五倍子瘢痕膏對瘢痕疙瘩miR-21/mTOR信號通路相關分子表達的影響

唐志銘，翟曉翔，丁繼存，荊夢晴，管志強，李永聰

（1.徐州市中醫(yī)院，江蘇徐州221003；2.上海市第七人民醫(yī)院，上海200137；3.徐州市中心醫(yī)院，江蘇徐州221009；4.徐州市第一人民醫(yī)院，江蘇徐州221002）

目前瘢痕疙瘩的的發(fā)病機制甚多，但是其確切發(fā)生機制至今尚未完全闡明，且其防治也沒有取得突破性進展。中醫(yī)藥防治瘢痕疙瘩有著悠久的歷史，并且積累了許多寶貴的經驗與方法。本課題組應用五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩療效確切[1]，前期實驗研究證實其能抑制疤痕疙瘩成纖維細胞增殖[2]，但其具體作用機制尚不清楚。近幾年來微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在瘢痕疙瘩發(fā)生中的作用日益受到重視，對其深入的研究有望為瘢痕疙瘩的防治提供嶄新的思路和手段。有研究者應用基因芯片技術證明miRNA在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在著差異性表達[3-4]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[5]。miR-21的一個靶基因是10號染色體張力缺失蛋白磷酸酶（PTEN），而PTEN是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的一個重要負反饋調控因子。那么五倍子疤痕膏抑制疤痕疙瘩成纖維細胞增殖是否與其干預miR-21/mTOR通路有關呢？為證實這一推測，本研究檢測瘢痕疙瘩中miR-21/mTOR信號通路相關分子的表達情況及五倍子瘢痕膏對該通路的干預作用，以闡明五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的具體機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 瘢痕疙瘩組織標本來自徐州市中醫(yī)院皮膚科36例行手術切除治療的前胸部瘢痕疙瘩患者，其中，男17例，女19例，年齡12～65歲，平均（23.4±2.6）歲，病程3個月～4年，平均（13.7±0.6）個月。正常皮膚組織標本來源于徐州市中醫(yī)院泌尿外科36例包皮過長患者所切除的包皮。

1.1.2 實驗動物 6周齡裸鼠（BALB/C-nunu品系）36只，雌性，體質量18～22 g，購自徐州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 參照Kischer法[6]，將36只裸鼠無菌環(huán)境進行適應性喂養(yǎng)1周后，稱量體質量，計算水合氯醛麻醉量（麻醉量/裸鼠體質量=0.8 mL/10 g），采用腹腔注射麻醉裸鼠，頸背部皮膚切開，將人體手術切除的瘢痕疙瘩組織切割成5 mm×5 mm×5 mm方塊，移植到裸鼠背部皮下，對稱縫合，加壓包扎，固定，37℃溫箱麻醉復蘇。14 d左右瘢痕疙瘩模型建成。

1.2.2 瘢痕疙瘩模型分組與干預方法 將瘢痕疙瘩模型隨機分成2組，即治療組和對照組，每組18只。治療組涂抹五倍子瘢痕膏（處方組成為黑醋、五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮和白礬，由徐州市中醫(yī)院制劑室制備成軟膏），對照組僅涂抹基質（制作瘢痕膏的基質），3次/d，連續(xù)30 d。

1.2.3 RT-PCR檢測正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中miR-21 mRNA的表達 將手術取出的治療組及對照組新鮮瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織制成組織勻漿，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責任公司）進行總RNA提取，操作步驟按試劑盒說明書進行。電泳鑒定提取RNA的完整性，統(tǒng)一調整總RNA純度為0.5 g/L，于－70℃儲存。

采用實時熒光定量PCR儀（加拿大Funglyn Biotech公司）進行miR-21基因擴增。取5 μL RNA為反轉錄模板。反轉錄反應體系為20 μL，反應條件：25℃10 min，42℃60 min，85℃5 min。標準曲線定量法制備cDNA模板標準品，依次10倍梯度稀釋，制備成5個梯度的cDNA模板定量標準品。內參基因選用U6，在GenBank數據庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer Express 2.0軟件，在CDS區(qū)設計特異性引物。引物序列見表1。

表1 miR-21基因引物序列及擴增產物片段長度

PCR反應體系為50 μL，反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性20 s，60℃退火30 s，共循環(huán)30次，72℃延伸5 min。取5 μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠中，采用電泳儀（美國Bio-Rad公司）電泳，用GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)（美國UVP公司）分析各條帶的灰度值，以各目的基因與內參基因U6的灰度值比值表示mRNA的相對表達量（RQ）。基因的表達量RQ=2-ΔΔCt。RQ值越大表示基因表達量越高。

