小鼠CYP2J5基因組織差異表達及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析

白 皓, 路宏朝, 王 令, 王珊珊, 杜偉立, 張 濤

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000)

細胞色素P450，家族2，亞家族j，多肽5(Cytochrome P450，family 2，subfamily j，polypeptide 5，CYP2J5)屬于細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)超家族，CYP2J亞家族的一員。CYP450是一種含血紅素的酶，其能催化多種異生素和內(nèi)源性化合物的代謝[1-2]，包括臨床藥物、環(huán)境污染物及化學(xué)致癌物，因此一直是毒理學(xué)家和藥學(xué)家研究的重點[3-5]。CYP2J亞家族可以將哺乳動物細胞膜中的多不飽和脂肪酸花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)環(huán)氧化為具有生物活性的環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)或羥基化為羥基二十碳五烯酸(HETEs)[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)EETs在血管擴張、抗炎、心臟保護、纖維蛋白溶解和血管生成方面都有作用，且在體外和體內(nèi)均有影響[7]。King等[9]研究發(fā)現(xiàn)CYP2J2基因中的單核苷酸多態(tài)性與人類高血壓有關(guān)。Athirakul等[10]研究發(fā)現(xiàn)小鼠的CYP2J5可將AA和亞油酸代謝為EETs，從而具有調(diào)節(jié)腎小管功能和血管張力的能力。研究顯示，CYP2J5在腎臟中含量豐富，尤其是在腎近端小管中[11]。此外，CYP2J5蛋白在AA對EET的代謝過程中具有活性。Ma等[12]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠青春期后，隨著小鼠年齡的增長在雄性小鼠腎臟中CYP2J5蛋白表達水平比雌性小鼠更高，并發(fā)現(xiàn)CYP2J5蛋白的表達由性激素調(diào)節(jié)，但具體調(diào)節(jié)機制并不清楚。

鑒于此，本研究通過分析小鼠CYP2J5基因在不同組織的表達差異、生物信息學(xué)特征、構(gòu)建超表達載體并檢測相關(guān)通路關(guān)鍵基因表達差異，以期為今后研究CYP2J5基因?qū)ι飳W(xué)過程的調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物

選取3只90日齡C57BL品系雄性小鼠，實驗室小鼠均購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix E×TaqTMⅡ試劑和ECL曝光液由TaKaRa公司提供；Q5Taq和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；細胞總蛋白提取試劑盒(HEART)；HRP標(biāo)記的二抗(康為世紀(jì)，1∶1000)；GeneGnome XRQ化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Synoptics, USA)；倒置熒光相差顯微鏡(Leica, DFC450, USA)；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；TM3細胞購自上海賽百慷公司。

1.2 方法

1.2.1CYP2J5基因組織差異表達

分別取3只90 d小鼠肺、心、肝、腎、皮膚、肌肉、小腸和睪丸8種組織，采用Trizol法提取雄性小鼠腎臟組織總RNA，核酸/蛋白濃度測定儀檢測其濃度。以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物(表1)，按照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA。以鼠β-actin作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR檢測小鼠不同組織中CYP2J5基因的mRNA表達水平，每種組織設(shè)置3個重復(fù)。擴增體系：SYBRⅡ (TaKaRa) 5 μL，Primer F/R 0.8 μL，cDNA 1 μL，H2O 2.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min。溶解曲線收集信號的程序：95 ℃預(yù)變性15 s；60 ℃變性1 min；95 ℃退火15 s。

表1 目的基因引物信息

1.2.2 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化參數(shù)；利用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親疏水性；利用Signal IP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號肽；利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；利用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)分析蛋白亞細胞定位；利用STRING 10.5(https://string-db.org/cgi/access.pl?sessionId=ZeLv9N87S0Ow&footer_active_subpage=archive)進行分子功能預(yù)測；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 引物設(shè)計與合成

