環(huán)狀RNA在缺氧窒息死亡原因推斷中的意義

關(guān)遠(yuǎn)凱 陳 說

（1.東莞市公安局塘廈分局刑警大隊(duì)，廣東 東莞523710；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州511436）

真核細(xì)胞基因組僅有約2%為可編碼蛋白質(zhì)的信使RNA（mRNA），而75%-90%的RNA是非編碼 RNA （ncRNA）［1］。近年來，隨著RNA測(cè)序（RNA-seq）的應(yīng)用和發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新型的內(nèi)源性非編碼RNA：環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNAs）。circRNA結(jié)構(gòu)上高度保守且共價(jià)閉合，最早被Kolakofsky以及Sanger等人發(fā)現(xiàn)于類病毒顆粒，隨后逐漸在動(dòng)物細(xì)胞以及真核酵母中得到驗(yàn)證。2012年Salzman等人對(duì)circRNA進(jìn)行了全面和系統(tǒng)報(bào)告，越來越多的環(huán)狀RNA逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)，特別是其作為“miRNA海綿”在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮的作用，已成為新的研究熱點(diǎn)。

circRNA廣泛存在于外周血中，不易被RNA酶降解，穩(wěn)定性高，因而有助于推斷窒息死亡后陳舊血跡及尸體的時(shí)間。本綜述對(duì)circRNA的特征，其形成和功能，以及缺氧相關(guān)環(huán)狀RNA在窒息死亡原因推斷中的意義進(jìn)行闡述。

1 CircRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

circRNAs長度約為幾百至幾千個(gè)核苷酸，其獨(dú)特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其缺乏5’末端帽子、3’末端多聚腺苷酸（polyA）尾。

circRNA具有以下重要特征：（1）閉環(huán)結(jié)構(gòu)：因此耐受核酸外切酶，相比于同源線性RNA，穩(wěn)定性更高；（2）在體內(nèi)廣泛表達(dá)，表達(dá)水平具有組織特異性，與其同源線性RNA的表達(dá)水平無相關(guān)性，有時(shí)甚至是其同源線性RNA的10倍以上；（3）多數(shù)circRNA具有高度保守的序列；（4）大多數(shù)circRNA位于細(xì)胞質(zhì)中，而少量內(nèi)含子衍生的circRNA位于細(xì)胞核中［2］；（5） 大多數(shù)circRNA包含外顯子序列，而其中少數(shù)是通過內(nèi)含子環(huán)化形成的［6］；（6）一些circRNA富含來自外顯子的miRNA應(yīng)答元件（MRE）；（7）circRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。

2 CircRNA的形成機(jī)制

環(huán)狀RNA來源于其親本基因的轉(zhuǎn)錄，由前體mRNA通過非經(jīng)典的選擇性剪接產(chǎn)生，根據(jù)其來源分為以下三類。

2.1 外顯子來源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）

超過80%的circRNA是ecircRNA,Jeck等人通過系列研究確定了兩種ecircRNA模型：（1）套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化（Lariat-driven circularization）；（2）內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化（Intron-nairingdriven circularization）。Wilusz和 Sharp證明，circRNA分子主要通過反向剪接產(chǎn)生。

2.2 內(nèi)含子環(huán)狀RNA（circular intronic RNA，ciRNA）

ciRNA是指內(nèi)含子獨(dú)立環(huán)化形成環(huán)狀內(nèi)含子RNA，其主要存在于某些組織的細(xì)胞核中，多位于5’剪切位點(diǎn)與3’分支點(diǎn)附近，富含GU序列與富含C序列的共價(jià)模體誘導(dǎo)合成，內(nèi)含子環(huán)化后再經(jīng)過剪除尾端及分支點(diǎn)序列，形成內(nèi)含子環(huán)狀結(jié)構(gòu)；此外，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）可以誘導(dǎo)剪接受體與供體直接連接，再經(jīng)過內(nèi)含子剪切，形成完整的外顯子環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

