MiR497HG靶向miR-588調(diào)控肺癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的機制研究

徐紅艷 楚曉飛 葛茂功 何世陽 楊霞 白衛(wèi)云

肺癌是世界上第二位常見癌癥，死亡率居首位。雖然吸煙等環(huán)境風(fēng)險因素對肺癌的發(fā)展有重要貢獻[1]，但也存在遺傳因素。肺癌的主要類型有小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)[2]，其中NSCLC的兩個主要亞型是肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)， LUAD和LUSC占絕大多數(shù)新報告的肺癌病例，而SCLC僅包括一小部分(約15%)[3]。這些亞型在肺內(nèi)的位置以及起源的細胞類型方面不同[4]，因此可能具有不同的潛在疾病病因。 LUAD是研究最多的肺癌亞型，研究已經(jīng)確定了基因組改變和可行的突變[5-6]。研究顯示，長鏈非編碼RNA (LncRNAs)在肺癌中的異常與癌癥的惡化程度具有密切的相關(guān)性[7]。然而，最近發(fā)現(xiàn)的LncRNA MiR497HG在肺癌中的功能和分子機制仍然未知。本研究擬以肺癌細胞NCI-H1975為研究對象，檢測其中LncRNA MiR497HG、miR-588在其中的表達，觀察抑制MiR497HG、過表達miR-588對NCI-H1975細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，揭示其機制與MiR497HG靶向調(diào)控miR-588有關(guān)，將為肺癌的治療提供新靶點。

資料與方法

一、實驗材料

正常肺上皮細胞BEAS-2B、肺癌細胞NCI-H1975、NCI-H460、A549(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶(美國Sellect公司)；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司)；PVDF膜(德國羅氏診斷有限公司)；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD)；Transwell小室(美國Coming公司)；Annexin V- FITC / PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶)。

二、實驗方法

1 細胞的培養(yǎng) 將正常肺上皮細胞BEAS-2 B、肺癌細胞NCI-H1975、NCI-H460、A549，在37 ℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱的條件下，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)的細胞培養(yǎng)，并進行傳代。

2 細胞的轉(zhuǎn)染與分組 將肺癌細胞NCI-H1975隨機分成blank組(不做任何處理)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-MiR497HG組(轉(zhuǎn)染si-MiR497HG)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-588組(轉(zhuǎn)染anti-miR-588)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-588組(轉(zhuǎn)染miR-588 mimics)、si-MiR497HG+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-MiR497HG和anti-miR-NC)、si-MiR497HG+anti-miR-588組(共轉(zhuǎn)染si-MiR497HG和anti-miR-588)，按LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求操作，轉(zhuǎn)染48 h，用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后用于qRT-PCR實驗、MTT實驗、Transwell實驗、流式細胞術(shù)實驗。

3 qRT-PCR法檢測細胞中MiR497HG、miR-588表達 Trizol法提取細胞中總RNA，用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。按照反應(yīng)體系進行，每個樣品重復(fù)3次，取平均值，反應(yīng)結(jié)束后通過比較Ct值，以U6作為內(nèi)參，計算2-△△Ct的值，測定MiR497HG、miR-588的相對表達水平。

4 MTT法檢測細胞增殖 將各組細胞制成混懸液，調(diào)整密度至104個/mL，然后接種至96孔板，取適量1.2.2各組細胞，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h，丟棄上清，加150 μL 的DMSO，震蕩，溶解結(jié)晶，在OD490 nm波長下檢測細胞吸光值(A)。

5 Transwell小室檢測細胞的遷移侵襲 將 Transwell小室置于孔上，放入細胞培養(yǎng)箱平衡30 min。然后將各組細胞消化，用純RPMI 1640培養(yǎng)基配制成5×105個/mL的細胞懸液。每個小室加入200 μL細胞懸液，即每孔細胞約為1×105個。每組設(shè)置3個復(fù)孔，將24孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，小心移出上室，用棉簽擦去上室膜下表面的遷入細胞，PBS洗2次，甲醇固定30 min。晾干后，用結(jié)晶紫染液(1g/L)染色20 min，再用雙蒸水沖洗。取出晾干，置于倒置顯微鏡下拍照，選取5個不同視野，拍照計數(shù)，取平均值。

