南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下羅漢果代謝組學(xué)研究

李璐璐，韋文瓊，程 穎，李佳慧，李惠敏

(1. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541006; 2. 廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 桂林 541006 )

南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)是一類(lèi)侵染大多數(shù)栽培植物的內(nèi)寄生線蟲(chóng)之一，羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為廣西特有經(jīng)濟(jì)作物，其主栽品種也易受南方根結(jié)線蟲(chóng)的侵害，而且患病狀態(tài)下的植株更易遭受真菌或細(xì)菌的混合侵害而引起根系或薯塊腐爛,進(jìn)而加速病株死亡[1-2]。

南方根結(jié)線蟲(chóng)以其侵染性二齡幼蟲(chóng)侵入寄主植物根系，通過(guò)干擾細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育，形成維持線蟲(chóng)取食的巨細(xì)胞以及根結(jié)[3]。目前，對(duì)植物寄生線蟲(chóng)如根結(jié)線蟲(chóng)、孢囊線蟲(chóng)等的致病分子生物學(xué)機(jī)制研究取得了顯著的進(jìn)展, 普遍認(rèn)為線蟲(chóng)口針和食道腺分泌物是植物線蟲(chóng)致病相關(guān)物質(zhì)的重要組成部分，分泌型蛋白在侵染及建立寄生關(guān)系中也起著重要作用，而寄主植物在線蟲(chóng)侵入、轉(zhuǎn)移、刺激巨細(xì)胞形成中也發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化[4]。

植物代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，在揭示生命基本活動(dòng)及規(guī)律中將發(fā)生越來(lái)越重要的作用[5]。當(dāng)植物生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生變化(非生物脅迫、病蟲(chóng)害等)，植物自身會(huì)通過(guò)表型、生理生化等一系列的變化來(lái)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)這些逆境，植物在自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)這些環(huán)境的過(guò)程中，其代謝物同樣扮演著非常重要的角色。

鑒于目前對(duì)于羅漢果植株根系受根結(jié)線蟲(chóng)侵染早期其代謝變化情況知之甚少，本研究對(duì)羅漢果幼苗進(jìn)行人工接種南方根結(jié)線蟲(chóng)后，擬采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)，對(duì)羅漢果幼苗根系進(jìn)行代謝輪廓變化非靶向分析，旨在為揭示羅漢果植株與南方根結(jié)線蟲(chóng)早期互作分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料的處理與收集

本研究以羅漢果幼苗為植物材料，參照劉紀(jì)霜[2]和焦春偉等[6]方法，待盆栽幼苗已長(zhǎng)出4～6片功能葉時(shí)采用人工接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的方法進(jìn)行侵染其幼根：二齡幼蟲(chóng)接種量為1000條/株，以無(wú)菌水接種作為對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次即為處理組和對(duì)照組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。人工接種南方根結(jié)線蟲(chóng)后7 d，從每一批次的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各選取生長(zhǎng)狀態(tài)比較相似的羅漢果植株，自來(lái)水清洗掉根部沙土，蒸餾水清洗干凈后用吸水紙吸干表面水分，再用解剖刀將帶根結(jié)的側(cè)根切下，同時(shí)收集對(duì)照組植株相似部位的側(cè)根，稱(chēng)取樣品，按1 g/份進(jìn)行分裝，標(biāo)記后迅速用液氮處理，-80 ℃保存以備提取代謝產(chǎn)物所用。

1.2 代謝組學(xué)分析

1.2.1 LC-MS分析

根系樣本委托上海派森諾生物技術(shù)公司進(jìn)行代謝物的甲醇/乙腈/水溶液(4∶4∶2)提取及采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC 色譜柱進(jìn)行分離，樣品經(jīng)UHPLC 分離后采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式用Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及模型識(shí)別分析

代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<10 ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式，檢索生物技術(shù)公司實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)。原始數(shù)據(jù)中，缺失值超過(guò)50%的代謝物將被去除，不參與后續(xù)分析；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化，并在SIMCA-P 軟件中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto-scaling 處理。對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)監(jiān)督主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal to partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。

1.2.3 差異代謝物篩選

通過(guò)變異倍數(shù)分析(Fold change analysis，F(xiàn)C analysis)t檢驗(yàn)單變量分析法，篩選南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下出現(xiàn)差異累積的羅漢果根系代謝物，以FC>2.0 且P<0.05 作為差異顯著代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅漢果幼苗被南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后根系情況

