• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證

    2020-03-12 06:51:30陳玉郭仁朋黃賽飛宋丹劉蓉
    生物工程學(xué)報(bào) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:溶酶體復(fù)合體質(zhì)粒

    陳玉,郭仁朋,黃賽飛,宋丹,劉蓉

    ·醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)·

    人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證

    陳玉,郭仁朋,黃賽飛,宋丹,劉蓉

    南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095

    同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體(HOPS) 由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種蛋白組成,能夠通過膜融合機(jī)制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運(yùn)輸。已有研究表明其可以作為融合因子來促進(jìn)自噬體與溶酶體膜融合過程。為在體外確定HOPS復(fù)合體與自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技術(shù)從已有質(zhì)粒中擴(kuò)增得到6種基因的編碼序列,將其連接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表達(dá)載體上,經(jīng)菌落PCR初步鑒定和DNA測序無誤后成功構(gòu)建6種原核表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3);利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱對重組蛋白進(jìn)行純化,煙草蝕紋病毒(TEV) 蛋白酶酶切掉GST或His-NusA標(biāo)簽,得到分子量約為105kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 kDa的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通過體外GST pull-down技術(shù)對6種蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)自噬性SNARE蛋白STX17和6種重組蛋白在體外均具有直接相互作用,為深入探究HOPS復(fù)合體參與自噬體與溶酶體膜融合過程中的功能及作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體 (HOPS),原核表達(dá),蛋白純化,自噬

    HOPS是一個(gè)在哺乳動(dòng)物和酵母之間高度保守的多蛋白復(fù)合體,由6個(gè)相對分子質(zhì)量為79–123 kDa的蛋白組成。長約30 nm,形狀類似“海馬”,Vps41位于頂部鄰近Vps16和Vps33亞基,而Vps39位于底部與Vps18和Vps11亞基連接在一起[1]。HOPS又被稱為Vps (Vacuolar protein sorting) 復(fù)合物,先發(fā)現(xiàn)的Vps11、Vps16、Vps18和Vps33構(gòu)成Vps-C complex,普遍存在于酵母、果蠅、植物、哺乳動(dòng)物中。Vps-C complex能夠通過自噬過程、膽固醇和脂質(zhì)代謝途徑處理和再循環(huán)細(xì)胞質(zhì)組分[2-3]。另外兩個(gè)亞基Vps39及Vps41則屬于Vps-B complex,與Vps-C complex形成了相對分子質(zhì)量約633 kDa的HOPS復(fù)合體。最初HOPS只被鑒定為酵母內(nèi)涵體上的一種聚集復(fù)合物,如今其已被確定能夠影響內(nèi)涵體和溶酶體的成熟和傳遞過程,可以通過膜融合機(jī)制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運(yùn)輸,對于酵母和哺乳動(dòng)物中自噬體與液泡/溶酶體的膜融合過程至關(guān)重要[4-6]。

    細(xì)胞自噬廣泛存在于真核生物中,是一種自我消化、進(jìn)化保守的過程,依賴于溶酶體降解途徑[7]。自噬的過程需要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段:自噬的誘導(dǎo);自噬前體的形成;自噬前體的延伸及閉合;自噬體的成熟;自噬體與溶酶體的融合及內(nèi)容物的降解[8]。其中自噬體與溶酶體的融合是自噬的關(guān)鍵過程,需要多種蛋白的參與。已知SNAREs屬于膜錨定蛋白,主要作用是介導(dǎo)囊泡與靶膜的融合[9]。在融合過程中,定位于兩個(gè)待融合膜上不同形式的SNARE蛋白會形成復(fù)合體,這一復(fù)合體之間的螺旋結(jié)構(gòu)相互纏繞,從而使膜拉近并融合。研究表明 STX17 (定位于自噬體上) 通過與SNAP29形成二元復(fù)合物,再與VAMP8 (定位于溶酶體上) 相互作用形成STX17- SNAP29-VAMP8三元復(fù)合物從而介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合[10]。形成SNARE復(fù)合物對膜融合過程至關(guān)重要,但它們的自發(fā)組裝效率很低,由SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合過程均需要一些聚集因子的調(diào)節(jié)。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明,HOPS復(fù)合體通過與自噬性SNARE蛋白STX17相互作用來促進(jìn)SNARE復(fù)合物的組裝,加速由SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合過程[11-12]。但是,HOPS復(fù)合體亞基與自噬SNARE蛋白STX17是直接發(fā)生相互作用還是由其他蛋白進(jìn)行介導(dǎo)的,這一問題目前尚未可知。