2.3 外顯子-內(nèi)含子circRNA（ElciRNA）側(cè)翼內(nèi)含子序列包含的在內(nèi)含子環(huán)化

Salzman等人發(fā)現(xiàn)ElciRNA由外顯子和內(nèi)含子共同組成。外顯子環(huán)化主要依賴外顯子側(cè)翼的長內(nèi)含子序列，而側(cè)翼內(nèi)含子序列包含的反向序列（如ALU）在內(nèi)含子環(huán)化時(shí)起重要作用。通常情況下，圍繞外顯子的內(nèi)含子被拼接出來；而在某些情況下，它們被保留，并被命名為保留內(nèi)含子的circRNA或ElciRNA［3］。

3 CircRNA的生物學(xué)功能

3.1 miRNA海綿作用

環(huán)狀RNA通過其含有的miRNA應(yīng)答元件（MRE，microRNA response element） 競(jìng)爭性結(jié)合miRNA，解除miRNA對(duì)下游靶基因的抑制，發(fā)揮“miRNA海綿”的作用，從而參與競(jìng)爭性內(nèi)源 RNA （ceRNA,competeing endogenous RNA）網(wǎng)絡(luò)。目前研究最多的是CDR1-as，具有70余個(gè)保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)。Xu等人研究表明CDR1-as能夠結(jié)合miR-7與AGO2蛋白形成的RISC，解除miR-7對(duì)靶基因的抑制，從而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)通路中發(fā)揮重要作用。

3.2 調(diào)控RNA結(jié)合蛋白

circRNA可通過與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制其活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性，為蛋白質(zhì)與RNA，DNA以及蛋白質(zhì)之間的相互作用提供平臺(tái)。例如：circ-Foxo3通過結(jié)合細(xì)胞周期素依賴激酶2（CDK2）以及CDKs抑制劑P21形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元復(fù)合體，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯。

3.3 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

circRNA可以定位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，結(jié)合RNA聚合酶II復(fù)合體，影響轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)其源基因發(fā)揮順式調(diào)控作用或者反式調(diào)節(jié)作用。Ashwal-Fluss等人研究發(fā)現(xiàn)剪接因子MBL的第二個(gè)外顯子可以環(huán)化形成circRNA，其與前體mRNA的線性剪接競(jìng)爭并影響線性RNA的形成以調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)［4］。

3.4 參與蛋白質(zhì)翻譯

研究表明，circRNA除了可以在RNA水平發(fā)揮功能，也可以像線性mRNA一樣翻譯形成蛋白質(zhì)。Legnini等人研究發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609含有相同于線性轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，從起始密碼子開始終止于環(huán)化形成的框內(nèi)終止密碼子［5］。Yang等人發(fā)現(xiàn)N6-甲基腺苷（m6A）通過RNA堿基修飾，促進(jìn)了circRNA蛋白質(zhì)翻譯功能的有效啟動(dòng)。最近，研究發(fā)現(xiàn)circRNA在人骨肉瘤細(xì)胞中具有蛋白翻譯功能，但其翻譯效率明顯低于線性RNA。

4 CircRNA在缺氧窒息中的研究進(jìn)展

人體呼吸過程由外呼吸、血液中氣體運(yùn)輸和內(nèi)呼吸三個(gè)階段共同構(gòu)成。三者中任一階段受阻或異常，均可導(dǎo)致全身各組織器官缺氧，呼吸障礙、氧氣不足、二氧化碳滯留，進(jìn)而引起相應(yīng)細(xì)胞代謝障礙、功能紊亂和形態(tài)結(jié)構(gòu)損害，整個(gè)過程稱為窒息（asphyxia），因窒息而導(dǎo)致的死亡稱為窒息死（asphyxial death）。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中通常根據(jù)顏面部淤血發(fā)紺腫脹、瘀點(diǎn)性出血、尸斑出現(xiàn)的時(shí)間分布、尸冷進(jìn)展速度、牙齒浸染等尸表征象，結(jié)合內(nèi)部器官淤血、器官被膜下瘀點(diǎn)性出血、肺氣腫水腫等尸體內(nèi)部征象，判斷尸體死因是否為缺氧窒息死亡。當(dāng)尸體腐敗、現(xiàn)場(chǎng)被破壞、尸體檢驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)明顯陽性體征時(shí)，往往難以確定死亡原因。法醫(yī)學(xué)鑒定受血液成分復(fù)雜性及死后環(huán)境因素等的影響，血液pH值變化、血?dú)夥治黾把弘x子濃度改變等檢測(cè)方法存在不確定性。近年來，研究者試圖通過分子生物學(xué)手段建立缺氧窒息相關(guān)動(dòng)物模型，檢測(cè)HIF相關(guān)基因的蛋白和mRNA表達(dá)水平變化，篩選窒息死亡相關(guān)的輔助診斷指標(biāo)。但由于尸體樣本死亡時(shí)間不等，蛋白質(zhì)、mRNA等分子發(fā)生不同程度的降解，因而死亡原因推測(cè)具有一定局限性。circRNA廣泛存在于外周血中，不容易被RNA酶降解，穩(wěn)定性高，因而對(duì)窒息死亡后陳舊血跡及陳舊尸體中的時(shí)間推斷可能具有重要意義。