ΔΔCt計算方法：ΔΔCt=（待測樣品的目的基因的Ct的平均值-待測樣本的看家基因的Ct平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct平均值-對照樣本的看家基因的Ct平均值）。

1.2.4 免疫組化檢測正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、10號染色體張力缺蛋白磷酸酶（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達

1.2.4.1 組織取材 采用頸椎脫臼法處死動物，隨機取出移植裸鼠背部的瘢痕疙瘩組織，同時收集正常的包皮組織18塊，采用高精度輪轉式石蠟切片機（德國徠卡公司）切成5 mm×5 mm×5 mm小塊，4%多聚甲醛低溫保存72 h以上。

1.2.4.2 免疫組織化學染色 標本制作成4 μm厚的石蠟切片，入62℃烤箱30 min，二甲苯脫蠟2次，梯度酒精水化，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。封閉內源性過氧化酶，PBS漂洗3次。用正常山羊血清在37℃溫箱中封閉非特異性抗原10 min，PBS漂洗3次。用一抗（鼠抗人mTOR、p-Akt1/2/3（B-5）、PTEN（A2B1）、PI3-Kinase p85（B-9）單克隆抗體，均為美國Santa Cruz公司產品）孵育切片入冰箱（4℃）過夜，用PBS漂洗3次。用生物素標記山羊抗裸鼠/兔IgG 37℃恒溫孵育30 min，用PBS洗3次。滴入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液10 min，切片采用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）進行顯色，室溫下反應，待顯色充分，及時用PBS漂洗2次。蘇木素染色液孵育20 s，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4.3 陰性對照 以PBS代替一抗孵育組織切片為陰性對照組。

1.2.4.4 染色結果判定 正置顯微鏡（德國徠卡公司）下觀察，p-mTOR、Akt、PI3K以胞質著色為淺黃色、棕黃色、黃褐色為陽性細胞，PTEN以細胞核著色為淺黃色、棕黃色、黃褐色為陽性細胞，評分參考Shimizu法[7]，根據每張切片染色差異，按無著色、淺黃色、棕黃色、黃褐色分別記0、1、2、3分，以陽性著色面積/光鏡下拍照面積占比0、小于1/3、1/3～2/3、大于2/3分別記0、1、2、3分。以2種評分之和≥3分記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS20.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測mir-21 mRNA的表達 治療組和正常皮膚組miR-21相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，t=1.24），但二者與對照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，t=2.76、2.81）。見表2。

表2 mir-21 mRNA mRNA相對表達量 （±s）

表2 mir-21 mRNA mRNA相對表達量 （±s）

組別治療組對照組正常皮膚組n 18 18 18 mir-21 6.03±2.52 10.26±2.69 5.51±2.36

2.2 免疫組化檢測檢測正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中PI3K、PTEN、Akt、mTOR的表達 在本實驗中觀察到PI3K、Akt、mTOR主要表達在細胞質及少量細胞核中，PTEN主要表達在細胞核及少量細胞質中，均呈棕黃色。免疫組化染色檢測結果顯示，PI3K、Akt、mTOR在對照組中高表達，而在治療組和正常皮膚組中低表達；PTEN在對照組中低表達，而在治療組和正常皮膚組中高表達。見圖1。

圖1 3組PI3K、PTEN、Akt、mTOR的表達情況

PI3K、PTEN、Akt、mTOR在治療組中表達陽性率分別為33.33%、88.89%、38.89%和16.67%，在對照組中表達陽性率分別為66.67%、22.22%、94.44%和72.22%，在正常皮膚組中表達陽性率為分別為27.78%、100.00%、44.44%和11.11%。3組之間陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組間陽性率比較，治療組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組與正常皮膚組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而治療組與正常皮膚組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組PI3K、PTEN、Akt、mTOR免疫組化染色陽性例數 例

3 討論

五倍子瘢痕膏是歐陽恒教授在瘢痕疙瘩“濕毒搏結，氣血瘀滯”病機理論[8]指導下，以中醫(yī)皮膚科奠基人趙炳南老先生創(chuàng)制的黑布藥膏（由黑醋、五倍子、蜈蚣、蜂蜜、梅花冰片組成）為基礎進行加減化裁而來，即五倍子瘢痕膏是在黑布藥膏的基礎上加丹參、威靈仙、地骨皮、白礬，同時去掉蜂蜜、冰片，應用現代工藝制成。五倍子瘢痕膏組方中老黑醋軟堅解毒，五倍子收斂解毒，蜈蚣破瘀以毒攻毒，丹參活血祛瘀，威靈仙祛濕通絡，地骨皮軟化角質層、白礬解毒燥濕，全方合用有活血化瘀、軟堅解毒的作用。本課題組在臨床研究中外用五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩，取得了很好的療效，總有效率為96.56%[1]。此外，實驗研究顯示五倍子瘢痕膏能抑制瘢痕成纖維細胞增殖[2]，這將為應用化瘀軟堅解毒法來防治瘢痕疙瘩提供科學依據。