    鑒于HOPS復(fù)合體在細(xì)胞自噬膜融合過程中的重要作用,本研究擬純化得到VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種組成人HOPS復(fù)合體的重組蛋白,利用GST pull-down技術(shù),在體外鑒定HOPS復(fù)合體與STX17蛋白是否存在直接相互作用,為尋找HOPS復(fù)合體的互作蛋白和進(jìn)一步探究其在自噬體與溶酶體融合過程中的功能及作用機(jī)制奠定材料基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    pGEX 4T-1-GST原核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;pET-28a(+)改造的pET-His-NusA原核表達(dá)質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院萬群實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);pcDNA3.1-HA-等6種重組質(zhì)粒由浙江大學(xué)孫啟明實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)公司;PCR試劑盒、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;Trelief SoSoo Cloning Kit購自南京擎科生物技術(shù)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ、HⅠ、d Ⅲ和Ⅰ購自NEB公司;膠回收試劑盒、DNA marker購自Genstar公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司;TAE、氨芐青霉素 (Ampicillin)、卡那青霉素 (Kanamycin)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 和考馬斯快速染色液均購自北京索萊寶科技有限公司;引物合成及DNA序列測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;Glutathione Sepharose 4B購自美國GE公司;Ni Focurose 6FF購自武漢匯研生物科技股份有限公司;鼠單克隆抗Flag抗體購自Sigma公司;鼠單克隆抗HA抗體、鼠單克隆抗VPS11、VPS18、VPS39、VPS41抗體均購自Santa Cruz公司;兔單克隆抗VPS33抗體購自Genetex公司;兔單克隆抗VPS16抗體購自Proteintech公司;兔單克隆抗STX17抗體購自Sigma公司;HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購自SBA公司;化學(xué)發(fā)光試劑購自Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

    所用引物見表1。

    1.2.2 組成人HOPS復(fù)合體6種基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

    以pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-(已有質(zhì)粒) 為模板,利用PrimerSTAR 酶擴(kuò)增目的片段,條件如下:98 ℃變性10 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后,膠回收目的片段。

    1.2.3 6種重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    37 ℃酶切過夜條件下,HⅠ和d Ⅲ雙酶切pET-His-NusA質(zhì)粒,RⅠ和Ⅰ、HⅠ和Ⅰ分別雙酶切pGEX 4T-1-GST質(zhì)粒,回收線性化載體。1) 無縫連接方式:Trelief SoSoo Cloning Kit連接線性化載體與目的片段,轉(zhuǎn)化.DH5α,37 ℃培養(yǎng)過夜。2) T4連接方式:雙酶切PCR產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶將帶有粘性末端的目的片段與載體連接,轉(zhuǎn)化.DH5α,37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆,進(jìn)行菌落PCR,瓊脂糖凝膠電泳初步檢測,選擇條帶位置正確的菌液進(jìn)行測序鑒定。測序無誤后,進(jìn)行質(zhì)粒小提。

    1.2.4 重組蛋白的分離純化

    將測序正確的6種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3),挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。1) 鎳柱親和層析:37 ℃培養(yǎng)至6000.9–1.2,加入IPTG (終濃度為0.2 mmol/L),22 ℃誘導(dǎo)16 h,4 ℃離心棄上清收集菌體,用.裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,1.4 mmol/L β-巰基乙醇,0.05% Tween 20,0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑) 重懸,靜置 30 min后超聲破碎,12 000 r/min、4 ℃離心取上清。2倍柱體積的平衡液 (20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,5%甘油) 清洗鎳柱,隨后加入菌體上清,4 ℃旋轉(zhuǎn)2 h,棄流出液,加入2倍柱體積的清洗液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,5%甘油) 清洗,加入洗脫液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑,5%甘油) 洗脫,得到蛋白液①加入TEV酶切掉標(biāo)簽,二次過柱時(shí)標(biāo)簽蛋白與鎳柱結(jié)合,收集蛋白液②即得最終純化好的重組蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測。2) 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析:37 ℃培養(yǎng)至6000.4–0.6,加入IPTG (終濃度為0.2 mmol/L),28 ℃誘導(dǎo)5 h,4 ℃離心棄上清收集菌體,用.裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl,0.1% β-巰基乙醇,1% Triton X-100,0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑) 重懸,靜置30 min后超聲破碎,12 000 r/min、4 ℃離心取上清,并加入適量Glutathione Sepharose 4B (玻璃珠),4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日先清洗玻璃珠,再加入適量.裂解緩沖液和TEV酶,旋轉(zhuǎn)2 h,離心收集上清即得最終純化好的重組蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測。

    表1 試驗(yàn)所用引物

    Note: underlined sequences are restriction enzyme sites.