參照小鼠CYP2J5基因(GeneBank登錄號：NM_010007.4)，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計其CDS區(qū)引物。上游引物CYP2J5-HA-F 5′-CCAAGCTTATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATTATGTTTTTGAGCTCCCT-3′，下游引物CYP2J5-HA-R 5′- GCTCTAGATCACACTCTAGGGATAGCAC-3′，單下劃線表示Hind Ⅲ酶切位點，雙下劃線表示XbaⅠ酶切位點，加粗部分為HA標(biāo)簽。

1.2.4CYP2J5基因擴增和克隆

以小鼠腎臟cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增體系分別用CYP2J5-HA-F、CYP2J5-R和CYP2J5-F、CYP2J5-HA-R為引物。Q5Taq50 μL體系擴增CYP2J5 A、B兩段，后overlap-PCR擴增含HA標(biāo)簽的CYP2J5基因CDS區(qū)全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由DNA純化試劑盒回收。加A試劑盒后與載體pMD19-T于16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細胞。以通用引物M16-F/M16-R為引物采用菌落PCR，Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切以及測序鑒定，獲得重組載體PMD19-T-CYP2J5-HA。

1.2.5 真核超表達載體的構(gòu)建

Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切純化PMD19-T-CYP2J5載體和骨架載體pCDNA3.1，然后用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細胞于37℃過夜培養(yǎng)。以CMV-F/CYP2J5-HA-R為引物采用菌落PCR和雙酶切鑒定，獲得重組載體pCDNA3.1-CYP2J5-HA。

1.2.6 重組載體表達分析

將已構(gòu)建好的pCDNA3.1-CYP2J5-HA重組載體轉(zhuǎn)染至TM3細胞中，空載pCDNA3.1作為對照組。Opti-MEM稀釋質(zhì)粒和Superfect轉(zhuǎn)染試劑后靜置5 min，混合質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑后靜置30 min，加入細胞培養(yǎng)皿，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h收取RNA樣品；72 h收取蛋白樣品，通過Western Blot檢測其超表達水平。

1.2.7 脂代謝與性激素通路基因檢測

采用Trizol法提取實驗組與對照組細胞RNA，核酸/蛋白濃度測定儀檢測其濃度。以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物(表2)，按照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成相應(yīng)的cDNA。以cDNA為模板，選取小鼠β-actin作為內(nèi)參基因。采用實時熒光定量PCR檢測CYP2J5基因及脂代謝與性激素相關(guān)基因mRNA表達水平。擴增體系：SYBRⅡ (TaKaRa) 5 μL，Primer F/R 0.8 μL，cDNA 1 μL，H2O 2.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min。溶解曲線收集信號的程序：95 ℃預(yù)變性15 s；60 ℃變性1 min，95 ℃退火15 s 。

表2 性激素通路基因引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠不同組織中CYP2J5表達水平

以小鼠β-actin為內(nèi)參基因，qPCR技術(shù)檢測小鼠8種組織中CYP2J5表達水平。結(jié)果顯示，在小鼠肺、心、肝、腎、皮膚、肌肉、小腸和睪丸共8種組織中均可檢測到CYP2J5的表達，說明該基因廣泛表達，在不同組織中均發(fā)揮相對重要的功能。實驗結(jié)果顯示肺組織中的CYP2J5表達量最低，肝臟中表達最高，其次是心、皮膚、肌肉、小腸和睪丸。以肺組織的表達水平為參照，該基因在心、肝、腎、皮膚、肌肉、小腸中表達量與其相比較差異極顯著(P<0.01)，睪丸中表達水平與肺組織之間沒有顯著差異(圖1)，結(jié)果說明CYP2J5基因在不同組織中的生物學(xué)功能存在一定差異。

