不同產(chǎn)地柴胡商品藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究*

于 丹，吳軍凱，謝海龍，都曉偉

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.北柴胡）、狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.南柴胡）的干燥根，性微寒，味苦，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣的作用[1]。據(jù)現(xiàn)代研究報(bào)道，柴胡含有多種化學(xué)成分，包括皂苷、揮發(fā)油、植物甾醇、香豆素和脂肪酸等[2]，其中柴胡皂苷為柴胡的主要活性成分，也是目前評(píng)價(jià)柴胡質(zhì)量的主要指標(biāo)成分。

柴胡為常用中藥材，臨床需求量大極大，除藥典規(guī)定的柴胡品種外，尚有多種來源于柴胡屬植物的混淆品種在市場(chǎng)銷售[3]。同時(shí)，現(xiàn)今市場(chǎng)上流通的正品柴胡藥材也大多為栽培品種，由于品種、產(chǎn)地和栽培方式的差異，柴胡藥材質(zhì)量參差不齊[4-6]。因此，對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，明確柴胡藥材的質(zhì)量現(xiàn)狀，對(duì)保障人民的用藥安全具有重要意義。

1 儀器與材料

島津LC-2010A高效液相色譜儀；CLASS-VP色譜工作站；茂福爐（沈陽(yáng)市電爐廠）。

乙腈（色譜級(jí),美國(guó)天地試劑公司）；水為重蒸水；硅膠（青島海洋化工廠）；其余試劑為分析純。

柴胡皂苷a、d（供含量測(cè)定用，批號(hào)為110777-201901,110778-201901）和柴胡對(duì)照藥材（批號(hào)為120992-201509）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。收集柴胡樣品24份，主要購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)、河北安國(guó)藥材市場(chǎng)和黑龍江哈爾濱三棵樹藥材市場(chǎng)，其中5份樣品為飲片，其余均為個(gè)子貨，其具體來源見表1。

表1 24份柴胡商品藥材來源Tab.1 Source of 24 samples of Bupleuri radix

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

參照2015版《中國(guó)藥典》柴胡項(xiàng)下的薄層鑒別方法，對(duì)24份柴胡樣品進(jìn)行鑒定。結(jié)果見圖1。24份柴胡樣品均在與柴胡皂苷a、d相同的Rf值處出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。但與柴胡標(biāo)準(zhǔn)藥材比較，3、6、11、12、13、17、18、20、21、22、24 號(hào)樣品的 TLC 譜圖與其一致；其余柴胡樣品TLC譜圖與標(biāo)準(zhǔn)藥材TLC譜圖存在差異。

圖1 24份柴胡樣品的TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of 24 samples of Bupleuri radix

2.2 總灰分

參照《中國(guó)藥典》2015版灰分測(cè)定法（通則2302），測(cè)定24份柴胡樣品總灰分。具體結(jié)果見表2。

表2 24份柴胡樣品總灰分、浸出物和柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Total ash,extract content and saikoside content of 24 samples of Bupleuri radix（n=3）

表 2 結(jié)果表明，除 7、10、14、18、20、23 樣品外，其余樣品的總灰分均小于8%，符合藥典要求。

2.3 浸出物

參照《中國(guó)藥典》2015版醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法（通則 2201），測(cè)定24份柴胡樣品醇溶性浸出物。13、14、15、16、18、19、20、21、23、24 樣品的浸出物含量不符合藥典要求，其余樣品的浸出物含量大于11%，符合藥典要求，具體結(jié)果見表2。

2.4 柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（35～65）-水（65～35）梯度洗脫；流速 1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定對(duì)照品柴胡皂苷a、d適量，加甲醇制成a、d分別為0.082mg·mL-1和0.088mg·mL-1的對(duì)照品混和溶液。

2.4.3 樣品溶液的制備[7]精密稱取過60目篩的柴胡粉末約0.5g，用5%NH3·H2O-甲醇溶液25mL浸泡30min，超聲提取30min，重復(fù)2次，合并濾液，蒸干，殘?jiān)运柡驼〈?5mL分次轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加氨試液振搖提取4次，每次5mL，棄去氨液，正丁醇液用正丁醇飽和水洗滌2次，每次5mL，棄去水液，取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過（0.45μm），取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精確量取對(duì)照品混和溶液2、5、10、15、20、25、35、45μL分別注入 HPLC 色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo),各單體皂苷量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。柴胡皂苷a的線性回歸方程為：Y=274046X+3767.4，r=0.9999，在 0.164～3.69μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好；柴胡皂苷d的線性回歸方程為：Y=272436X-1870.3，r=0.9995，在 0.176～3.96μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 方法學(xué)考察

2.4.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精確吸取對(duì)照品混和溶液20mL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定柴胡皂苷a和d峰面積，兩種成分峰面積的RSD均小于2%，結(jié)果表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.4.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取柴胡樣品粉末約0.5g，平行操作制備5份樣品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定柴胡皂苷a和d的含量，兩種成分的RSD均小于3%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性較好。

2.4.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取3份柴胡樣品粉末各約0.5g，制備5份樣品溶液，每隔2h進(jìn)樣一次，測(cè)定樣品溶液中柴胡皂苷a和d在12h內(nèi)峰面積的變化，結(jié)果兩種成分的RSD均小于2%。表明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的柴胡樣品粉末，共5份，分別加入一定量的柴胡皂苷a和d標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣10μL，測(cè)定柴胡皂苷a和d的含量，結(jié)果平均加樣回收率分別為99.26%和100.78%，RSD為0.97%和1.84%。