    1.2.5GST pull-down驗(yàn)證HOPS組分蛋白與STX17的相互作用

    將pGEX 4T-1-TEV-Flag-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)離心得到菌體,用.裂解緩沖液重懸,靜置30 min后超聲破碎,12 000 r/min、4 ℃離心取上清,加入相應(yīng)Glutathione Sepharose 4B (對照組1為純玻璃珠,不加Flag-STX17蛋白上清),4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日清洗玻璃珠,在實(shí)驗(yàn)組與對照組1中加入已純化好的HOPS蛋白,對照組2中加入等量緩沖液,旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h,離心棄上清并清洗玻璃珠,再加入適量.裂解緩沖液和TEV酶,4 ℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)2 h,最后收集上清并制備樣品,采用Western blotting方法檢測HOPS組分蛋白與STX17之間的相互作用。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的片段的克隆及鑒定

    以6種已有質(zhì)粒為模板,利用設(shè)計(jì)的6對引物擴(kuò)增得到目的片段,其中全長2 826 bp,全長2 922 bp,全長2 628 bp,全長2 520 bp,全長1 791 bp,全長2 565 bp,經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定獲得與預(yù)期片段一致的6種PCR產(chǎn)物 (圖1和圖2)。

    圖1 VPS18、VPS39和VPS11基因的PCR擴(kuò)增

    圖2 VPS16、VPS41和VPS33基因的PCR擴(kuò)增

    2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    用HⅠ和d Ⅲ雙酶切pET-His-NusA質(zhì)粒 (圖3),用RⅠ和Ⅰ或HⅠ和Ⅰ分別雙酶切pGEX 4T-1-GST質(zhì)粒 (圖4),37 ℃酶切過夜后得到3種線性化載體。將載體與目的片段分別連接并轉(zhuǎn)化。次日,挑取單克隆,進(jìn)行菌落PCR,用瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定 (圖5和圖6)。菌落PCR驗(yàn)證正確的菌液送測,正反向測序結(jié)果與基因序列一致,說明6種組成HOPS復(fù)合體的原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.3 重組蛋白的純化

    經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting方法檢測得出以下結(jié)果:利用鎳柱親和層析方式成功純化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重組蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重組蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重組蛋白 (圖7);利用谷胱甘肽親和層析方式成功純化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重組蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重組蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重組蛋白 (圖8)。

    圖3 pET-His-NusA載體圖譜

    圖4 pGEX 4T-1-GST載體圖譜

    圖5 pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、VPS39、VPS18重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定結(jié)果

    圖6 pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、VPS41、VPS33重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定結(jié)果

    2.4 HOPS蛋白與Flag-STX17蛋白的體外相互作用

    以Flag-STX17為誘餌蛋白,首先將其與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合,然后分別加入純化好的6種重組蛋白,待HOPS組分蛋白與Flag-STX17蛋白充分結(jié)合后,用TEV蛋白酶進(jìn)行洗脫。若兩種蛋白沒有直接相互作用,添加的蛋白被清洗掉,則上清中無此添加蛋白,用特異性抗體將檢測不出相應(yīng)條帶。結(jié)果如圖9所示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組在分子量為105、97、108、70、97、98 kDa左右分別檢測出HA-VPS11、Flag-VPS16、HA-VPS18、Flag-VPS33、HA-VPS39、Flag-VPS41蛋白的特異性條帶,并且同一位置對照組1和2均無非特異性條帶,以上結(jié)果一方面說明制備的重組蛋白均具有生物學(xué)功能,另一方面說明組成HOPS復(fù)合體的6種重組蛋白與STX17蛋白在體外均發(fā)生直接相互作用,不存在第三者在中間作為“橋梁”形成間接相互作用。

    圖7 HA-VPS11、HA-VPS18、HA-VPS39重組蛋白的SDS-PAGE (A) 與Western blotting (B) 法分析

    圖8 Flag-VPS16、Flag-VPS33、Flag-VPS41重組蛋白的SDS-PAGE (A) 與Western blotting (B) 法分析

    圖9 組成HOPS復(fù)合體的6種重組蛋白與Flag-STX17相互作用的體外GST pull down結(jié)果

    3 討論

    當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)下自噬體會吞噬長壽命蛋白,將其遞送至溶酶體進(jìn)行降解,從而回收降解所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)用來供能,使細(xì)胞在應(yīng)激條件下循環(huán)產(chǎn)生能量來繼續(xù)存活[13]。自噬還可以降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損害的細(xì)胞器,消除細(xì)胞內(nèi)的病原體以此維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14]。研究者們已經(jīng)在細(xì)胞和分子生物學(xué)水平上證實(shí)了自噬可以改善因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、微生物感染和蛋白質(zhì)聚集體積累引起的疾病[15]。目前對于細(xì)胞自噬與疾病的研究已包括衰老、病原體感染、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[16-17]。對自噬研究的深入將會對這些疾病的治療提供新的方法,而對與自噬相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的解析可能會對未來疾病的治療提供潛在藥物靶標(biāo)[18]。