**表示差異極顯著(P<0.01)

圖1小鼠CYP2J5基因組織表達譜

Figure 1 Relative mRNA expression ofCYP2J5 at different tissues in mouse

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析

利用ProtParam軟件分析小鼠CYP2J5蛋白的理化性質(zhì)，分析結(jié)果見表3。

表3 小鼠CYP2J5蛋白的理化性質(zhì)分析

2.2.2 疏水性分析

利用Protscale軟件進行小鼠CYP2J5蛋白親疏水性分析，結(jié)果見圖2，正值表示疏水，值越大疏水性越強；負(fù)值表示親水，值越低親水性越強。第25位纈氨酸(Val)疏水性最強(3.100)，第267位賴氨酸(Lys)親水性最強(-3.100)。按分值大小(Score<-2)劃分，CYP2J5蛋白屬于可溶性蛋白質(zhì)。

圖2 CYP2J5蛋白的疏水性預(yù)測

2.2.3 信號肽及跨膜信號分析

利用Signal IP 4.1軟件進行CYP2J5蛋白信號肽分析，結(jié)果(見圖3)顯示，C值為剪切位點值，S值為信號肽分值，Y值為綜合分值。其C、Y、S最大值分別為0.283、0.248和0.725。以上數(shù)據(jù)得知此蛋白有信號肽存在。

圖3 CYP2J5蛋白信號肽預(yù)測

利用TMHMM 2.0軟件進行CYP2J5蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖4。表明蛋白存在跨膜區(qū)，跨膜區(qū)在第13～35及75～97個氨基酸之間。

圖4 CYP2J5蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析

2.2.4 亞細胞定位分析

利用PSORTⅡ軟件進行亞細胞定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠CYP2J5蛋白在細胞質(zhì)、線粒體、細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布比例分別為39.1%、17.4%、17.4%和13.0%。該蛋白屬于細胞質(zhì)蛋白質(zhì)。

2.2.5 分子功能預(yù)測分析

為了分析CYP2J5的潛在分子功能，利用String 10.5預(yù)測與CYP2J5相互作用的蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖5所示。Ugt2b5、Cyp4a12a、Cyp4a12b、Cyp3a11、Cyp3a41a、Cyp4a10、Cyp3a25、Ugt2b1、Cyp2c70和Ephx2共10個蛋白質(zhì)與CYP2J5相互作用(分值>0.9)。

對以上10種蛋白質(zhì)編碼基因進行GO注釋，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與細胞脂代謝和脂肪酸代謝等生物調(diào)節(jié)過程。如單細胞生長過程(GO:0055114)、單羧酸代謝過程(GO:0032787)、細胞脂代謝過程(GO:0044255)、脂肪酸代謝過程(GO:0006631)、二十烷類代謝過程(GO:0006690)等生物過程相關(guān)的GO條目分別富集9個、5個、5個、4個和3個基因。

圖5 與CYP2J5相互作用的蛋白質(zhì)

2.2.6 結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA軟件預(yù)測CYP2J5蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6。CYP2J5蛋白的二級結(jié)構(gòu)237個氨基酸為α-螺旋，56個氨基酸為延伸鏈，177個氨基酸為無規(guī)則卷曲和31個氨基酸為β-轉(zhuǎn)角，分別占47.31%、11.18%、35.33%和6.19%。

H：α-螺旋；e：延伸鏈；t：β-轉(zhuǎn)角；c：無規(guī)則卷曲

圖6小鼠CYP2J5蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Figure 6 Prediction of secondary structure of mouse CYP2J5 protein

利用SWISS-MODEL同源建模預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(如圖7)表明，其三級結(jié)構(gòu)主要由17個α-螺旋和14個β-轉(zhuǎn)角組成，與預(yù)測二級結(jié)構(gòu)結(jié)果相符，只有一個p450功能結(jié)構(gòu)域，位于第44～496氨基酸序列間，主要參與多種化合物的氧化降解。

圖7 小鼠CYP2J5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 Overlap-PCR擴增CYP2J5基因與TA克隆

以小鼠腎臟cDNA為模板，overlap-PCR擴增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，1號泳道出現(xiàn)與1533 bp大小一致的片段?；厥蘸琀A標(biāo)簽的CYP2J5片段與pMD19-T連接轉(zhuǎn)化后挑取21個單菌落，菌落PCR檢測，發(fā)現(xiàn)3、17號菌落符合目的條帶大小。測序鑒定表明3號質(zhì)粒為成功克隆的含HA標(biāo)簽的CYP2J5基因CDS區(qū)序列(圖8和圖9)。