將轉(zhuǎn)染成功的對數(shù)期細胞進行Transwell侵襲實驗。將基質(zhì)膠和培養(yǎng)基按1 ∶8稀釋后(60 μL)鋪于培養(yǎng)小室上，風(fēng)干后備用，其他步驟同Transwell體外遷移實驗。

6 Annexin V/ PI雙染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各轉(zhuǎn)染組細胞，用 500 μL 的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μL的 Annexin V- / FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過濾，上流式細胞儀進行檢測。凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞中MiR497HG與miR-588的結(jié)合力 將MiR497HG -WT(含MiR497HG片段)和MiR497HG-MUT(含MiR497HG突變體)的熒光素酶報告載體，采用LipofectamineTM2000與miR-588、miR-NC共轉(zhuǎn)染，24 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)操作手冊要求進行檢測熒光強度，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光活性，以兩者的比值表示MiR497HG與miR-588的結(jié)合能力。

結(jié) 果

一、MiR497HG、miR-588在肺癌中的表達

與BEAS-2B組相比，NCI-H1975組、NCI-H460組、A549組細胞中MiR497HG表達均顯著升高，miR-588表達顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 MiR497HG、miR-588在肺癌細胞中的表達

注：與BEAS-2B組比較，*P<0.05

二、抑制MiR497HG對肺癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響

與si-control組相比，si-MiR497HG組NCI-H1975細胞中MiR497HG表達顯著降低，48、72 h時細胞增殖顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(見表2，圖1)。

圖1 抑制MiR497HG的肺癌細胞凋亡圖

表2 抑制MiR497HG對肺癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響

注：與si-NC組比較，*P<0.05

三、 MiR497HG靶向miR-588

通過生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站(http://mircode.org/)預(yù)測到miR-588與MiR497HG之間存在8個互補的結(jié)合位點(圖2)；雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-588組WT-MiR497HG細胞中熒光活性顯著降低(表3)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-588組細胞中MiR497HG表達顯著升高，與miR-NC組相比，miR-588組細胞中MiR497HG表達顯著降低(表4，P<0.05)。

圖2 miR-588與MiR497HG的靶向結(jié)合位點

表3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表4 miR-588對HMBOX1表達的影響

注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05, 與miR-NC組比較，#P<0.05

四、過表達miR-588對肺癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響

通過MTT實驗、Transwell實驗、流式細胞術(shù)。與miR-NC組相比，miR-588組NCI-H1975細胞miR-588表達顯著升高，48、72 h時細胞增殖顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(見表5，圖3)。

五、抑制miR-588對抑制MiR497HG的肺癌細胞增殖、遷移侵襲抑制及凋亡促進作用的影響

與si-MiR497HG+anti-miR-NC組相比，si-MiR497HG+anti-miR-588組NCI-H1975細胞中MiR497HG表達顯著升高，48、72 h時細胞增殖顯著升高，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(見表6，圖4)。