    如今,自噬體的形成機(jī)制已得到廣泛研究,而自噬體與溶酶體融合的分子機(jī)制尚不明朗。已知自噬體與溶酶體的融合經(jīng)歷了聯(lián)結(jié)、錨定、膜融合3個(gè)步驟,SNAREs在這一過程中發(fā)揮了重要作用。2012年Itakura等[19]首先確定了自噬體與溶酶體膜融合需要自噬性SNARE蛋白STX17的參與,STX17-SNAP29-VAMP8三元復(fù)合物的形成能介導(dǎo)這一膜融合過程[20]。但自噬體與溶酶體之間一些聚集因子的作用尚不清楚,因此還有許多蛋白的功能需要進(jìn)行驗(yàn)證。2014年Jiang等[11]利用免疫共沉淀 (Co-IP) 和質(zhì)譜分析 (MS) 兩種方法確定了與STX17相互作用的兩種蛋白VPS33及VPS16,當(dāng)利用siRNA干擾、或基因的表達(dá)會阻斷自噬流過程,造成STX17和LC3蛋白的積累。在293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染帶Flag標(biāo)簽的STX17和GFP標(biāo)簽的HOPS復(fù)合體亞基,結(jié)果表明所有的HOPS組分蛋白在體內(nèi)都與STX17有相互作用,但是兩者在體外的相互作用還未得到驗(yàn)證。因?yàn)镃o-IP結(jié)果只能證明兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用,這種作用可能是直接相互作用,也可能是第三者在中間作為“橋梁”,形成復(fù)合物后的間接相互作用;而GST pull-down是一種常用的探究蛋白質(zhì)體外相互作用的技術(shù),該方法能在體外鑒定兩種蛋白質(zhì)是否發(fā)生直接的相互作用從而消除其他蛋白質(zhì)的影響。因此本試驗(yàn)純化出6種構(gòu)成人HOPS復(fù)合體的重組蛋白,采用GST pull-down技術(shù)證實(shí)HOPS復(fù)合體與STX17蛋白在體外具有直接相互作用,為在體外揭示HOPS復(fù)合體在自噬體與溶酶體膜融合過程中的作用機(jī)制提供切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)途徑,并為進(jìn)一步研究HOPS的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-、和這3種重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量很低,即使優(yōu)化培養(yǎng)條件 (誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度),效果也并不明顯,因此選擇pET-His-NusA載體重新構(gòu)建質(zhì)粒。此載體上含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子,為了減慢蛋白質(zhì)的合成速度、降低形成包涵體的概率,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)采用22 ℃誘導(dǎo)過夜的條件,最終在His-NusA促融標(biāo)簽的作用下實(shí)現(xiàn)VPS11、VPS18和VPS39的可溶性表達(dá),成功純化出重組蛋白。本試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒帶有GST和His兩種標(biāo)簽,GST-tag約為26 kDa,其能夠增加重組蛋白的可溶性,提高其穩(wěn)定性并且保留抗原性和生物活性[21-22]。同樣GST-tag也有相應(yīng)的缺點(diǎn),分子量較大可能影響蛋白質(zhì)的功能[23]。His-tag通常是由6–10個(gè)組氨酸殘基組成,約0.84 kDa。His-tag作為蛋白純化的標(biāo)簽不會影響蛋白質(zhì)的可溶性及生物學(xué)功能,免疫原性較低,用這種方式純化的蛋白可以直接注入動(dòng)物體內(nèi)制備抗體,并且能夠與其他親和標(biāo)簽一起組成雙親和標(biāo)簽利于蛋白表達(dá)[24]。NusA是一個(gè)分子量約55 kDa的蛋白標(biāo)簽,由于其自身的可溶性很高,因此作為融合標(biāo)簽與目的蛋白結(jié)合后可以提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性及可溶性[25]。并且有研究表明,NusA還有利于促進(jìn)重組蛋白的正確折疊,提高蛋白的表達(dá)量[26]。由于GST、NusA這兩種融合標(biāo)簽的分子量較大,而本試驗(yàn)純化的6種重組蛋白相對分子質(zhì)量大多超過90 kDa,所以利用TEV蛋白酶去除重組蛋白的GST或NusA融合標(biāo)簽,從而消除親和標(biāo)簽對蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的影響。

    綜上所述,本研究利用pGEX 4T-1-GST和pET-His-NusA載體成功構(gòu)建出組成人HOPS復(fù)合體的6種重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在原核系統(tǒng)中正確表達(dá),并且采用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱兩種親和純化方法獲得VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41 這6種重組蛋白,GST pull-down試驗(yàn)證實(shí)HOPS復(fù)合體與定位在自噬體上的STX17蛋白在體外具有直接的相互作用。前面已介紹到自噬體與溶酶體融合過程中,自噬體上的STX17及SNAP29會首先形成二元復(fù)合體,繼而與溶酶體上的VAMP8形成三元復(fù)合體促進(jìn)膜融合。因此我們猜想HOPS復(fù)合體是否與SNARE蛋白STX17-SNAP29二元復(fù)合體或STX17-SNAP29- VAMP8三元復(fù)合體也存在直接相互作用,從而促進(jìn)這一膜融合過程。后續(xù)將繼續(xù)采用GST pull-down技術(shù)來探究HOPS復(fù)合體與SNARE蛋白不同復(fù)合體的體外相互作用關(guān)系,闡明HOPS復(fù)合體作為融合因子在膜融合過程中的作用機(jī)制。

    [1] Br?cker C, Kuhlee A, Gatsogiannis C, et al. Molecular architecture of the multisubunit homotypic fusion and vacuole protein sorting (HOPS) tethering complex. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(6): 1991–1996.