M：DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000

圖8CYP2J5基因的PCR擴增

Figure 8 PCR amplification ofCYP2J5 gene

M：DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000; 1～21：單克隆菌落

圖9菌落PCR鑒定

Figure 9 Identification of colony PCR

M：DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000; 1～8：單克隆菌落

圖10菌落PCR鑒定

Figure 10 Identification of colony PCR

2.4 CYP2J5真核超表達載體構(gòu)建

從培養(yǎng)皿挑取8個單克隆進行菌落PCR鑒定，電泳檢測發(fā)現(xiàn)7、8號泳道有單一條帶，大小約為1664 bp，與目的片段大小一致(圖10)；然后選取7和8號單克隆，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。結(jié)果表明8號質(zhì)粒能切出1533 bp的含HA標(biāo)簽的CYP2J5基因和骨架載體兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致，說明成功構(gòu)建重組表達載體pCDNA3.1-CYP2J5-HA(圖11)。

M：DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL5000; 1～2：雙酶切產(chǎn)物

圖11pCDNA3.1-CYP2J5-HA酶切驗證

Figure 11 Enzyme-digested products of plasmids

2.5 超表達載體表達分析

將pCDNA3.1-CYP2J5-HA重組載體轉(zhuǎn)染至TM3細胞，72 h后收取細胞蛋白樣，Western Blot檢測轉(zhuǎn)染之后CYP2J5蛋白表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達組在59 ku出現(xiàn)與目的條帶大小一致條帶(圖12)。實驗證明成功構(gòu)建CYP2J5超表達載體。

圖12 CYP2J5蛋白表達水平

2.6 脂代謝與性激素相關(guān)基因檢測

以小鼠β-actin為內(nèi)參基因，qPCR技術(shù)檢測TM3細胞中CYP2J5及脂代謝與性激素相關(guān)基因表達水平。結(jié)果顯示，超表達CYP2J5基因之后，脂代謝通路關(guān)鍵基因脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)、硬脂酰-輔酶A去飽和酶1(Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1，SCD-1)和FK506結(jié)合蛋白51(FK506 blinding protein 51，F(xiàn)KBP51)表達量顯著降低(P<0.01)，脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)表達量顯著增高(P<0.01)，具體見圖13。性激素通路關(guān)鍵基因蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase，PKA)表達量顯著降低(P<0.01)，類固醇生成因子-1(Steroidogenic factor-1，SF-1)基因表達量顯著增高(P<0.05)，磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)基因表達量無顯著差異(圖14)。

圖13 脂代謝通路基因表達譜

圖14 性激素通路基因表達譜

3 討論

CYP450家族是一種含血紅素的酶，可以參與內(nèi)源性底物的代謝，包括花生四烯酸和類固醇激素的代謝，代謝產(chǎn)物會影響腎臟中電解質(zhì)的轉(zhuǎn)運和血管張力，可能影響腎功能和血壓調(diào)節(jié)能力[4,13]。CYP2亞型可通過氧化花生四烯酸生成4種同源異質(zhì)的5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET或14，15-EET和EETs，通過腎臟和血管作用降低血壓，并可能改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)[14]。陳文樹等[15]構(gòu)建大鼠肺缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)CYP2J2過表達或外源性EETs可減輕再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及凋亡，并對損傷有正調(diào)節(jié)作用，說明CYP2J2對血管內(nèi)皮細胞具有調(diào)節(jié)能力。戴梅艷[16]發(fā)現(xiàn)超表達CYP2J2后其產(chǎn)物EETs可以改善組織炎癥信號通路和胰島素通路，抑制炎癥并改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗。油文亭[17]發(fā)現(xiàn)CYP2J3可顯著增強心肌細胞活力并抑制凋亡，對心肌細胞起保護作用。Athirakul等[10]敲除小鼠CYP2J5基因后發(fā)現(xiàn)其發(fā)育正常并且無明顯腎臟病理學(xué)特征。進一步研究發(fā)現(xiàn)CYP2J5基因的缺失與血壓升高、近端腎小管轉(zhuǎn)運速率增加和血管緊張素Ⅱ及內(nèi)皮素Ⅰ過度傳入小動脈反應(yīng)有關(guān)。Leon等[18]通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)證明了小鼠CYP2J5蛋白與微粒體環(huán)氧化酶(mEH)存在相關(guān)性。CYP2J5本身具有花生四烯酸環(huán)氧化酶的特征，CYP2J5和mEH在小鼠海馬神經(jīng)元中的共定位，另外，mEH有助于花生四烯酸環(huán)氧化物的腦轉(zhuǎn)換，表明mEH在調(diào)節(jié)這些重要內(nèi)源信號分子時具有重要作用，并可能與CYP2J5相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

