北京地區(qū)不同分娩方式嬰幼兒腸道菌群分析

安云鶴，安 濤，武會娟，程小艷，馬 凱，陳爾凝，高麗娟

(1. 北京市理化分析測試中心 北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心 北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京 100089； 2. 北京太和婦產(chǎn)醫(yī)院，北京 100195)

人體腸道內(nèi)棲居著數(shù)以萬億計的微生物，統(tǒng)稱為腸道菌群，這些菌群在繁衍的過程中逐漸達(dá)到種類和數(shù)量的平衡,該平衡與機(jī)體正常代謝密切相關(guān)。這種平衡一旦被打破，會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如炎癥性腸道疾病、壞死性小腸結(jié)腸炎、糖尿病、肥胖、癌癥、過敏和哮喘等[1-4]。腸道菌群的建立始于出生，生命初期的腸道微生物區(qū)系會影響成年后的機(jī)體健康狀況[5]。因此，近幾年新生兒腸道微生物區(qū)系的定植規(guī)律及其影響因素成為人們?nèi)找骊P(guān)注的對象。

分娩方式是影響腸道菌群變化的主要因素之一[6]，也是目前的研究熱點(diǎn)之一。盡管國際上已經(jīng)有比較多的關(guān)于剖宮產(chǎn)對嬰幼兒腸道菌群定殖影響的研究，但國內(nèi)關(guān)于此方面的研究起步較晚，且方法多采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)或傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，且僅限于對特定菌種的比對分析[7-9]。本研究采用以高通量、速度快、成本低等為特點(diǎn)迅速發(fā)展的新一代測序技術(shù)，研究剖宮產(chǎn)和自然分娩兩種不同的分娩方式，對北京地區(qū)258例0～3歲嬰幼兒腸道微生物變化的影響，同時分析了兩種分娩方式造成的腸道微生物變化與年齡和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的相關(guān)性，旨在探討分娩方式造成的腸道微生物變化對0～3歲嬰幼兒生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

258例0～3歲健康嬰幼兒腸道糞便樣品取自北京海淀區(qū)、昌平區(qū)、豐臺區(qū)、石景山等社區(qū)，其中剖宮產(chǎn)樣品為97例、自然分娩的樣品為161例。所有志愿者均已簽署知情同意書。新鮮樣品收集于無菌糞便采集管中，冰上運(yùn)輸，并于2 h內(nèi)進(jìn)行糞便DNA的提取，剩余糞便樣品或不能立即提取的糞便樣品置于-80℃保存。

1.2 糞便DNA提取

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(天根，DP328)提取糞便樣本中的細(xì)菌基因組DNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.3 文庫構(gòu)建和測序

利用ExTaq酶對16S rRNA基因的V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：Forward: 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′, Reverse: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。每一條前向引物的5′末端均加入10 bp的一段barcode序列，用于區(qū)分不同條件的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增條件是： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性1 min，48 ℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，25 cycles；72 ℃ 再延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物按照每個100 ng的質(zhì)量進(jìn)行混合后，對混合產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平加A、連接接頭和少量擴(kuò)增進(jìn)行富集。對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行Agilent 2 100和QPCR質(zhì)檢，合格后用于Miseq 2×150 bp的測序。

1.4 分析軟件

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去掉接頭和低質(zhì)量的測序序列，得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，并用fastqc軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，使用FLASH軟件對高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，獲得更多含barcode的測序序列。再使用QIIME軟件根據(jù)barcode序列將該組裝結(jié)果回歸樣品，并對每個樣品的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。然后使用uclust軟件根據(jù)序列相似性(閾值為97%)進(jìn)行聚類，得到OTU(操作分類單元)序列，并進(jìn)行優(yōu)化和分類。本研究使用稀釋曲線表征樣品的測序深度；利用greengenes數(shù)據(jù)庫(201305版本)并根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，分析樣品在各分類水平上的物種組成比例情況；物種豐度的顯著性差異用秩和檢驗(yàn)，以Pvalue進(jìn)行篩選；最后通過主成分分析以及關(guān)聯(lián)性分析表征腸道微生物的變化與年齡、BMI等參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分娩方式0～3歲嬰幼兒腸道菌群的組成

