高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠含量

付 歡 ，龔明峰 ，王 超

（1.湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司，湖北 武漢 430050；2.遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司，湖北 武漢 430050）

鹽酸左氧氟沙星為氧氟沙星的左旋體，屬于經(jīng)典的喹諾酮類(lèi)藥物，對(duì)大腸埃希菌、克雷白菌屬、枸櫞酸桿菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、沙雷菌屬、變形桿菌、支原體及衣原體的感染具有較好治療作用[1,2]，利用其抗菌特性制備的眼用凝膠，不僅可改善相關(guān)滴眼液在眼內(nèi)滯留時(shí)間短和生物利用度小等問(wèn)題，同時(shí)也避免相關(guān)軟膏劑引起的眼表油膩感與視力模糊[3,4]，因而對(duì)其主藥含量檢測(cè)方法的研究意義重大。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用紫外吸收光譜法測(cè)定鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠的主藥含量[5]，但該方法專(zhuān)屬性存在不足，無(wú)法有效避免同波長(zhǎng)下共存物質(zhì)的干擾，而左氧氟沙星目前已被中國(guó)藥典2015版二部、美國(guó)藥典和歐洲藥典收載，均規(guī)定采用高效液相色譜法檢測(cè)[6-8]。因此，本研究利用上述方法原理，建立高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠含量的分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Chromeleon 7.2液相色譜工作站（賽默飛世爾科技有限公司）；萬(wàn)分之一精密分析天平（梅特勒-托利多精密儀器有限公司）；離心機(jī)、pH計(jì)（梅特勒-托利多精密儀器有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

HCl、NH3·H2O、NH4Ac、NaClO4、H3PO4、乙腈均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；左氧氟沙星對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130455-201607，含量97.3%）；左氧氟沙星雜質(zhì)E（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130616-201302，含量100.0%）；環(huán)丙沙星（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130451-201203，含量 100.0%）；鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠（規(guī)格：5g:0.015g，湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司），試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 色譜條件

Acclaim 120 C18色譜柱（250mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（取NH4Ac 4.0g和NaClO47.0g，加水1300mL溶解后，用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至2.2）=15∶85；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：294nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。

1.3 溶液配制

1.3.1 系統(tǒng)適用性溶液 稱(chēng)取左氧氟沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品和雜質(zhì)E對(duì)照品各適量，加0.1mol·L-1HCl溶液溶解并稀釋制成每1mL中約含左氧氟沙星0.1mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各5μg的混合溶液。

1.3.2 對(duì)照溶液 分別稱(chēng)取左氧氟沙星對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加適量甲醇溶解后，加0.1mol·L-1HCl溶液稀釋成每1mL中含左氧氟沙星0.1mg的對(duì)照溶液，平行配制兩份。

1.3.3 供試品溶液 取本品適量，精密稱(chēng)定，加0.1mol·L-1HCl溶液溶解，稀釋制成每1mL中約含左氧氟沙星（按C18H20FN3O4計(jì)）0.1mg溶液后，離心（3000r·min-1）15min，取上清液作為供試品溶液。

1.3.4 空白輔料溶液 按照實(shí)際藥品處方用量，配制不加原料的空白輔料溶液后，照1.3.3所述步驟稀釋、離心后，取上清液，即為空白輔料溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與專(zhuān)屬性

分別取空白、對(duì)照和供試品溶液在“1.2項(xiàng)色譜條件下”進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of system suitability（A）,blank auxiliary material solution（B）, reference substance solution（C）and sample solution（D）

從圖1可知，左氧氟沙星出峰時(shí)間為17.3min，理論塔板數(shù)超過(guò)3000，且左氧氟沙星與雜質(zhì)E峰和與環(huán)丙沙星峰之間的分離度均大于2.0，空白輔料溶液不干擾結(jié)果測(cè)定，因此，該色譜系統(tǒng)的適用性與專(zhuān)屬性均較好。

2.2 穩(wěn)定性

在“1.2 項(xiàng)色譜條件下”，分別于 0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，平行3次，記錄鹽酸左氧氟沙星與羥苯甲酯峰面積，測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試品溶液穩(wěn)定性Tab.1 Stability of sample solution

從表1可見(jiàn)，不同時(shí)間段下，樣品中左氧氟沙含量結(jié)果RSD＜1.0%，表明供試品溶液在配制后24h內(nèi)，鹽酸左氧氟沙星含量均一、穩(wěn)定。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

取左氧氟沙星對(duì)照品適量，加入0.1mol·L-1HCl配制成每1mL約含1mg·mL-1的左氧氟沙星溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液 3、2、5、3、4mL 至 50、25、50、25、25mL 容量瓶?jī)?nèi)，加入0.1mol·L-1HCl稀釋至刻度搖勻，制成左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。照“1.2項(xiàng)色譜條件”，分別進(jìn)樣10μL后，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到左氧氟沙星線(xiàn)性方程為：Y=817.4x+0.61（r=0.9999），表明樣品中左氧氟沙星濃度在60～160μg·mL-1范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4 中間精密度

選擇不同試驗(yàn)人員在不同時(shí)間下，照“1.2項(xiàng)色譜條件”進(jìn)樣，以考察該分析方法在不同試驗(yàn)環(huán)境下的結(jié)果重復(fù)性，具體見(jiàn)表2。

表2 不同試驗(yàn)人員在不同時(shí)間的測(cè)定結(jié)果（n=6）Tab.2 Measuring results of different member in different time（n=6）

從表2結(jié)果可知，不同試驗(yàn)人員在不同試驗(yàn)環(huán)境下對(duì)同一樣品的測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1.0%，表明具有較好的中間精密度，因而有利于該分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

2.5 回收率

精密稱(chēng)取樣品9份，分別各加入3份已知左氧氟沙星含量80%、100%、120%的對(duì)照品，采用0.1mol·L-1鹽酸溶液配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度3份。照“1.2項(xiàng)色譜條件”進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 鹽酸左氧氟沙星回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Recovery of levofloxacin hydrochloride determination（n=3）

從表3可知，加入不同質(zhì)量濃度對(duì)照品的樣品溶液，計(jì)算結(jié)果回收率均在100.0%～102.0%之間，且RSD均低于2.0%，表明該方法測(cè)定結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確度。

2.6 不同分析方法比較

分別采用液相色譜法與紫外分光光度法測(cè)定3種不同批號(hào)樣品的左氧氟沙星含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同方法測(cè)定結(jié)果比較（n=6）Tab.4 Comparison of results bydifferent methods（n=6）

從表4結(jié)果可知，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法較為接近，最大僅相差1.8g·mol-1。在95%的置信度下，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算所得t值均明顯低于置信因子（2.57），表明兩種分析方法結(jié)果間不存在顯著性差異[9]。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠含量，具體色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（取NH4Ac 4.0g和NaClO47.0g，加水 1300mL溶解后，用H3PO4調(diào)節(jié) pH 值至 2.2）=15∶85，流速 1.0mL·min-1，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為294nm。在該條件下，鹽酸左氧氟沙星含量測(cè)定結(jié)果具有較好的精密度與準(zhǔn)確度，同時(shí)該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速，因而可滿(mǎn)足相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測(cè)要求。