圖3 過表達miR-588的肺癌細胞凋亡圖

表5 過表達miR-588對肺癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

圖4 抑制miR-588并抑制MiR497HG的肺癌細胞凋亡圖

表6 抑制miR-588對抑制MiR497HG的肺癌細胞增殖、遷移侵襲抑制及凋亡促進作用的影響

注：與si-MiR497HG+anti-miR-NC組比較，*P<0.05

討 論

最近，LncRNA正在成為各種流行癌癥(如肺癌)中腫瘤抑制和致癌功能的重要因素[8-9]。 LncRNAs是長度在200 nt到100 kb，缺乏明顯的開放閱讀框架，因此，它們不能作為蛋白質(zhì)合成的模板[10]。 盡管如此，LncRNA可能是多種類型癌癥中腫瘤發(fā)生的主要原因[11]。 例如，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1)被認(rèn)為通過影響運動相關(guān)基因的表達來增強體外非小細胞肺癌細胞的細胞遷移[12]。Eissa等[13]在膀胱癌的研究中報道，Lnc RNA miR-497-HG具有較高的診斷膀胱癌的準(zhǔn)確度，對膀胱癌的診斷和靶向治療具有巨大的潛力。Ding等[14]在原發(fā)性肺癌的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，MiR497HG的表達異常升高。我們推測MiR497HG在肺癌中可能也會出現(xiàn)異常表達，并對肺癌細胞的細胞表型具有一定的調(diào)控作用。為了驗證這一猜測，本研究運用qRT-PCR法檢測了肺癌細胞中MiR497HG的表達，發(fā)現(xiàn)MiR497HG異常升高，這與其在膀胱癌中的高表達和Ding的實驗結(jié)果相吻合，證實了MiR497HG在肺癌細胞中的異常上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制MiR497HG可抑制肺癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，這些結(jié)果為探索MiR497HG在肺癌中的功能提供更充分的理論依據(jù)；深入研究，通過生物信息學(xué)、雙熒光素酶報告基因檢測實驗和Western blot實驗驗證MiR497HG可靶向負(fù)調(diào)控miR-588，提示MiR497HG在肺癌中的功能可能與調(diào)控miR-588相關(guān)。

miRNA被認(rèn)為是一類非編碼RNA，通過抑制靶基因的3′UTR區(qū)域的mRNA，調(diào)節(jié)基因的表達[15]。研究表明,miRNA在細胞過程中具有至關(guān)重要的作用，包括增殖、凋亡和細胞能動性。miRNAs的失調(diào)已在多種類型的腫瘤中得到證實，包括肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌，調(diào)控腫瘤的發(fā)生[16-18]。在這些miRNA中，miR-588在前列腺癌中高表達，與預(yù)后差相關(guān)[19]，其在胃癌、乳腺癌中均低表達，發(fā)揮抑癌功能[20-21]。Qian等[22]在研究中報道，miR-588在肺鱗癌組織中的表達明顯的低于非腫瘤組織，并與腫瘤的分期、淋巴結(jié)侵襲呈負(fù)相關(guān)，并且其還可靶向顆粒體蛋白前體(GRN)抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，揭示了GRN參與miR-588介導(dǎo)的肺鱗癌進展中的抑制功能。本研究運用qRT-PCR法檢測了肺癌細胞中miR-588的表達發(fā)現(xiàn)，miR-588的表達異常降低，并且過表達miR-588可抑制肺癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，這些實驗結(jié)果與Qian在肺鱗癌中的研究結(jié)果相一致，再次證實miR-588在肺癌中的抑癌功能，為深入探索miR-588在肺癌中的潛在治療價值奠定基礎(chǔ)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-588可逆轉(zhuǎn)MiR497HG對肺癌細胞的增殖、遷移侵襲的抑制和凋亡的促進作用，這說明不僅MiR497HG可靶向調(diào)控肺癌細胞中miR-588的表達，相反，miR-588也可逆向負(fù)調(diào)控MiR497HG的表達和功能。這為MiR497HG、miR-588在肺癌中的功能探索提供更充分的理論參考。在前人研究的基礎(chǔ)上，我們推理發(fā)現(xiàn)MiR497HG/miR-588/GRN信號通路在肺癌的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，由于miR-588在胃癌中還可靶向EIF5A2調(diào)控癌細胞的遷移侵襲[20]，我們猜測miR-588在肺癌中有很大可能也可靶向EIF5A2調(diào)控肺癌的進展。本課題后續(xù)將繼續(xù)探討肺癌中miR-588下游的靶蛋白基因的調(diào)控機制，為肺癌的精準(zhǔn)治療提供更充分的理論支持。

綜上所述，長鏈非編碼RNA MiR497HG可抑制肺癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，其機制與靶向負(fù)調(diào)控miR-588有關(guān)，為肺癌的治療提供新的治療靶標(biāo)。