菌測(cè)序結(jié)果的聚類分析Fig.3 Cluster analysis based on sequencing taxonomy of bacteria and fungi

圖4 細(xì)菌和真菌測(cè)序結(jié)果的NMDS維度分析Fig.4 NMDS dimension analysis based on sequencing taxonomy of bacteria and fungi

表5 門分類水平微生物相對(duì)豐度Tab.5 Relative abundance of microbes at phylum level %

圖5 細(xì)菌和真菌屬的組成Fig.5 Composition of bacterial and fungal communities at genus level

圖5顯示了屬分類水平的微生物組成。在初始混合底物中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是Devosia、unclassified_f_Phy11obacteriaceae、norank_o_Anaerolineaceae、norank_f_BIrii41、Cellulomonas和Bacillus，其相對(duì)豐度分別為7.50%、3.94%、3.56%、3.08%、3.01%和2.52%。Devosia被認(rèn)為是有機(jī)廢棄物堆肥過(guò)程中早期階段的可能生物標(biāo)志物[46]。優(yōu)勢(shì)真菌為unclassified_p_Ascomycota、Cercophora和unclassified_c_Sordariomycetes，相對(duì)豐度分別為68.06%、16.67%和3.26%。接種蚯蚓改變了細(xì)菌的組成。在蚯蚓堆制組第12天采集的樣品中，優(yōu)勢(shì)菌屬是Rhodococcus、Devosia、norank_f_Anaerolineaceae、Bacillus、Cellulomonas、Arthrobacter和norank_p_Saccharibacteria，這些屬的相對(duì)豐度分別為9.03%、3.67%、3.17%、2.44%、2.33%、2.30%和2.17%。對(duì)照組中，優(yōu)勢(shì)菌屬是Devosia、norank_f_ Anaerolineaceae、Cellulomonas和Bacillus，其相對(duì)豐度分別為5.07%、4.79%、4.70%和3.34%。堆肥過(guò)程中，Cellulomonas可以加速有機(jī)物的降解，接種蚯蚓增加了堆肥早期Cellulomonas的相對(duì)豐度。在對(duì)照組未觀察到Rhodococcus。在蚯蚓堆制組初期階段，Rhodococcus的相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)，在后期開始出現(xiàn)減少現(xiàn)象，在第24、36、48天時(shí)相對(duì)豐度分別為15.13%、17.76%和13.42%。蚯蚓堆制組第24天采集的樣品中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是Rhodococcus、Bacillus、unclassified_f_Planococcaceae和norank_p_Saccharibacteria。對(duì)照組中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是Bacillus、Cellulomona、Devosia和norank_f_BIrii41。Bacillus的相對(duì)豐度在堆制初期增加，證明Bacillus具有較強(qiáng)的分解復(fù)雜有機(jī)物作用。使用T檢驗(yàn)進(jìn)行蚯蚓處理組和對(duì)照組中微生物組成的比較。圖6a(圖中***、**、*分別表示處理間在0.001、0.01、0.05水平上差異顯著)顯示了兩種處理之間細(xì)菌組成的差異。在蚯蚓處理組中觀察到Rhodococcus的相對(duì)豐度顯著增加(p<0.001)，Arthrobacter、unclassified_f_Peptostreptococcaceae和Sporosarcina的相對(duì)豐度也顯著增加。微生物的組成與分解速率直接相關(guān)。結(jié)果表明，接種蚯蚓可能促進(jìn)堆肥過(guò)程中有機(jī)物的分解和改變細(xì)菌群落的組成。據(jù)報(bào)道，一些Rhodococcus屬的微生物有轉(zhuǎn)化某些木質(zhì)纖維素或芳香烴的潛力[47]。Rhodococcus在蚯蚓處理組顯著增加可能是花生殼分解更快的一個(gè)原因。在蚯蚓堆制橄欖油加工廢棄物的過(guò)程中也觀察到了Rhodococcus[38]。該屬在蚯蚓堆制過(guò)程中并不常見(jiàn)，其存在可能與底物的化學(xué)組成有關(guān)。一些種類的Bacillus和Cellulomonas因其分解纖維素和半纖維素活性而眾所周知[48]。據(jù)報(bào)道，節(jié)桿菌可降解單環(huán)芳香族化合物，其在降解由真菌產(chǎn)生的小分子量中間產(chǎn)物中起重要作用[39]。對(duì)于真菌，蚯蚓處理組第12天采集的樣本中，優(yōu)勢(shì)屬是Cercophora、unclassified_c_Dothideomycetes、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_c_Sordariomycetes和Preussia，其相對(duì)豐度分別為24.94%、21.50%、12.58%、10.94%和10.45%。在對(duì)照組，優(yōu)勢(shì)屬是unclassified_p_Ascomycota、Cercophora、unclassified_c_Sordariomycetes和Podospora，相對(duì)豐度分別為58.31%、17.32%、10.81%和7.32%。這表明蚯蚓的存在影響了真菌的組成。在對(duì)照組未觀察到unclassified_c_Dothideomycetes。據(jù)報(bào)道，Dothideomycetes和Sordariomycetes具有分解木質(zhì)纖維素的能力[49]。Cercophora的大多數(shù)種類也是木質(zhì)纖維素分解者，能夠產(chǎn)生各種木質(zhì)纖維素分解酶[50]。Preussia一些種類可以在植物殘枝或牛糞上生長(zhǎng)[51]。在蚯蚓處理組第24天采集的樣品中，優(yōu)勢(shì)真菌屬是Cercophora、unclassified_c_Sordariomycetes、unclassified_k_Fungi、unclassified_c_Dothideomycetes、unclassified_p_Ascomycota和Preussia，其相對(duì)豐度分別為21.85%、21.45%、12.54%、12.48%、10.52%和9.64%。同期對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)屬為unclassified_c_Ascomycota、unclassified_c_Sordariomycetes和Cercophora，相對(duì)豐度分別為47.71%、27.52%和16.04%。這表明在堆制過(guò)程中蚯蚓的存在增加了真菌多樣性。在第36天和第48天采集的樣品的優(yōu)勢(shì)屬和第24天的優(yōu)勢(shì)屬相似。在堆制后期，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度減小，認(rèn)為是底物逐漸耗盡導(dǎo)致。與對(duì)照組相比，蚯蚓堆制組的優(yōu)勢(shì)真菌相對(duì)豐度在堆制后期變化較小，可能是由于蚯蚓的分泌粘液和排泄物以及死亡的蚯蚓提供了養(yǎng)分維持微生物生長(zhǎng)。圖6b 顯示了蚯蚓處理組和對(duì)照組之間的真菌組成的差異。在蚯蚓處理組，Cercophora、unclassified_c_Dothideomycetes、Preussia和unclassified_f_Lasiosphaeriaceae相對(duì)豐度顯著增加。結(jié)果表明，蚯蚓的存在和堆制時(shí)間均對(duì)堆制底物的群落組成有一定的影響。

