烤煙不同成熟期色素含量變化及其與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系探究

鄭小雨, 李常軍, 路曉崇, 王剛, 趙俊杰, 李云平,彭玖華, 楊超,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 鄭州 450002; 2.中國煙草總公司重慶市公司, 重慶 400023;3.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 南京 210019)

葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)最重要、最普遍的質(zhì)體，是進(jìn)行光合作用核心反應(yīng)特有的細(xì)胞器[1]。其與煙葉的主要品質(zhì)成分有直接或間接的聯(lián)系，直接影響烤煙質(zhì)量[2-4]。葉綠素則是葉綠體中最重要的色素，是綠色植物進(jìn)行光合作用吸收光能和光能轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，葉片在成熟過程中由綠變黃便是受到葉綠素含量的影響[5-7]。葉綠體能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為化學(xué)能，主要是由于其具有基粒膜和間質(zhì)膜系統(tǒng)，載有活躍的葉綠素和專一的酶成分[8]。色素含量外在反映了葉綠體結(jié)構(gòu)的變化。因此，研究烤煙成熟期色素含量變化及其與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。戴培剛等[9]研究表明，隨著成熟期的推進(jìn)，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量逐漸降低；嚴(yán)曉蘆等[10]研究表明，低光照會(huì)阻礙葉綠體的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致葉綠體基質(zhì)片層濃度降低，淀粉粒減小；黃明月等[11]研究表明，有機(jī)肥施用量的增加有利于葉綠體的發(fā)育，其內(nèi)淀粉粒的數(shù)目增加、體積變大，嗜鋨顆粒和類囊體片層數(shù)量增多，促進(jìn)煙葉中葉綠素的合成。目前對(duì)于烤煙成熟期色素含量和葉綠體超微結(jié)構(gòu)的研究多集中在某單一方面，沒有將二者結(jié)合起來。本研究以河南主要栽培的三個(gè)烤煙品種‘云煙87’‘K326’和‘豫煙6號(hào)’為試驗(yàn)材料，針對(duì)未熟、適熟和過熟的中部葉葉片，進(jìn)行活體葉綠素SPAD值、葉綠素含量以及相關(guān)酶活性的測(cè)定、葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察，并對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化處理，探討成熟過程中色素含量與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化，使葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化外在表現(xiàn)于色素含量的變化，以期能夠更好地把握煙葉成熟度并在最佳成熟度采收煙葉，以提高煙葉質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年在河南省洛寧縣小界衛(wèi)洼煙草科技示范基地(E111°38′，N34°26′)進(jìn)行，選用‘云煙87’‘K326’和‘豫煙6號(hào)’為試驗(yàn)材料，以中部葉為研究對(duì)象。煙苗于2018年5月4日移栽，以培育“中棵煙”目標(biāo)進(jìn)行田間管理，單株留葉數(shù)18～20片。土壤基本理化性質(zhì)如下：堿解氮75.18 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)13.52 mg·kg-1、速效磷9.17 mg·kg-1和速效鉀164.37 mg·kg-1，土壤pH 7.26。試驗(yàn)田肥力中等，土壤質(zhì)地為黃棕壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，共9個(gè)小區(qū)，四周栽種保護(hù)行，每小區(qū)栽植煙株300株，行距110 cm，株距55 cm，按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范種植管理，煙田施氮量為72 kg·km-2，使用煙草專用復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=1∶1∶2)。取樣部位為中部葉(10～12葉位)，取未熟、適熟、過熟三種不同成熟度的葉片，成熟度判定標(biāo)準(zhǔn)見表1，取樣時(shí)選取葉片第5到第7支脈之間左右對(duì)稱的部位(避開主支脈)，選取葉片時(shí)應(yīng)注意葉片保持完整，大小一致。

表1 烤煙葉片成熟度判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Judging criteria for maturity level of flue-cured tobacco leaves