4.1 缺氧對(duì)circRNA生物合成及活性的影響

Hsiao等人通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，缺氧應(yīng)激能促進(jìn)circCCDC66積累，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，并且由于自身的穩(wěn)定性能加強(qiáng)這種積累作用，提示circRNA可能在缺氧缺血所致?lián)p傷的病理過程中具有重要作用。

Boeckel等人研究表明缺氧條件下可以誘導(dǎo)circZNF292、circAFF1和circDENND4C的表達(dá)，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中cTHSD1表達(dá)，且缺氧條件下誘導(dǎo)的circZNF292在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出促血管生成活性［6］。

4.2 circRNA在缺氧中的功能以及在窒息死亡原因推斷中的意義

Dang等人研究表明在缺氧條件下HUVEC細(xì)胞中circ_0010729表達(dá)上調(diào)，且可通過靶向調(diào)節(jié)miR-186/HIF-1α影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡。HIF（hypoxia-inducible factor，缺氧誘導(dǎo)因子）是一種受氧濃度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，在缺氧條件下可激活包括碳酸酐酶9（CA9，carbonic anhydrase 9）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1（GLUT1，glucose transporter 1）在內(nèi)的100多種缺氧反應(yīng)性基因表達(dá)［7］，參與窒息死亡的不同階段，具有作為窒息標(biāo)志物的可能性。Liang等人研究表明circDENND4C在缺氧條件下含量增加，而HIF1α表達(dá)水平下調(diào)后又可導(dǎo)致circDENND4C含量減少，這表明circDENND4C是一種HIF1α相關(guān)的circRNA。因而當(dāng)前針對(duì)circRNA與缺氧的相關(guān)研究，特別是與HIF的相互調(diào)控研究，可能為尋找窒息死亡原因特異性標(biāo)志物提供依據(jù)。

5 展望

雖然多種死亡機(jī)制均可歸結(jié)為組織器官缺氧，但不同的死亡機(jī)制在不同臟器內(nèi)會(huì)存在缺氧程度的不同，頸部血液循環(huán)受阻造成的窒息往往腦組織先缺氧，而溺水死亡則是肺部首先缺氧。circRNA通過調(diào)控miRNA/HIF等途徑參與多種缺氧反應(yīng)過程，為從分子水平深入闡述缺氧窒息所引起的機(jī)體死亡機(jī)制提供了線索。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在缺氧時(shí)含量或活性發(fā)生改變的一系列 circRNA:cZNF292、cAFF1、cDENND4C、cTHSD1、circZNF292、circ_0010729以及circDENND4C，為窒息特異性標(biāo)志物的篩選提供了理論依據(jù)。也將在未來進(jìn)一步深入分析不同窒息方式中器官內(nèi)circRNA的定量差異，有助于對(duì)原因不明的窒息提供方向。

鑒于法醫(yī)學(xué)鑒定受死亡時(shí)間、取材部位、年齡及性別等多種因素影響，因而窒息特異性標(biāo)志物的篩選仍有待大量實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。而且由于circRNA表達(dá)豐度較低，因而利用circRNA標(biāo)志物進(jìn)行窒息死亡原因的推斷作為一種新的方法，如何應(yīng)用于人尸體方面依然存在著研究上的空白，需要進(jìn)一步深入探索。