將258例入組的嬰幼兒腸道樣品按照分娩方式分為自然分娩(161例)和剖宮產(chǎn)(97例)兩組，每組的平均測序reads數(shù)分別為136 393和106 642，從稀釋曲線來看，幾乎所有樣品都能達(dá)到測序的平臺期，即數(shù)據(jù)都已達(dá)到飽和狀態(tài)。圖1-A表明，在門水平上，自然分娩和剖宮產(chǎn)的微生物組成大致相同，主要由厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門和擬桿菌門組成，但在菌種的組成比例上有所不同。相比剖宮產(chǎn)的嬰幼兒，自然分娩的嬰幼兒糞便中含有更高比例的變形菌門(9.37% VS 6.89%)和放線菌門(16.86% VS 13.92%)，而厚壁菌門的比例(61.16% VS 67.17%)相對較低。在屬水平上(圖1-B)，菌群的變化與門水平類似。兩種分娩方式的腸道菌屬組成均包括雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬、普氏糞桿菌屬、艾克曼菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬和巨單胞菌屬等，但這些菌屬的具體組成比例是有差別的。相比剖宮產(chǎn)的嬰幼兒，自然分娩的嬰幼兒糞便中含有更高比例的雙歧桿菌屬(15.74% VS 13.01%)、克雷伯氏菌克雷伯氏菌屬(2.13% VS 1.15%)和擬桿菌屬(8.32% VS 7.12%)，而普氏糞桿菌屬(10.78% VS 12.32%)、厚壁菌屬(4.18% VS 5.69%)和梭菌屬(1.53% VS 2.25%)的比例相對較低。

A:在門水平上，腸道菌群的組成情況；B:在屬水平上，腸道菌群的組成情況

圖1不同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的組成情況

Figure 1 The composition of intestinal flora in infants with different delivery modes

2.2 不同分娩方式0～3歲嬰幼兒腸道菌群的豐度變化

在門水平上，自然分娩與剖宮產(chǎn)相比，豐度具有顯著變化(P<0.05)的微生物種類有放線菌門、厚壁菌門、柔膜菌門和酸桿菌門。其中，放線菌門(圖2-A)、酸桿菌門(圖2-B)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(16.86%、0.00204%)高于剖宮產(chǎn)嬰幼兒(13.92%、0%)；而厚壁菌門(圖2-C)和柔膜菌門(圖2-D)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(61.16%、0.051%)低于剖宮產(chǎn)嬰幼兒(67.17%、0.074%)。

A：放線菌門;B:酸桿菌門;C:厚壁菌門;D:柔膜菌門

圖2門水平不同分娩方式引起顯著變化的腸道菌群種類

Figure 2 Microbes with significant differences in different mode of delivery in phylum level

在屬水平上，自然分娩與剖宮產(chǎn)相比，共有22種微生物發(fā)生了顯著性變化(P<0.05)，其中包括雙歧桿菌屬、梭菌屬、毛螺菌屬、桿菌屬、帕拉普氏菌屬、嗜胨菌屬、普氏菌屬和羅斯氏菌屬8種菌屬。其中，雙歧桿菌屬(圖3-A)和毛螺菌屬(圖3-B)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(15.74%、1.68%)高于剖宮產(chǎn)嬰幼兒(13.01%、1.04%)；而梭菌屬(圖3-C)、桿菌屬(圖3-D)、帕拉普氏菌屬(圖3-E)、嗜胨菌屬(圖3-F)、普氏菌屬(圖3-G)和羅斯氏菌屬(圖3-H)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(1.53%、0.0063%、0.0049%、0.0087%、0.86%、1.29%)低于剖宮產(chǎn)嬰幼兒(2.25%、0.018%、0.028%、0.0041%、1.04%、1.66%)。

A:雙歧桿菌屬;B:毛螺菌屬;C:梭菌屬;D:桿菌屬;E:帕拉普氏菌屬;F:嗜胨菌屬;G:普氏菌屬;H:羅斯氏菌屬

圖3屬水平不同分娩方式引起顯著變化的腸道菌群種類

Figure 3 Microbes with significant differences in different mode of delivery in genus level

2.3 不同分娩方式與嬰幼兒年齡、BMI指數(shù)的相關(guān)性分析

首先，在整體水平上對0～3歲所有嬰幼兒腸道樣品進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)無論是否考慮到菌群的相對含量，即加權(quán)(圖4-A)或不加權(quán)(圖4-B)的情況，剖宮產(chǎn)和自然分娩并沒有明顯的分群現(xiàn)象，二者呈大體一致的分散狀態(tài)，即它們的群落組成在整體水平上并沒有明顯的區(qū)別。

A:加權(quán)分析;B:不加權(quán)分析

圖4不同分娩方式嬰幼兒腸道菌群主成分分析

Figure 4 Principal component analysis of intestinal flora of infants with different modes of delivery