前期的酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)CYP2J5蛋白與維生素D受體(VDR)存在互作關(guān)系[19]，并發(fā)現(xiàn)CYP2J5基因可能與雄性生殖和激素代謝等生物學(xué)功能有關(guān)。因此本研究欲通過qPCR、生物學(xué)信息學(xué)預(yù)測分析、CYP2J5基因載體構(gòu)建和小鼠TM3細胞中過表達效應(yīng)分析等方面系統(tǒng)探索CYP2J5在雄性生殖方面的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)CYP2J5在小鼠肺、心、肝、腎、皮膚、肌肉、小腸和睪丸共8種組織中均有表達，且在肝臟和腎臟中表達水平相對最高，說明該基因生物學(xué)功能比較廣泛，并可能主要參與脂類、激素代謝和維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于可溶性蛋白質(zhì)，有信號肽存在并在第13～35及75～97個氨基酸之間存在跨膜區(qū)。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)其屬于細胞質(zhì)蛋白質(zhì)。高級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，CYP2J5蛋白含有47.31%的α-螺旋，11.18%的延伸鏈，35.33%的無規(guī)則卷曲和6.19%的β-轉(zhuǎn)角，且第44～496氨基酸序列間有一個p450功能結(jié)構(gòu)域，主要參與多種化合物的氧化降解。通過功能分析，發(fā)現(xiàn)了10個與CYP2J5相互作用的蛋白質(zhì)，GO注釋分析它可能主要參與細胞脂代謝和脂肪酸代謝等生物調(diào)節(jié)過程，該預(yù)測結(jié)果與文獻報道的CYP450家族蛋白的功能基本一致[20]，也符合本研究前期的結(jié)果分析和實驗預(yù)期[19]。本研究成功構(gòu)建了帶有HA標(biāo)簽的CYP2J5基因超表達載體，并在TM3細胞超表達CYP2J5分析脂代謝與性激素通路關(guān)鍵基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)脂代謝通路關(guān)鍵基因LPL、SCD-1、FKBP51表達顯著下降，F(xiàn)ABP4表達顯著上升；性激素通路關(guān)鍵基因PKA表達顯著下降，SF-1表達顯著上升。表明CYP2J5在脂代謝及性激素過程中可能發(fā)揮重要作用，并可能具有調(diào)控機體脂肪酸代謝及性激素合成的能力，這一實驗結(jié)果進一步確認(rèn)了生物信息學(xué)預(yù)測的生物學(xué)功能。CYP2J5基因在小鼠腎臟和肝臟中高表達并顯著影響脂代謝與性激素通路關(guān)鍵基因，進一步表明該基因可能對血壓血糖、糖代謝、脂代謝及性激素代謝具有生理調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究成功克隆CYP2J5基因并系統(tǒng)地對其理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，構(gòu)建其表達載體并檢測脂代謝與性激素通路關(guān)鍵基因，為研究CYP2J5基因?qū)χx、性激素和血壓血糖調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。