    [2] Yang T. RILP interacts with HOPs complex via VPS41 subunit to regulate endocytic trafficking[D]. Xiamen: Xiamen University, 2012 (in Chinese). 楊婷. RILP通過與HOPs復(fù)合體VPS41亞基相互作用調(diào)控胞吞途徑[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2012.

    [3] Stroupe C, Collins KM, Fratti RA, et al. Purification of active HOPS complex reveals its affinities for phosphoinositides and the SNARE Vam7p. EMBO J, 2006, 25(8): 1579–1589.

    [4] Hu WQ, Lin ZX, Chen LL, et al. Function of HOPS complex proteins in autophagy process. Chin J Cell Biol, 2011, 33(8): 855–860 (in Chinese). 胡晚秋, 林志祥, 陳麗蓮, 等. HOPS復(fù)合體蛋白在細(xì)胞自噬過程中的功能研究. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(8): 855–860.

    [5] Balderhaar HJK, Ungermann C. CORVET and HOPS tethering complexes-coordinators of endosome and lysosome fusion. J Cell Sci, 2013, 126: 1307–1316.

    [6] Nickerson DP, Brett CL, Merz AJ. Vps-C complexes: gatekeepers of endolysosomal traffic. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(4): 543–551.

    [7] Yang ZF, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy. Nat Cell Biol, 2010, 12(9): 814–822.

    [8] Huang J, Brumell JH. Bacteria-autophagy interplay: a battle for survival. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(2): 101–114.

    [9] Hong WJ. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta, 2005, 1744(2): 120–144.

    [10] Itakura E, Mizushima N. Syntaxin 17: the autophagosomal SNARE. Autophagy, 2013, 9(6): 917–919.

    [11] Jiang PD, Nishimura T, Sakamaki Y, et al. The HOPS complex mediates autophagosome-lysosome fusion through interaction with syntaxin 17. Mol Biol Cell, 2014, 25(8): 1327–1337.

    [12] Cheng XW, Ma XL, Ding XM, et al. Pacer mediates the function of class III PI3K and HOPS complexes in autophagosome maturation by engaging Stx17. Mol Cell, 2017, 65(6): 1029–1043.e5.

    [13] Zhi XY, Feng WZ, Rong YG, et al. Anatomy of autophagy: from the beginning to the end. Cell Mol Life Sci, 2018, 75(5): 815–831.

    [14] Cadwell K. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol, 2016, 16(11): 661–675.

    [15] Mathew R, Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in cancer. Nat Rev Cancer, 2007, 7(12): 961–967.

    [16] Xu CM, Wang ZJ, Wang M, et al. The study on autophagy induced by pseudorabies virus in PK-15 cells(PRV). J Nanjing Agric Univ, 2018, 41(4): 701–707 (in Chinese). 許長萌, 王志建, 王咪, 等. 豬偽狂犬病毒引起PK-15細(xì)胞自噬的研究. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 41(4): 701–707.

    [17] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature, 2008, 451(7182): 1069–1075.

    [18] Huang R, Xu XJ, Liang YC, et al. The expression, purification and characterization of human His-ATG4B protein. Chin J Cell Mol Immunol, 2015, 31(2): 173–176 (in Chinese). 黃蓉, 徐小潔, 梁迎春, 等. 人ATG4B的表達(dá)及蛋白純化和鑒定. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2015, 31(2): 173–176.

    [19] Itakura E, Kishi-Itakura C, Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell, 2012, 151(6): 1256–1269.

    [20] Liu R, Zhi XY, Zhong Q. ATG14 controls SNARE-mediated autophagosome fusion with a lysosome. Autophagy, 2015, 11(5): 847–849.

    [21] McTigue MA, Williams DR, Tainer JA. Crystal structures of a schistosomal drug and vaccine target: glutathione S-transferase fromand its complex with the leading antischistomal drug praziquantel. J Mol Biol, 1995, 246(1): 21–27.

    [22] Sch?fer F, Seip N, Maertens B, et al. Purification of GST-tagged proteins. Methods Enzymol, 2015, 559: 127–139.

    [23] Wissmueller S, Font J, Liew CW, et al. Protein-protein interactions: analysis of a false positive GST pulldown result. Proteins, 2011, 79(8): 2365–2371.

    [24] Zakalskiy AE, Zakalska OM, Rzhepetskyy YA, et al. Overexpression of (His)6-tagged human arginase I inand enzyme purification using metal affinity chromatography. Protein Expres Purif, 2012, 81(1): 63–68.

    [25] Marco VD, Stier G, Blandin S, et al. The solubility and stability of recombinant proteins are increased by their fusion to NusA. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(3): 766–771.

    [26] Nallamsetty S, Waugh DS. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expres Purif, 2006, 45(1): 175–182.