然后將樣品按照年齡段分為0～0.5、0.5～1、1～1.5、1.5～2、2～2.5和2.5～3歲6組，觀察剖宮產(chǎn)和自然分娩兩種不同分娩方式，隨著嬰幼兒年齡的增長是否會造成腸道微生物的改變。從圖5可以看到，在嬰幼兒0～0.5歲時，剖宮產(chǎn)的腸道微生物種類要高于自然分娩的微生物種類，剖宮產(chǎn)的嬰幼兒腸道微生物OTU數(shù)量是319，自然分娩的OTU數(shù)量是189.5。隨著嬰幼兒年齡的增長，在嬰幼兒0.5歲之后一直到3歲的5個時間段內(nèi)，兩種分娩方式的腸道微生物種類數(shù)量基本相同，二者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖5 不同分娩方式造成的嬰幼兒腸道菌群變化與年齡的相關(guān)性分析

接下來，又對這些樣品按照嬰幼兒發(fā)育的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)進(jìn)行了分組，從而評價剖宮產(chǎn)和自然分娩兩種不同分娩方式造成的腸道微生物變化對嬰幼兒發(fā)育和健康情況的影響。從圖6可以看到，將樣品分為超輕、正常、超重和肥胖4組，在正常組中，剖宮產(chǎn)與自然分娩的腸道微生物種類即OTU數(shù)量分別為241.7和280.8，二者沒有顯著性差異；在肥胖和超輕的嬰幼兒腸道中，剖宮產(chǎn)的微生物種類數(shù)量高于自然分娩，它們的OTU數(shù)量分別是232.6 VS 215.5、281 VS 270；而在超重的嬰幼兒樣品中，剖宮產(chǎn)(OTU數(shù)量為154)的微生物種類低于自然分娩(OTU數(shù)量為237)，但所有這些差異均沒有顯著性(P>0.05)。

圖6 不同分娩方式造成的嬰幼兒腸道菌群變化與BMI的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)剖宮產(chǎn)嬰兒的腸道菌群定殖模式與自然分娩嬰兒的腸道菌群定殖模式不同[10]。有研究表明剖宮產(chǎn)嬰兒在出生后一年內(nèi)擬桿菌屬缺失或延遲定殖[11-12]，以梭狀芽胞桿菌為主的嬰兒腸道細(xì)菌與分娩方式無關(guān)[13]。而另外一項(xiàng)發(fā)展中國家進(jìn)行的研究表明，剖宮產(chǎn)分娩的嬰兒擬桿菌屬存在早期定殖的情況，這可能是由于周圍環(huán)境中的糞便細(xì)菌造成的，比如自然分娩的嬰兒腸道中，放線菌門的多樣性較高[14]。但這些菌群差異與分娩方式之間的關(guān)系仍然不清楚。這些研究中觀察到的相互矛盾的結(jié)果可能并非都?xì)w因于用于檢測嬰兒早期腸道菌群的技術(shù)，因?yàn)閰捬鯇倩蚣嫘詤捬蹙梢酝瑫r通過依賴于培養(yǎng)的方法和獨(dú)立于培養(yǎng)的技術(shù)比如測序技術(shù)進(jìn)行檢測。有研究對來自Pubmed、Medline、Embase和Web of Science四大數(shù)據(jù)庫的相關(guān)研究進(jìn)行了篩選和整合，分析嬰兒出生后第一年分娩方式對其腸道微生物菌群變化的影響[15]。結(jié)果表明從出生到90 d，剖宮產(chǎn)分娩的嬰兒與自然分娩的嬰兒相比，放線菌門和擬桿菌門(如雙歧桿菌屬和擬桿菌屬)的多樣性顯著降低，但來自厚壁菌門的一些菌屬(以梭菌屬和乳酸桿菌屬為主)的豐度變化與分娩方式不相關(guān)。這與我們的研究結(jié)果類似，放線菌門和雙歧桿菌屬在剖宮產(chǎn)分娩的嬰幼兒腸道中含量明顯低于自然分娩的嬰幼兒，而厚壁菌門和梭菌屬在剖宮產(chǎn)分娩的嬰幼兒腸道中含量明顯升高。但我們沒有觀察到擬桿菌屬和乳酸桿菌屬的顯著變化。這種變化除了可能與檢測技術(shù)有關(guān)外，其他因素如出生地、母體陰道或皮膚微生物群、嬰兒喂養(yǎng)類型、出生體重、出生時的胎齡、出生后住院、產(chǎn)前服用益生菌和產(chǎn)前預(yù)防性抗生素等都會影響嬰兒腸道微生物菌群的模式[16]。例如，出生后抗生素的使用與梭菌屬的相對豐度較高、雙歧桿菌和擬桿菌數(shù)量減少有關(guān)[6,17-18]。缺乏與母體陰道微生物群的接觸，可能是剖宮產(chǎn)分娩嬰兒中厚壁菌門屬的豐度較高，擬桿菌門屬的定殖較晚的原因。之前的研究表明，擬桿菌屬可能在分娩期間從母體腸道傳播到新生兒[19-20]。剖腹產(chǎn)會減少嬰兒出生后第一個小時的母乳喂養(yǎng)，這可能破壞嬰兒腸道微生物群的多樣性和定殖模式。母乳喂養(yǎng)的嬰兒體內(nèi)雙歧桿菌屬的含量更高。最近的研究表明，母乳中含有有益于腸道微生物群的因素，如母乳低聚糖(HMO)，通過刺激雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長來發(fā)揮益生元的作用，從而選擇性地改變腸道的微生物組成[21]。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)兩個劣勢菌門的顯著變化：酸桿菌門和柔膜菌門，希望能引起研究者的關(guān)注。酸桿菌門是新近被分出的一門細(xì)菌，其在腸道生境中的研究相對較少，但已經(jīng)確定酸桿菌門在環(huán)境樣本如土壤生境系統(tǒng)的維持中發(fā)揮重要作用[22]。而柔膜菌門在腸道微生物的研究中大多與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[23]。但是這些劣勢菌在嬰幼兒的生長發(fā)育中究竟發(fā)揮多大的作用還有待于探討。