植物根結(jié)線蟲(chóng)病的典型癥狀是在寄主植物的根部形成根結(jié)，在不同根結(jié)線蟲(chóng)-寄主植物互作體系中，從根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)侵入到誘導(dǎo)植物產(chǎn)生巨型細(xì)胞的時(shí)間長(zhǎng)短不一[3]。對(duì)羅漢果幼苗進(jìn)行人工接種南方根結(jié)線蟲(chóng)，最早發(fā)現(xiàn)根結(jié)是在接種4 d后。圖1-c、d顯示了接種后7 d取樣時(shí)在羅漢果幼苗的側(cè)根根尖部位可見(jiàn)根結(jié)的情況，而側(cè)根的其他部位和主根未發(fā)現(xiàn)根結(jié)；圖1-a、b為未接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的對(duì)照苗，無(wú)根結(jié)。

b和d分別對(duì)應(yīng)于a和c中方框部分通過(guò)拖放鼠標(biāo)進(jìn)行放大，箭頭所示為側(cè)根上形成的小根結(jié)

b and d show local box amplification by pulling the mouse in a and c respectively. The arrows indicating galls of lateral roots

圖1對(duì)照(a)和處理(c)羅漢果根系比較

Figure 1 Comparing control(a)and treatment roots ofSiraitiagrosvenorii

2.2 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下羅漢果根系LC-MS分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)LC-MS 數(shù)據(jù)分析，共檢索出221種化合物，主要為可溶性糖類(lèi)、氨基酸、有機(jī)酸等。SIMCA-P 14.1(Umeitrics，Umea，Sweden) 分析得到羅漢果幼苗根在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染早期，其代謝物的PCA和OPLS-DA結(jié)果分值圖，接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的處理組和對(duì)照組樣品呈現(xiàn)明顯分離(圖 2和圖 3)，這說(shuō)明接種南方根結(jié)線蟲(chóng)7 d后，羅漢果根系代謝物出現(xiàn)了整體變化。

2.3 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染對(duì)羅漢果根系代謝物累積的影響

2.3.1 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下羅漢果根系代謝物的變化

C和T分別表示對(duì)照組和處理組，下同

C and T show control and treatment respectively，the same as follow

圖2羅漢果根系代謝物PCA分圖

Figure 2 PCA analysis of metabolites ofSiraitiagrosvenoriiunder infection ofM.incognita

圖3 羅漢果代謝物正、負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖

南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染早期，羅漢果植株根系代謝物的累積發(fā)生了較大的變化，表 1列出了單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選差異2倍以上的代謝物，這些代謝物主要包括可溶性糖、三羧酸循環(huán)中間代謝物、核苷酸、氨基酸、維生素等。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑共有的中間代謝物，在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后羅漢果根系中出現(xiàn)了明顯累積的現(xiàn)象，嘌呤代謝中間產(chǎn)物尿囊酸和尿囊素也出現(xiàn)了大量累積的現(xiàn)象，但這些差異變化并不顯著(P>0.05)。本研究中只檢測(cè)到16種代謝物的含量在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染早期發(fā)生了顯著性差異變化(P<0.05)。其中植物細(xì)胞壁的降解產(chǎn)物纖維二糖和具有保護(hù)生物大分子功能的海藻糖均出現(xiàn)顯著性降低；與木質(zhì)素形成有關(guān)的肉桂酸類(lèi)衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯也出現(xiàn)了顯著性降低。而涉及脂類(lèi)代謝的二乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、十四烷酸、十六烷酸均出現(xiàn)了顯著性積累。氨基酸類(lèi)既有上升積累的情況，也有減少的情況，其中帶羥基基團(tuán)的氨基酸如羥基精氨酸、酪氨酸和蘇氨酸出現(xiàn)了不同程度降低的現(xiàn)象，然而差異并不顯著。作為輔酶或者輔基的組成成分參與體內(nèi)物質(zhì)代謝過(guò)程的B族維生素：硫胺素(維生素B1)、核黃素(B2)、吡哆醇(維生素B6)也發(fā)生了含量非限制性增加或減少的變化；而作為多種脫氫酶輔酶的煙酰胺(維生素PP)則出現(xiàn)顯著性累積的現(xiàn)象。

2.3.2 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染對(duì)羅漢果根系代謝物累積的影響

根結(jié)線蟲(chóng)侵染植株后,線蟲(chóng)口針和食道腺分泌物在寄主植株體內(nèi)釋放，從而影響其根系的物質(zhì)代謝和一系列生理生化反應(yīng),根系中各種化學(xué)物質(zhì)特別是內(nèi)源激素發(fā)生不同程度的變化[7-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染根結(jié)線蟲(chóng)的羅漢果根系生長(zhǎng)素的含量相比于未感染根的生長(zhǎng)素含量略有減少(為對(duì)照的0.93倍)，但脫落酸卻出現(xiàn)顯著性減少的現(xiàn)象；劉亞麗[8]也發(fā)現(xiàn)接種根結(jié)線蟲(chóng)的小黑豆根結(jié)部位脫落酸含量與對(duì)照相比，接種前期顯著低于對(duì)照；而郭衍銀等[9]則發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染可使生姜根莖中吲哚乙酸含量顯著降低,脫落酸則表現(xiàn)為前期降低,后期增加的趨勢(shì)。