    Prokaryotic expression, protein purification and functional verification of human homotypic fusion and vacuole protein sorting complex subunit

    Yu Chen, Renpeng Guo, Saifei Huang, Dan Song, and Rong Liu

    College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,Jiangsu,China

    Homotypic fusion and vacuole protein sorting(HOPS) is a protein complex consisting of VPS11, VPS16, VPS18, VPS33, VPS39, VPS41 and regulates membrane transportthrough membrane fusion mechanisms. The evidence suggests that HOPS complex as a fusion factor, facilitates autophagosome-lysosome fusion. To determine whether the HOPS complex directly interacts with the autophagic SNARE protein STX17, the coding sequence of the six genes were amplified from the existing plasmids by PCR, and then ligated to the prokaryotic expression vector pGEX 4T-1-GST or pET-His-NusA. After identification through colony PCR and DNA sequencing, 6 recombinant plasmids were constructed and transferred intoBL21 (DE3). The recombinant proteins were purified by glutathione sepharose 4B and nickel column. We used the tobacco etch virus protease to cut off the GST-tag or His-NusA-tag, to obtain HA-VPS11 protein of about 105 kDa, Flag-VPS16 protein of about 97 kDa, HA-VPS18 protein of about 108 kDa, Flag-VPS33 protein of about 70 kDa, HA-VPS39 protein of about97 kDa, and Flag-VPS41 protein of about 98 kDa. The function of the purified proteins was verified byglutathione S-transferases pull-down assay, confirming that autophagic SNARE protein STX17 interacted directly with HOPS components. Our findings provide experimental basis to further study the function and mechanism of HOPS complex in the process of autophagosome-lysosome fusion.

    human HOPS complex, prokaryotic expression, protein purification, autophagy

    陳玉, 郭仁朋, 黃賽飛, 等. 人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 133–142.

    Chen Y, Guo RP, Huang SF, et al. Prokaryotic expression, protein purification and functional verification of human homotypic fusion and vacuole protein sorting complex subunit. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 133–142.

    April 10, 2019;

    May 29, 2019

    Supported by:Natural Science Foundation of Jiangsu Province,China (No. BK20160729), Central Colleges Basic Business (No. KYZ201651),Outstanding Youth Foundationof Jiangsu Province,China (No. BK20170025).

    Rong Liu. Tel: +86-25-8439373; E-mail: liuronglr010@163.com

    10.13345/j.cjb.190133

    江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK20160729),中央高?;緲I(yè)務(wù)費(fèi) (No. KYZ201651),江蘇省杰出青年基金 (No. BK20170025) 資助。

    2019-07-12

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190710.1209.001.html

    (本文責(zé)編 陳宏宇)