總之，剖宮產(chǎn)嬰幼兒腸道中厚壁菌門的豐度升高、放線菌門以及雙歧桿菌屬的豐度降低，均提示腸道菌群功能的改變。有研究指出嬰兒腸道微生物菌群的早期發(fā)育在宿主免疫系統(tǒng)的成熟、抵御病原體和提供營養(yǎng)方面起著重要作用[24]。有人認(rèn)為，先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)會影響腸道細(xì)菌組成。出生后腸道功能和免疫發(fā)育在很大程度上受腸道微生物菌群的影響，有研究表明早期微生物菌群的定殖可能影響晚期疾病的發(fā)生[25]。West等人觀察到嬰兒期的微生物多樣性較低，這先于過敏性疾病的發(fā)生[26]。Azad等人發(fā)現(xiàn)食物致敏的嬰兒，其3個月和1年時腸道微生物群中腸桿菌科較豐富，擬桿菌科較不豐富[27]。最新的研究表明[28]，通過評估嬰兒時期的腸道菌群，或許可以預(yù)測有超重或者肥胖風(fēng)險的兒童?？茖W(xué)家們選取了165例嬰兒，并分析了他們成長到12歲的BMI數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)，在生命初期，腸道微生物群組成和后來的BMI指數(shù)之間存在某種聯(lián)系，隨著孩子年齡的增長，這種聯(lián)系變得強(qiáng)烈，特別是2歲時最為強(qiáng)烈，但此時的嬰幼兒對于以后是否發(fā)胖并不會表現(xiàn)出明顯的表型。我們的結(jié)果也表明，0～3歲嬰幼兒腸道微生物種類數(shù)量的變化不足以對嬰幼兒的生長發(fā)育造成顯著性差異，二者之間沒有相關(guān)性。并且，我們發(fā)現(xiàn)，0～3歲嬰幼兒腸道微生物種類數(shù)量的變化也不會隨著年齡的增長而使差異變得顯著。但有研究用meta分析的方法發(fā)現(xiàn)剖宮產(chǎn)與成年期BMI指數(shù)的增加，如超重和肥胖有很強(qiáng)的相關(guān)性[29]。這些結(jié)果提示，腸道微生物的變化是疾病的一個早期信號，這也為腸道微生物作為疾病早期預(yù)警的生物標(biāo)記物奠定了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

綜上所述，剖宮產(chǎn)和自然分娩不影響0～3歲嬰幼兒腸道菌群組成，但是剖宮產(chǎn)會造成嬰幼兒腸道雙歧桿菌屬等益生菌的含量減低。這種個別菌群的變化在0～3歲之間，不會隨著嬰幼兒年齡的增長而在整體水平上造成顯著性差異，并且對嬰幼兒的BMI指數(shù)也不會造成顯著性差異。但剖宮產(chǎn)造成的某些菌群相對豐度的變化，是否會在嬰幼兒3歲以后造成其腸道菌群的顯著性變化，以及是否影響嬰幼兒對疾病的易感性以及恢復(fù)進(jìn)度，還有待于進(jìn)一步研究。因此，剖宮產(chǎn)作為一種終止異常妊娠的應(yīng)急手段，還是要慎重選擇。