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1活體葉綠素SPAD值測(cè)定 利用手持SPAD-502PLUS葉綠素測(cè)定儀(日本)，分別測(cè)量中部葉(與葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察為同一葉片)的SPAD值，每個(gè)葉片分別測(cè)定主脈對(duì)稱兩側(cè)的葉基部、葉中部、葉尖3個(gè)部位6個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.2葉綠素含量測(cè)定 取完葉片立即放入烘箱殺青烘干，丙酮提取分光光度法[12]測(cè)定，分別于662、644 nm下比色，記錄OD值。利用以下公式計(jì)算葉綠素a(Ca)和葉綠素b(Cb)含量。

Ca=9.784OD662-0.990OD644

Cb=21.426OD662-4.650OD644

1.3.3葉綠素酶活性測(cè)定 參照郁志芳等[13]方法測(cè)定葉綠素酶活性。

1.3.4葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 選取中部葉片第5到第7支脈之間右側(cè)相同的位置，用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm的小塊，立即放入5%戊二醛溶液(pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制)中固定，再用1%鋨酸(pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制)固定，乙醇梯度脫水，然后經(jīng)純丙酮脫水后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋聚合。用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片機(jī)(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)切出超薄切片, 用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色, 再用JEM-1400 Plus型透射電鏡(日本)進(jìn)行觀察并拍照, 每個(gè)處理觀察10個(gè)視野。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用Origin 2018進(jìn)行圖表繪制，運(yùn)用Photoshop 2018進(jìn)行圖片整理，運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度烤煙中部葉的活體葉綠素SPAD值

SPAD值可以反映單位面積鮮葉葉綠素的相對(duì)含量。由表2可見，豫煙6號(hào)、K326和云煙87中部葉葉綠素SPAD值均隨著成熟度的提升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且不同成熟度間差異顯著。在未熟時(shí)期，中部葉的SPAD值表現(xiàn)為豫煙6號(hào)>K326>云煙87；適熟時(shí)期，表現(xiàn)為豫煙6號(hào)>K326>云煙87；過熟時(shí)期，表現(xiàn)為豫煙6號(hào)>K326>云煙87，與未熟時(shí)期趨勢(shì)一致。

表2 三個(gè)品種不同成熟度葉片活體的葉綠素SPAD值Table 2 Chlorophyll SPAD values in leaves of three varieties with different maturity levels

2.2 不同成熟度烤煙中部葉的葉綠素含量

葉綠素是鮮煙葉中的質(zhì)體色素之一，它不僅決定調(diào)制后煙葉的葉色，而且對(duì)煙草香味物質(zhì)的形成和品質(zhì)的提高具有重要貢獻(xiàn)[14-15]。由圖1可知，3個(gè)品種間葉綠素a含量均大于葉綠素b含量。豫煙6號(hào)、K326和云煙87中部葉葉綠素a和葉綠素b的含量均隨著成熟度的不斷提升而逐漸減小，不同成熟度間差異顯著，且在未熟到適熟過程中葉綠素a和葉綠素b的變化速率要大于適熟到過熟時(shí)期的變化過程。不同時(shí)期的葉綠素a含量在3個(gè)品種間差異不顯著。3個(gè)品種中，在未熟時(shí)期，豫煙6號(hào)的葉綠素b含量最大，K326和云煙87間無顯著差異；其他時(shí)期，3個(gè)品種間差異不顯著。

注：不同小寫字母表示不同品種、不同成熟度間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different lowercase letters indicate significant difference between different varieties and different maturity levels at P<0.05 level.圖1 不同成熟度葉片的葉綠素a和葉綠素b含量Fig.1 Contents of chlorophyll a and b in leaves of different maturity levels

2.3 不同成熟度烤煙中部葉的葉綠素酶活性

煙葉成熟過程中葉綠素大量降解，葉綠素酶活性參與催化這一進(jìn)程。由圖2可知，在烤煙成熟過程中，隨著成熟度的不斷增加，三個(gè)品種葉綠素酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。未熟至適熟過程中，葉綠素酶活性的變化更加迅速，適熟至過熟過程中，酶活性的下降趨勢(shì)比較緩慢。3個(gè)品種間，葉綠素酶活性不存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

