補(bǔ)腎益智顆粒中8種黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定*

薛 傲，孫慧峰，徐 姣，姚 遠(yuǎn)，張 寧

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）[1]是老年癡呆癥的主要表現(xiàn)形式，是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙和行為障礙。目前，大多數(shù)治療AD藥物為美金剛、非甾體類(lèi)抗炎藥物、乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑等，但是這些藥物療效有限，且具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，補(bǔ)腎生髓充腦是中藥治療AD的重要方法[2,3]。骨碎補(bǔ)是傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥，研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮中柚皮苷、新北美圣草苷、木犀草素等成分對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有明顯的藥理保護(hù)作用[4]；顧婷從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上探討了骨碎補(bǔ)總黃酮提取物對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用及作用機(jī)制，結(jié)果顯示骨碎補(bǔ)總黃酮能夠明顯改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[5-9]。大量動(dòng)物、細(xì)胞等藥效藥理實(shí)驗(yàn)表明骨碎補(bǔ)總黃酮成分具有良好的抗AD作用。故本實(shí)驗(yàn)室以骨碎補(bǔ)總黃酮為有效成分開(kāi)發(fā)的治療AD創(chuàng)新藥物補(bǔ)腎益智顆粒。其中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚為骨碎補(bǔ)總黃酮中主要有效成分且藥理作用良好。因此，選擇新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等8種黃酮類(lèi)成分為補(bǔ)腎益智顆粒質(zhì)控指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。

目前，黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定的主要方法有紫外分光光度法、HPLC-UV、UPLC等[10]，超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-TQD-MS）聯(lián)用儀具有分析速度快，分離度高，靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中草藥復(fù)雜組分的分析及含量測(cè)定[11,12]。故本文采用UPLC-TQD-MS法測(cè)定補(bǔ)腎益智顆粒中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等8種黃酮類(lèi)成分含量，該方法簡(jiǎn)便快捷，為該類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量控制及其后續(xù)臨床給藥研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)；WatersRMicromassRQuattro PremierTMXE三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Corp.,Milford，MA，USA）；電子天平（瑞士，METTLER TOLEDO）；KQ-250DB型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純 美國(guó)Fisher公司）；醋酸、甲醇試劑等為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；水（娃哈哈純凈水杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；補(bǔ)腎益智顆粒（實(shí)驗(yàn)室研發(fā)自制中試階段）；對(duì)照品木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（FB-02004）購(gòu)自上海永恒生物科技有限公司；對(duì)照品紫云英苷（MUST-14120515）、木犀草素（MUST-15021005）、柚皮素（MUST-15050416）和山奈酚（MUST-14110508）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；對(duì)照品柚皮苷（L750N46）（北京百靈威科技有限公司）；新北美圣草苷（13214-32-2）（上海田源生物技術(shù)有限公司）；對(duì)照品圣草酚（HE126422198）（寶雞市辰光科技有限公司）；以上對(duì)照品含量≥98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm）；流動(dòng)相 1%醋酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～3min，30%B；3～4.5min，30%～40%B；4.5～6min，40%～70%B；6～7min，70%～90%B），流速 0.25mL·min-1，進(jìn)樣量5μL，柱溫35℃。質(zhì)譜條件：正離子檢測(cè)模式，采用電噴霧電離源（ESI），掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM），各化合物的質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。干燥氣流速10L·min-1，干燥氣溫度300℃，霧化氣壓力45psi（1psi=6.895kPa），毛細(xì)管電壓4kV。

表1 8種黃酮類(lèi)成分的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式信息Tab.1 Multi-response monitoring model information of eight flavonoid components

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取適量新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制成濃度為 1，0.2，0.2，1，0.2，0.2，0.6，0.2mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取補(bǔ)腎益智顆粒樣品，研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.05g，置于燒瓶中，精密加入25mL甲醇，超聲處理30min，放冷后稱(chēng)定質(zhì)量，并用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻后過(guò)濾，取適量濾液過(guò)0.22μm濾膜，即得。

2.4 線性范圍

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液分別稀釋至原濃度的 1，10，100，1000，10000，100000 倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的回歸方程及線性范圍。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各被測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Standard curve equations，linear ranges and correlation coefficients for each measured component