    猜你喜歡
    溶酶體復(fù)合體質(zhì)粒
    溶酶體功能及其離子通道研究進(jìn)展
    生物化工(2021年2期)2021-01-19 21:28:13
    溶酶體及其離子通道研究進(jìn)展
    生物化工(2020年1期)2020-02-17 17:17:58
    高中階段有關(guān)溶酶體的深入分析
    讀與寫(2019年35期)2019-11-05 09:40:46
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    淺談溶酶體具有高度穩(wěn)定性的原因
    CoFe2O4/空心微球復(fù)合體的制備與吸波性能
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    3種多糖復(fù)合體外抗腫瘤協(xié)同增效作用
    欧美日本亚洲视频在线播放| 九九热线精品视视频播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一进一出抽搐动态| 一区二区三区免费毛片| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 97超视频在线观看视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲 国产 在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲在线观看片| 黑人欧美特级aaaaaa片| x7x7x7水蜜桃| 亚洲人成电影免费在线| 我要搜黄色片| 精品免费久久久久久久清纯| 免费人成视频x8x8入口观看| 美女高潮的动态| 国产成人a区在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜福利高清视频| 哪里可以看免费的av片| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美日本视频| 国产精品影院久久| 午夜福利免费观看在线| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲第一电影网av| 国产乱人伦免费视频| 国产精品影院久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 嫩草影院入口| 日韩欧美在线二视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 1000部很黄的大片| 长腿黑丝高跟| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一进一出抽搐动态| 18+在线观看网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 宅男免费午夜| 俺也久久电影网| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 桃色一区二区三区在线观看| 欧美+日韩+精品| 日韩欧美 国产精品| 色吧在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 1000部很黄的大片| 九九热线精品视视频播放| 久9热在线精品视频| 午夜久久久久精精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 麻豆成人av在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一夜夜www| aaaaa片日本免费| 99精品在免费线老司机午夜| 全区人妻精品视频| 啦啦啦免费观看视频1| 99国产综合亚洲精品| 女警被强在线播放| 99久久99久久久精品蜜桃| 91久久精品电影网| 90打野战视频偷拍视频| 国产中年淑女户外野战色| 国产探花在线观看一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 成人特级av手机在线观看| 久久九九热精品免费| 欧美3d第一页| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 免费人成在线观看视频色| 一级毛片女人18水好多| 啦啦啦韩国在线观看视频| 中文资源天堂在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 网址你懂的国产日韩在线| 小说图片视频综合网站| 成人国产一区最新在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 级片在线观看| 人人妻人人看人人澡| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 小说图片视频综合网站| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 香蕉av资源在线| 天堂动漫精品| 国产高清有码在线观看视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品无人区乱码1区二区| 高清在线国产一区| 亚洲午夜理论影院| 婷婷亚洲欧美| 亚洲 国产 在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 天堂√8在线中文| 久久香蕉国产精品| 香蕉丝袜av| 男插女下体视频免费在线播放| 国产美女午夜福利| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线播放国产精品三级| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品国产高清国产av| 精品国产亚洲在线| 日韩人妻高清精品专区| 精品久久久久久,| 久久精品国产清高在天天线| 欧美成人性av电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 免费在线观看亚洲国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 高清在线国产一区| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 中文亚洲av片在线观看爽| 丰满人妻一区二区三区视频av | 激情在线观看视频在线高清| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 18美女黄网站色大片免费观看| 天堂影院成人在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美激情在线99| 欧美黄色淫秽网站| 男女那种视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 中文字幕高清在线视频| 日本熟妇午夜| 亚洲成人久久性| 亚洲自拍偷在线| 九九热线精品视视频播放| 日本黄色片子视频| av天堂中文字幕网| 亚洲国产欧美人成| 成人亚洲精品av一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 久久久国产成人精品二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 哪里可以看免费的av片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费av不卡在线播放| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清视频在线观看网站| 中亚洲国语对白在线视频| 国产成人av教育| 欧美中文日本在线观看视频| svipshipincom国产片| 波多野结衣巨乳人妻| 日本成人三级电影网站| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产欧美人成| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜福利在线观看吧| 99热精品在线国产| 国产主播在线观看一区二区| 国产美女午夜福利| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99久久综合精品五月天人人| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品久久久久久久电影 | 久9热在线精品视频| 欧美中文综合在线视频| 91在线观看av| 国产99白浆流出| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精华一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 人人妻人人看人人澡| av在线蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 麻豆国产97在线/欧美| 老鸭窝网址在线观看| 国产综合懂色| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 嫩草影院入口| 99久久精品一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产成人av激情在线播放| 2021天堂中文幕一二区在线观| 91久久精品国产一区二区成人 | 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜免费成人在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲无线在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲国产色片| 色尼玛亚洲综合影院| 成人18禁在线播放| 91麻豆av在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 女警被强在线播放| 亚洲国产色片| 亚洲avbb在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲第一电影网av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 中文字幕久久专区| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美在线黄色| 久久久久久大精品| 在线观看日韩欧美| 国产色爽女视频免费观看| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 两个人看的免费小视频| 欧美bdsm另类| 亚洲人与动物交配视频| 国产午夜福利久久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品av视频在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产色婷婷99| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 三级毛片av免费| 国产乱人伦免费视频| 午夜福利免费观看在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 啦啦啦免费观看视频1| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 91在线精品国自产拍蜜月 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产 | 脱女人内裤的视频| 老汉色∧v一级毛片| 欧美bdsm另类| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲精品色激情综合| tocl精华| 午夜视频国产福利| 亚洲美女黄片视频| 日韩av在线大香蕉| 成人午夜高清在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| svipshipincom国产片| 亚洲电影在线观看av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一进一出抽搐动态| 国产伦在线观看视频一区| 五月伊人婷婷丁香| 日韩av在线大香蕉| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产精品合色在线| 丰满的人妻完整版| 欧美激情在线99| 婷婷丁香在线五月| 无限看片的www在线观看| 日韩免费av在线播放| 少妇的逼好多水| 久9热在线精品视频| 亚洲在线自拍视频| 国产高清激情床上av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 老司机深夜福利视频在线观看| 一区福利在线观看| 在线观看午夜福利视频| 99久国产av精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品国产清高在天天线| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本在线视频免费播放| 