注：不同小寫字母表示不同品種、不同成熟度間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different lowercase letters indicate significant difference between different varieties and different maturity levels at P<0.05 level.圖2 不同成熟度葉片的葉綠素酶活性Fig.2 Chlorophyllase activity in leaves of different maturity levels

2.4 不同成熟度烤煙中部葉葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)

植物葉片成熟過程中葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化的研究，可以在微觀層面上對(duì)其有更深的認(rèn)識(shí)，也內(nèi)在反映了葉片衰老時(shí)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系[16-17]。由圖3可知，K326、云煙87和豫煙6三個(gè)烤煙品種葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)在不同成熟度上呈現(xiàn)出一致的規(guī)律。未熟葉片中(圖3A、3D、3G),葉綠體沿質(zhì)膜邊緣分布，形狀呈橢圓形，結(jié)構(gòu)完整且排列緊密，淀粉粒、嗜鋨顆粒、基粒片層和基質(zhì)片層被完整地包裹在葉綠體被膜中，葉綠體中含有少量淀粉粒和嗜鋨顆粒，基粒垛疊較厚，基粒片層結(jié)構(gòu)緊湊,與基質(zhì)片層間界限明顯，基質(zhì)片層也清晰可見。適熟葉片(圖3B、3E、3H)較未熟葉片相比，葉綠體保持了其結(jié)構(gòu)的完整性，但體積增大；嗜鋨顆粒和淀粉粒數(shù)量增多，體積膨脹；基粒片層和基質(zhì)片層雖然可以觀察到，但因?yàn)槭艿降矸哿５臄D壓導(dǎo)致片層結(jié)構(gòu)比較疏松、排列紊亂、不清晰，形狀也變?yōu)殚L(zhǎng)條形；一些淀粉粒向著細(xì)胞中部游離。過熟葉片(圖3C、3F、3I)的葉綠體中基粒片層被擠壓為線形且結(jié)構(gòu)松散、排列雜亂無序、產(chǎn)生扭曲現(xiàn)象，基質(zhì)片層幾乎不可見，淀粉粒和嗜鋨顆粒向著細(xì)胞中部游離，葉綠體被膜破損嚴(yán)重，其中品種K326和豫煙6號(hào)已經(jīng)完全破裂。由此可以得出，在煙葉成熟衰老過程中，細(xì)胞內(nèi)葉綠體呈現(xiàn)明顯的衰老癥狀。

A：K326，未熟；B：K326，適熟；C：K326，過熟；D：云煙87，未熟；E：云煙87，適熟；F：云煙87，過熟；G：豫煙6號(hào)，未熟；H：豫煙6號(hào)，適熟；I：豫煙6號(hào)，過熟。GL—基粒片層；CM—葉綠體被膜； SL—基質(zhì)片層；SG—淀粉粒；O—嗜鋨顆粒。A: K326, unripe; B: K326, ripe; C: K326, overripe; D: Yunyan 87, unripe; E: Yunyan 87, ripe; F: Yunyan 87, overripe; G: Yuyan 6, unripe; H: Yuyan 6, ripe; I: Yuyan 6, overripe. GL—Grana lamella; CM—Chloroplast envelope; SL—Stroma lamella; SG—Starch grains; O—Osmiophilic granules.圖3 不同成熟度烤煙葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Chloroplast ultrastructure of flue-cured tobacco leaves with different maturity levels

2.5 不同成熟度烤煙中部葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)

由表3可知，不同烤煙品種中部葉葉綠體的淀粉粒、嗜鋨顆粒和基粒片層分布情況呈現(xiàn)出相同的規(guī)律，不同成熟度的烤煙葉片間差異顯著。隨著成熟度的提升，單個(gè)葉綠體淀粉粒和嗜鋨顆粒總值增多，基粒片層數(shù)減少，但在品種間差異不顯著。片層垛疊數(shù)方面，隨生育期的延長(zhǎng)，低片層數(shù)基粒片層所占比例升高。在不同成熟度葉片間，未熟和適熟煙葉基粒片層垛疊數(shù)基本在11～30之間，過熟煙葉片層垛疊數(shù)沒有大于21的，在0～10間居多。由此可見，隨著煙葉成熟度的提升，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多，基粒片層數(shù)減少，基粒片層垛疊數(shù)也減少，這也與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果一致。