2.5 精密度考察

取補(bǔ)腎益智顆粒適量，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的峰面積，其RSD（n=6）分別為 2.06%、1.42%、1.61%、0.68%、1.95%、1.43%、2.72%、1.62%，符合要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取補(bǔ)腎益智顆粒約5mg，6份，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。6份供試品溶液中中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.68%、1.84%、1.62%、1.43%、1.32%、0.82%、1.26%、2.08%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品約50mg，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，5，10，16，24h，吸取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的峰面積RSD（n=6）分別為1.36%、1.72%、2.08%、1.83%、2.47%、1.58%、2.56%、2.43%符合要求，表明供試品溶液在室溫狀態(tài)下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品約50mg，6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在上述色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率，平均加樣回收率分別為100.08%（RSD=1.17%）、100.81%（RS D=2.87%）、103.69%（RSD=1.75%）、100.58%（RSD=0.92%）、100.37%（RSD=2.66%）、93.18%（RSD=1.87%）、98.75%（RSD=1.07%）、93.40%（RSD=2.46%），結(jié)果表明回收率較穩(wěn)定且較高，符合本試驗(yàn)要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.9 含量測(cè)定

取不同批次補(bǔ)腎益智顆粒，按“2.3”項(xiàng)下制備成供試品溶液后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，將色譜峰面積代入回歸方程得到骨碎補(bǔ)中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同批次補(bǔ)腎益智顆粒中8種成分含量（mg·g-1）Tab.4 Contents of eight components in different batches ofBushenYizhi granules（mg·g-1）

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方式的選擇

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)不同溶劑（水、70%甲醇、甲醇）、提取方式（超聲和回流）及提取時(shí)間（15，30，45min）等幾個(gè)方面進(jìn)行考察，最終確定甲醇是提取骨碎補(bǔ)黃酮類(lèi)成分的最佳溶劑,最佳提取方式為甲醇超聲30min。

3.2 色譜條件的選擇

同時(shí)對(duì)流動(dòng)相（乙腈-水，醋酸-水和乙腈-不同濃度的甲酸水）、柱溫（35，45℃）、流速（0.25，0.35mL·min-1）等方面進(jìn)行了考察，結(jié)果表明流動(dòng)相選擇乙腈-1%醋酸水色譜峰峰型較好，分離效果較好；確定色譜條件為流動(dòng)相1%醋酸水（A）-乙腈（B），流速0.25mL·min-1，柱溫35℃。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

分別對(duì)質(zhì)譜條件下正、負(fù)離子檢測(cè)模式，離子噴霧電壓，離子源溫度，錐孔電壓（DP），碰撞能量（CE）等方面進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)正離子檢測(cè)模式峰強(qiáng)較好，滿足檢測(cè)要求；離子源溫度為300℃；離子噴霧電壓為3.5kv；錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表1。

3.4 含量測(cè)定指標(biāo)及檢測(cè)方法的選擇

以往骨碎補(bǔ)含量測(cè)定研究主要運(yùn)用HPLC測(cè)定新北美圣草苷和柚皮苷兩種黃酮類(lèi)成分或僅以骨碎補(bǔ)中柚皮苷作為含量測(cè)定指標(biāo)[13,14]；《中國(guó)藥典》2015版一部收載的骨碎補(bǔ)含量測(cè)定的成分為柚皮苷。骨碎補(bǔ)總黃酮中主要成分為新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚等8種成分，且藥理活性良好，故選擇其為補(bǔ)腎益智顆粒質(zhì)控指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾嘗試運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定補(bǔ)腎益智顆粒中質(zhì)控指標(biāo)成分含量，但發(fā)現(xiàn)存在成分之間相互干擾嚴(yán)重，分析時(shí)間較長(zhǎng)且分離度較差，不符合含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、有效、快速等原則，故選用UPLC-TQD-MS[15]法補(bǔ)腎益智顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，因其具有高選擇性、高靈敏度，分析速度更快等特點(diǎn)，并且選用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的MRM（多通道離子檢測(cè)）模式下檢測(cè)，可以排除背景干擾。

4 結(jié)論

本研究首次采用UPLC-TQD-MS法MRM模式下測(cè)定補(bǔ)腎益智顆粒中黃酮類(lèi)成分可在7min中內(nèi)同時(shí)檢測(cè)到8種黃酮類(lèi)成分含量，該法簡(jiǎn)單，方便易于操作且具有靈敏度高、重復(fù)性好、分離效果明顯等特點(diǎn)。能夠更全面地控制補(bǔ)腎益智顆粒的質(zhì)量，且方法穩(wěn)定可靠，簡(jiǎn)便易行，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的依據(jù)，同時(shí)可作為骨碎補(bǔ)藥材質(zhì)量控制的進(jìn)一步補(bǔ)充。