2.4.6 樣品測(cè)定 按照樣品溶液的制備方法分別制得不同樣品溶液，吸取每種樣品溶液10μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定結(jié)果見表2，色譜圖見圖2、3。

圖2 柴胡皂苷對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of saikoside standard

圖3 柴胡藥材樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of samples

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24份柴胡樣品皂苷含量差距較大，柴胡皂苷a和柴胡皂苷b總含量在痕跡量～14.86mg·g-1之間。其中，1、3、5、6、11、12、13、17、18、19、20、22、23 號(hào)樣品達(dá)到藥典要求，19 號(hào)（河北3）樣品皂苷含量最高，14號(hào)（黑龍江泰康3）、15號(hào)（黑龍江泰康4）和16號(hào)（內(nèi)蒙古1）樣品幾乎未檢測(cè)到柴胡皂苷。

2.5 聚類分析

以柴胡皂苷a和d含量為指標(biāo)，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行聚類分析（圖4）。

聚類分析結(jié)果表明，24份柴胡樣品質(zhì)量參差不齊，依據(jù)柴胡皂苷含量可分為3大類。其中11、22、19、6 號(hào)樣品皂苷含量較高，為 9.93～14.86mg·g-1，聚為一類；17、23、5、13、1、12、20、3、18 號(hào)樣品皂苷含量均大于4.08mg·g-1，符合藥典要求，聚為一類；其余樣品皂苷含量未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，聚為一類。

本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的24份柴胡樣品收集于安徽、陜西、甘肅、山西、河北、內(nèi)蒙古、山東、河南、云南、吉林和黑龍江11個(gè)省份，其中安徽、甘肅、河北和黑龍江省份的樣品數(shù)量大于3份。對(duì)此4個(gè)省份的聚類結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地為甘肅省的7、8和9號(hào)北柴胡樣品聚在一類中；產(chǎn)于華東地區(qū)（安徽和山東）的1、3和5號(hào)北柴胡樣品聚在一類中；產(chǎn)地為黑龍江省的11、12、13和23號(hào)南柴胡樣品皂苷含量均符合藥典要求，但14、15和21號(hào)樣品皂苷含量較低；產(chǎn)自于河北省的3份藥材分布在3大類中。可見，柴胡藥材質(zhì)量與其分布區(qū)域具有一定的相關(guān)性，但尚與其它因素相關(guān)。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram

3 討論

《中國(guó)藥典》收載的柴胡藥材基原品種為柴胡和狹葉柴胡，按性狀不同，分別習(xí)稱為北柴胡和南柴胡。目前普遍認(rèn)為在柴胡的兩個(gè)基原品種中，北柴胡皂苷類成分含量較高，南柴胡揮發(fā)油類成分含量較高。本實(shí)驗(yàn)收集的24份柴胡藥材14份為北柴胡，10份為南柴胡，但從24份柴胡樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果可見北柴胡的柴胡皂苷含量相對(duì)較高，但并未絕對(duì)優(yōu)于南柴胡，11、22號(hào)南柴胡樣品皂苷總含量分別為13.32和13.27mg·g-1，在24份柴胡樣品中位于第2、3位。

柴胡藥材在我國(guó)分布廣泛，華東、華北、西北和東北地區(qū)均有產(chǎn)出。本實(shí)驗(yàn)收集的24份柴胡樣品，產(chǎn)地分布于安徽、陜西、甘肅、山西、河北、內(nèi)蒙古、山東、河南、云南、吉林和黑龍江11個(gè)省份。各產(chǎn)地柴胡藥材質(zhì)量相差較大，與其分布區(qū)域具有一定的相關(guān)性[8]，但尚因有些產(chǎn)區(qū)藥材樣品間皂苷含量差異較大，有些產(chǎn)地由于樣品數(shù)量較少未能進(jìn)行分析，故下一步仍需選取大量樣本進(jìn)行深入研究。

柴胡為臨床極常用藥物，目前，柴胡藥材存在的質(zhì)量差異問題，對(duì)藥物的臨床療效產(chǎn)生極為重要的影響。除品種和產(chǎn)地影響之外，采收時(shí)間、加工方法和貯藏方法等因素均與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)同一產(chǎn)地柴胡藥材質(zhì)量也存在差異。因此，若想解決此問題，仍需從柴胡種質(zhì)、環(huán)境因子、采收加工方法等多方面深入挖掘影響柴胡藥材質(zhì)量的因素，為獲取質(zhì)量?jī)?yōu)良、穩(wěn)定的柴胡藥材提供策略和方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過薄層色譜鑒別、總灰分、醇溶性浸出物和柴胡皂苷含量測(cè)定對(duì)收集于安徽亳州藥材市場(chǎng)、河北安國(guó)藥材市場(chǎng)和黑龍江哈爾濱三棵樹藥材市場(chǎng)的24份柴胡商品藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)目前市售柴胡商品藥材質(zhì)量參差不齊。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上反映了目前市場(chǎng)銷售柴胡藥材質(zhì)量的現(xiàn)狀，提示為了確保柴胡藥物臨床使用療效，應(yīng)從多渠道、多途徑、多角度入手，保障和提高柴胡藥材質(zhì)量。