表3 不同成熟度中部葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of ultrastructural chloroplasts in middle leaves of different maturity levels

2.6 不同成熟度烤煙中部葉的色素含量與葉綠體超微結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)量的相關(guān)分析

由表4可知，烤煙中部葉單個(gè)葉綠體淀粉粒和嗜鋨顆?？傊蹬c葉片的SPAD值、葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素酶活性均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；基粒片層數(shù)與葉片的SPAD值、葉綠素a含量和葉綠素b含量均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系，與葉綠素酶活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系；片層垛疊數(shù)在0～10的基粒片層與葉片的SPAD值、葉綠素a含量和葉綠素b含量均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與葉綠素酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；片層垛疊數(shù)在11～20的基粒片層與葉片的SPAD值、葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素酶活性的相關(guān)關(guān)系不顯著，片層垛疊數(shù)在20以上的基粒片層與葉片的SPAD值、葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素酶活性均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系。由此可知，不同成熟度烤煙中部葉色素含量與葉綠體基粒片層分布情況相關(guān)性較強(qiáng)。

表4 不同成熟度烤煙中部葉色素含量與葉綠體超微結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)量的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of pigment content and chloroplast ultrastructure statistics of flue-cured tobacco at different maturity levels

3 討論

葉綠素含量是受葉片衰老影響最顯著的指標(biāo)，在田間成熟過程煙葉的顏色變化實(shí)質(zhì)是煙葉內(nèi)葉綠體色素逐漸減少的過程[18]。潘義宏等[19]研究表明,中部葉成熟采收煙葉的總?cè)~綠素含量與SPAD值具有相關(guān)性；李旭華等[20]發(fā)現(xiàn)葉綠素a、葉綠素b和SPAD值隨著成熟度的增加不斷減少，中部葉不同成熟度煙葉葉綠素含量與SPAD值的變化表現(xiàn)出顯性正相關(guān)，在適熟期達(dá)到極顯著正相關(guān)。本研究中3個(gè)烤煙品種中部葉葉綠素含量及活體葉綠素SPAD值均隨著生育期的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，且兩者間表現(xiàn)出高度一致性。這與前人[19-20]的研究結(jié)果一致。3個(gè)品種間葉綠素a含量差異不顯著，在未熟時(shí)期葉綠素b含量在品種間有差異，豫煙6號(hào)顯著高于另外2個(gè)品種，這可能和品種差異有關(guān)。在過熟時(shí)期品種間的差異均不顯著，這可能與過熟時(shí)期葉綠體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)完全解體，煙葉內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)元素達(dá)到平衡有關(guān)。

葉綠素酶存在于葉綠體中，其催化葉綠素的降解過程[21]。鹿瑩[22]研究表明，光質(zhì)影響煙葉色素含量及組成，也影響色素降解酶的活性，色素含量與色素降解酶活性呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)；王丹[23]研究表明,煙葉成熟過程中葉綠素大量降解，打頂后葉綠素酶活性呈現(xiàn)先上升后快速下降，最后緩慢下降的過程。本研究中隨著成熟度的不斷增加，3個(gè)品種葉綠素酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。未熟至適熟過程中，葉綠素酶活性的變化比較迅速，適熟至過熟過程中，酶活性下降的趨勢(shì)比較緩慢，這與前人[22-23]研究結(jié)果一致。3個(gè)品種間，葉綠素酶活性差異不顯著，但在不同成熟度間差異顯著，表現(xiàn)為隨著成熟度的增加酶活性降低，這與前期測(cè)量的活體葉綠素SPAD值及葉綠素b含量的變化規(guī)律一致。