圖6 細(xì)菌和真菌組成的T檢驗(yàn)Fig.6 T-test for bacterial and fungal composition at genus level

3 結(jié)束語(yǔ)

將花生殼與牛糞混合后，利用接種赤子愛(ài)勝蚓進(jìn)行堆制。在蚯蚓堆制過(guò)程中觀察到蚓繭和幼蚓，在堆制結(jié)束時(shí)，赤子愛(ài)勝蚓的死亡率為19%，表明蚯蚓在一定程度上適應(yīng)了高木質(zhì)素含量的花生殼類底物。堆制結(jié)束時(shí)，蚯蚓處理組的碳氮比小于15.00，表明蚯蚓降低了有機(jī)碳含量，提高了全氮含量，從而降低了碳氮比，促進(jìn)了花生殼的穩(wěn)定降解。蚯蚓處理組中Rhodococcus、Arthrobacter、unclassified_f_Peptostreptococcaceae、Sporosarcina、Cercophora、unclassified_c_Dothideomycetes、Preussia和unclassified_f_Lasiosphaeriaceae的相對(duì)豐度顯著增加，表明蚯蚓能夠改變堆制底物微生物群落結(jié)構(gòu)，加快礦化、腐殖化過(guò)程和有機(jī)質(zhì)的分解。蚯蚓堆制可以作為一種利用花生殼的生物學(xué)方法，且能夠提高堆制終產(chǎn)物的真菌多樣性。