表 1 南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下羅漢果根系差異代謝物

注：字母a和b分別表示該數(shù)值在P<0.05和P<0.01水平上顯著差異

Note: letter a and b fouowed the data respresent signiticant difference at the 0.05 and 0.01 level, respectively

木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的基本組成成分,對(duì)病原的侵害起到屏障作用,植物在被接種病原體后,木質(zhì)素含量會(huì)有顯著變化,并且免疫反應(yīng)中的信號(hào)分子含量、抗病基因表達(dá)水平也與木質(zhì)素有相互關(guān)系[10]。在環(huán)境脅迫條件下，植物可以通過(guò)增加木質(zhì)素的積累使線蟲(chóng)難以建立侵染位點(diǎn)，從而降低線蟲(chóng)危害。尤楊等[11]的研究結(jié)果表明，活性氧和木質(zhì)素的大量積累是熒光假單胞菌Sneb825誘導(dǎo)番茄抑制南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染的防御對(duì)策之一;徐小明等[12]的研究結(jié)果表明，遭受南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后茄子砧木幼苗根系出現(xiàn)不同程度的木質(zhì)素積累，但高抗根結(jié)線蟲(chóng)品種托魯巴姆的木質(zhì)素含量顯著高于感病品種赤茄。賈雙雙等[13]研究南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染對(duì)2個(gè)不同抗性番茄砧木幼苗根系的苯丙烷類(lèi)代謝的影響，其結(jié)果也表明木質(zhì)素積累量均在接種線蟲(chóng)7 d內(nèi)迅速升高，且抗性品種‘坂砧2號(hào)’明顯高于感病品種‘Ls-89’。本研究結(jié)果表明與木質(zhì)素單體形成有關(guān)的肉桂酸類(lèi)衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯均出現(xiàn)了顯著性降低。鑒于本研究結(jié)果中苯丙氨酸雖然出現(xiàn)了2倍多的積累，但并非顯著性水平差異，是否意味著由苯丙氨酸代謝生成肉桂酸的過(guò)程并未發(fā)生顯著性變化，而肉桂酸類(lèi)衍生物顯著性降低則是大量合成了木質(zhì)素所致？這可為下一步聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組等研究提供思路。

值得注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下的羅漢果根系累積了大量的酰脲(尿囊酸和尿囊素)，其中尿囊酸與未接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的對(duì)照組相比更是高達(dá)9倍多。在高等植物中,尿囊酸和尿囊素是嘌呤降解途徑上的兩種中間產(chǎn)物,不僅是氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)過(guò)程中的重要物質(zhì),而且已有研究表明尿囊素在植物抗逆應(yīng)答過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[14]。Coleto等[15]對(duì)比耐旱性不同的菜豆品系發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下,各品系植株均發(fā)生酰脲類(lèi)化合物積累,雖然干旱敏感品系中存在更高的酰脲水平,但所積累的酰脲多為尿囊酸,而抗旱品系所積累的酰脲中,尿囊素比例較高。因此，在南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染下的羅漢果根系積累的酰脲主要為尿囊酸而非尿囊素，這可能與羅漢果為南方根結(jié)線蟲(chóng)敏感品系而非抗性品系有關(guān)；也有可能在線蟲(chóng)侵染下，羅漢果根系中尿囊酸酶的活性發(fā)生了較大變化，導(dǎo)致尿囊酸沒(méi)能進(jìn)一步分解生成尿素或NH3和CO2，結(jié)論有待進(jìn)一步的研究考證。有研究[16-18]結(jié)果表明在植物寄生線蟲(chóng)的取食點(diǎn)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸含量顯著上升，本研究也發(fā)現(xiàn)受到南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后羅漢果根系出現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸累積現(xiàn)象。磷酸戊糖途徑是植物體中葡萄糖代謝的重要途徑，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是該途徑的關(guān)鍵性調(diào)控酶，催化第一步不可逆的葡萄糖-6-磷酸氧化反應(yīng)并嚴(yán)格控制著該途徑的代謝速率。Hu等[18]研究結(jié)果表明功能缺失擬南芥突變體的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性顯著降低，和野生型相比，該突變體對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的敏感性卻顯著增加。羅漢果植株對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的侵染比較敏感[1]，是否意味著這很有可能與其葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的表達(dá)情況密切相關(guān)？該結(jié)論有待今后通過(guò)深入研究葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在南方根結(jié)線蟲(chóng)與羅漢果植物互作中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)論

受到南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染的前期，羅漢果植株根結(jié)內(nèi)累積了大量的葡萄糖-6磷酸、酰脲(尿囊酸和尿囊素)；而與木質(zhì)素形成相關(guān)的肉桂酸類(lèi)衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯則顯著性減少；其他包括可溶性糖、維生素、游離氨基酸等多種物質(zhì)含量也發(fā)生了變化。本研究結(jié)果可為今后研究羅漢果與南方根結(jié)線蟲(chóng)之間相互作用的分子機(jī)制提供參考。