煙草葉片中葉綠體非常發(fā)達(dá)，即是煙葉光合作用的重要場(chǎng)所，也是煙葉光合產(chǎn)物合成、積累的主要場(chǎng)所[24-25]，煙葉的主要品質(zhì)成分也受其影響,并與其有著重要的聯(lián)系[26]。本研究表明，葉綠體在成熟過程中基粒片層結(jié)構(gòu)一步步離散乃至喪失，這是細(xì)胞進(jìn)入衰老期后最早和最明顯的現(xiàn)象，它引發(fā)了整個(gè)細(xì)胞的衰老[27]?？緹熢诔墒鞎r(shí)淀粉含量過高是影響烤煙品質(zhì)的重要原因，在葉片衰老過程中葉綠體逐漸衰老，葉肉細(xì)胞內(nèi)淀粉逐漸增加[28]。本研究表明，隨著成熟度的提升，葉綠體的結(jié)構(gòu)由完整到破裂，淀粉粒和嗜鋨顆粒體積增大，基粒片層由緊湊變?yōu)槭杷桑Y(jié)構(gòu)紊亂甚至出現(xiàn)扭曲現(xiàn)象，基質(zhì)片層和基粒片層間的界限明顯度也下降，過熟期基質(zhì)片層幾乎不可見，葉綠體被膜也逐步破損，且隨著煙葉成熟度的提升，基粒片層數(shù)減少，基粒片層垛疊數(shù)也減少，這與張柳等[28]的研究結(jié)果一致。王嬋娟等[29]研究表明，隨著成熟度的加深，葉綠體內(nèi)淀粉粒只增大無明顯增多，嗜鋨顆粒體積增大，片層結(jié)構(gòu)清晰度下降并解體，過熟時(shí)內(nèi)部的淀粉粒和嗜鋨顆粒游離到細(xì)胞中部。而本研究表明，隨著生育期的延長(zhǎng)，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多，可能是本研究煙葉在后期打頂，有機(jī)物在葉片內(nèi)積累不易向外運(yùn)輸，從而導(dǎo)致淀粉在葉綠體中積累。

本研究相關(guān)分析表明，烤煙中部葉的SPAD值、葉綠素a和葉綠素b與葉綠體基粒片層數(shù)、片層垛疊數(shù)在20以上的基粒片層均表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系，與片層垛疊數(shù)在0～10的基粒片層均表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明在烤煙成熟過程中色素的含量變化受葉綠體基粒片層的影響較大；烤煙葉片葉綠素酶活性與葉綠體基粒片層數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與片層垛疊數(shù)在0～10的基粒片層呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與片層垛疊數(shù)在20以上的基粒片層表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明葉綠素酶活性的變化也受基粒片層的影響；片層垛疊數(shù)在11～20的基粒片層則與葉片的SPAD值、葉綠素a、葉綠素b和葉綠素酶活性均沒有顯著相關(guān)性關(guān)系，說明在成熟過程中片層垛疊數(shù)在11～20的基粒片層數(shù)目沒有發(fā)生變化，均保持一定的穩(wěn)定性。

綜上所述，隨著成熟度的提升，不同烤煙品種中部葉葉綠素含量、活體葉綠素SPAD值及葉綠素酶活性均隨著生育期的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；不同品種煙葉細(xì)胞的葉綠體結(jié)構(gòu)由完整到破裂；淀粉粒和嗜鋨顆粒增多、體積增大，并向著細(xì)胞中部游離；基粒片層由緊湊變?yōu)槭杷?，結(jié)構(gòu)紊亂扭曲，基粒片層數(shù)和片層垛疊數(shù)也減少。烤煙成熟期中部葉的SPAD值、葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素酶活性與葉綠體內(nèi)基粒片層數(shù)及片層垛疊數(shù)也具有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。本研究分析了烤煙成熟過程的色素含量與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系，使葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化外在表現(xiàn)為色素含量的變化，對(duì)指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。