miRNAs是一類對基因具有調控功能的內源性非編碼小分子RNA。這類非編碼的小RNA分子通過與靶基因3′非編碼區(qū)（3′-UTR）完全或不完全匹配結合，誘導靶基因mRNA降解或影響其轉錄后翻譯[9]，從而參與細胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝等一系列生物學過程。研究表明，miRNA有類似于抑癌基因或癌基因的功能，可以影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。由于瘢痕疙瘩屬于良性實體瘤，可向周圍正常組織呈侵襲性生長，其病理特點與腫瘤極為相似，有類腫瘤特性，有學者借鑒miRNA在腫瘤中的研究成果，將其應用于瘢痕疙瘩的研究之中[10]。有研究者應用基因芯片技術證明了miRNA在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在著差異性表達[3-4]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[5]。這提示miR-21與瘢痕疙瘩的發(fā)生有密切的關系。2006年，Fanyin等[11]確證了miR-21的一個靶基因是PTEN，而PTEN是有磷酸酶活性的抑癌基因[12]，也是mTOR信號通路的一個重要負反饋調控因子。

mTOR信號通路是調控蛋白質合成的主要信號通路，參與細胞增殖、分化等調節(jié)，日益受到有關研究者的重視，逐漸成為研究的熱點。mTOR信號通路包括上游的PI3K、Akt、PTEN，其中PTEN是負反饋調節(jié)因子；下游的核糖體蛋白S6K、真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白（4EBP），二者均是蛋白翻譯的關鍵調節(jié)因子。胞外信號與跨膜的酪氨酸激酶受體結合后，受體酪氨酸殘基被磷酸化而激活，從而與PI3K的調節(jié)亞基p85結合，再激活PI3K，活化的PI3K可激活下游的Akt，活化的Akt激活mTOR。mTOR是蛋白合成的關鍵調節(jié)物，激活后的mTOR作用于下游的2個主要靶蛋白，即S6K和4EBP。近年來研究證實，mTOR基因與細胞異常增殖及腫瘤的發(fā)生密切相關，在多種腫瘤，如膠質瘤、食管癌、大腸癌等組織中表達明顯增強[13]。如前所述，瘢痕疙瘩有類腫瘤特性，因此在瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖過程中mTOR信號通路應當有重要的作用。這一推斷可得到其他一些研究結果的證據支持，如董海良等[14]發(fā)現槲皮素可通過活化mTOR信號通路，啟動蛋白質翻譯起始復合物的形成，進而促進小鼠皮膚成纖維細胞的增殖。吳登艷等[15]發(fā)現黃芩苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制人增生性瘢痕組織成纖維細胞的增殖。此外，還有袁德品等[16]證實mTOR和p70S6K在瘢痕疙瘩組中的表達明顯高于非瘢痕疙瘩組和正常皮膚組織，且mTOR和p70S6K表達呈正相關，說明瘢痕疙瘩中存在異?；罨膍TOR/P70S6K信號通路，這與mTOR/p70S6K信號通路在成纖維細胞增殖中的相關研究相符。

本研究應用RT-PCR、免疫組化技術來探討miR-21及mTOR信號通路關鍵分子在瘢痕疙瘩中的表達情況及五倍子瘢痕膏對其的調控作用。RTPCR檢測結果顯示，治療組和正常皮膚組miR-21相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05，t=1.24），但二者與對照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，t=2.76、2.81）。這說明miR-21在正常皮膚組織中低表達，而在瘢痕疙瘩中高表達，經五倍子瘢痕膏干預后其表達量明顯降低。免疫組化檢測結果顯示，PI3K、Akt、mTOR在對照組中高表達，而在治療組和正常皮膚組中低表達；PTEN在對照組中低表達，而在治療組和正常皮膚組織中高表達。以上研究結果表明，miR-21/mTOR通路參與了瘢痕疙瘩的形成過程，而五倍子瘢痕膏對該信號通路存在干預作用。五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的機制可能與其通過抑制miR-21表達而上調PTEN表達，進而下調mTOR信號通路中PI3K、Akt、mTOR表達有關，這為五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩提供了理論依據。