欧美日韩精品网址| 亚洲国产精品999在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看日韩欧美| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产精品999在线| 淫秽高清视频在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产高清视频在线观看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 一级毛片女人18水好多| av专区在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av美国av| 超碰av人人做人人爽久久 | 女警被强在线播放| 中文资源天堂在线| 午夜福利在线在线| a级毛片a级免费在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 成年人黄色毛片网站| 手机成人av网站| 有码 亚洲区| 九色国产91popny在线| 热99在线观看视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人av教育| 亚洲国产高清在线一区二区三| 夜夜爽天天搞| 国语自产精品视频在线第100页| 国产黄色小视频在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 观看免费一级毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线播放国产精品三级| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产视频一区二区在线看| а√天堂www在线а√下载| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久国产精品麻豆| 国产精品电影一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品日产1卡2卡| 999久久久精品免费观看国产| 天堂动漫精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人啪精品午夜网站| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品影院久久| 九色成人免费人妻av| 深爱激情五月婷婷| x7x7x7水蜜桃| 中文资源天堂在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一本一本综合久久| 99国产精品一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久久久久久久黄片| 最近最新中文字幕大全电影3| 色综合亚洲欧美另类图片| 内地一区二区视频在线| 亚洲片人在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产一区在线观看成人免费| 日本黄色片子视频| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人性生交大片免费视频hd| 97碰自拍视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩精品青青久久久久久| 国产真实乱freesex| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲五月婷婷丁香| av在线蜜桃| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 九九热线精品视视频播放| 少妇人妻精品综合一区二区 | 网址你懂的国产日韩在线| 丁香欧美五月| 国产三级黄色录像| 麻豆国产av国片精品| www.熟女人妻精品国产| 一本综合久久免费| 日本五十路高清| 国产高清有码在线观看视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91av网一区二区| 午夜精品在线福利| 一个人看视频在线观看www免费 | 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av免费在线观看| 国产成人av激情在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产探花在线观看一区二区| 久久香蕉国产精品| 中文资源天堂在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 色老头精品视频在线观看| 色播亚洲综合网| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品99久久99久久久不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美区成人在线视频| 午夜福利视频1000在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 99热6这里只有精品| 男女午夜视频在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜激情福利司机影院| 国产v大片淫在线免费观看| netflix在线观看网站| 国产精品影院久久| 日本 欧美在线| 在线播放无遮挡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产欧美人成| 在线免费观看不下载黄p国产 | 哪里可以看免费的av片| 国产97色在线日韩免费| 亚洲欧美日韩东京热| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 99久久综合精品五月天人人| 精品人妻偷拍中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲内射少妇av| 日韩欧美国产在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| bbb黄色大片| 亚洲精品亚洲一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| av欧美777| 日韩欧美国产在线观看| 有码 亚洲区| 精品久久久久久久久久久久久| 变态另类丝袜制服| 99久久无色码亚洲精品果冻| 校园春色视频在线观看| 国产一区二区三区视频了| 国产精品三级大全| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产一区二区激情短视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 99久久99久久久精品蜜桃| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久久中文| 欧美一区二区亚洲| 国产精品1区2区在线观看.| 毛片女人毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 性欧美人与动物交配| 久久精品国产自在天天线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线免费观看的www视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 超碰av人人做人人爽久久 | 亚洲性夜色夜夜综合| 99国产精品一区二区三区| 18美女黄网站色大片免费观看| 身体一侧抽搐| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲片人在线观看| 免费观看精品视频网站| 超碰av人人做人人爽久久 | 观看美女的网站| 手机成人av网站| 成年人黄色毛片网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 91麻豆av在线| 亚洲av美国av| 搡老熟女国产l中国老女人| 99久久无色码亚洲精品果冻| 麻豆久久精品国产亚洲av| aaaaa片日本免费| 男女下面进入的视频免费午夜| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 婷婷六月久久综合丁香| svipshipincom国产片| 草草在线视频免费看| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99在线视频只有这里精品首页| 韩国av一区二区三区四区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 熟女人妻精品中文字幕| 手机成人av网站| 成年女人永久免费观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 午夜a级毛片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 欧美乱妇无乱码| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 久久香蕉精品热| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级黄色大片毛片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 九色国产91popny在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲色图av天堂| 久久午夜亚洲精品久久| 国产男靠女视频免费网站| 99久久成人亚洲精品观看| 丰满乱子伦码专区| 又黄又爽又免费观看的视频| 久9热在线精品视频| 91av网一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲色图av天堂| 亚洲人成电影免费在线| av欧美777| 窝窝影院91人妻| 女人十人毛片免费观看3o分钟| av在线蜜桃| 99久国产av精品| 免费高清视频大片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本免费a在线| 亚洲精品在线美女| e午夜精品久久久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久视频播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 淫秽高清视频在线观看| 国产老妇女一区| 国产日本99.免费观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲中文日韩欧美视频| 一区二区三区免费毛片| 午夜免费成人在线视频| 久久人妻av系列| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲真实伦在线观看| 国产精品永久免费网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美区成人在线视频| 国产97色在线日韩免费| 深夜精品福利| 国内精品一区二区在线观看| 久9热在线精品视频| 在线观看一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产在视频线在精品| 天天添夜夜摸| 国产午夜福利久久久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 极品教师在线免费播放| 亚洲精品在线美女| 色综合欧美亚洲国产小说| 十八禁网站免费在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精品成人久久久久久| 99久久成人亚洲精品观看| 天堂√8在线中文| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲欧美日韩高清专用| 国内揄拍国产精品人妻在线| 18+在线观看网站| 禁无遮挡网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 丁香六月欧美| 久久久久国内视频| 亚洲国产精品999在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 国产野战对白在线观看| 中文字幕久久专区| 嫩草影院入口| 日本与韩国留学比较| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲黑人精品在线| 久久精品人妻少妇| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 超碰av人人做人人爽久久 | 性色avwww在线观看| 国产成人系列免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 嫩草影院入口| 精品久久久久久,| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久九九精品二区国产| 精品人妻一区二区三区麻豆 |