鈣激活中性蛋白酶2在口腔鱗狀細胞癌中的表達及對腫瘤細胞生物學行為的影響

鄭博，廖湘凌，丁南，王敬國，龐曉霞

（首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院 口腔科，北京 101100）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是人頭頸部惡性腫瘤中常見的病理類型之一，占世界癌癥死亡率的第6 位[1]。鈣激活中性蛋白酶2（calcium activated neutral protease 2, Calpain-2）是鈣依 賴性半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，廣泛表達在哺乳動物中。研究表明，Calpain-2 高表達與基底樣或三陰性乳腺癌的不良結(jié)果相關(guān)[2]。同時，Calpain-2 高表達 也與卵巢癌患者的鉑耐藥性和較差的總體存活率相關(guān)[3]。有文獻報道，組織中的鈣激活中性蛋白酶對某些腫瘤細胞的遷移能力有明顯影響[4]。本研究檢測OSCC 患者癌組織與癌旁組織中Calpain-2 的表達量，并進行比較，統(tǒng)計分析OSCC 組織Calpain-2 的表達及對5年生存率的影響。同時，利用shRNA 技術(shù)構(gòu)建OSCC 低表達Calpain-2 的細胞系，研究Calpain-2 對OSCC 腫瘤細胞生物學行為的影響。

1 資料與方法

1.1 組織及細胞樣本

選取2011年3月—2014年3月首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院口腔科進行外科手術(shù)并確診為OSCC患者的癌組織74 例，取距離癌組織≥5 cm 的癌旁組織作為對照組。HSC3、HSC6 細胞購自日本生物研究資源細胞庫。OSCC 細胞為貼壁生長，用DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清，放置在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學及評分標準 將OSCC 組織及癌旁組織用4%多聚甲醛固定48 h，按試劑盒說明書操作，以不加一抗為對照，受試樣一抗為Calpain-2 單克隆抗體[美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。免疫染色陽性物質(zhì)均呈棕黃色顆粒，2 人雙盲法觀察切片。染色分值由2個指標衡量：一是陽性細胞率，每例隨機選擇8個高倍鏡視野，取平均值共計800個細胞，按陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例計算陽性表達率：1 分，1%～33%；2 分，34%～67%；3 分，68%～100%。二是染色強度，1 分，弱表達；2 分，中表達；3 分，強表達。染色分值=陽性細胞率×染色強度，分值為0～9 分，＜6 分為低表達，≥6 分為高表達。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 使用RNAiso Reagent（日本TaKaRa 公司）試劑盒提取總RNA，用Oligo primer 和Go Script ? Reverse Transcription System（美國Roche 公司），取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后RT-PCR（Light Cycler 480,美國Roche 公司）用雙鏈DNA 特異SYBR Green I Dye 檢測Calpain-2 的表達。具體反應體系參照試劑盒說明書，總體系20 ml，95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)。Calpain-2 正向引物：5'-GCTGCCGTTTG CTGAGTGTC-3'；反向引物：5'-CGGTCACAGAGTAGG CATGG-3'。長度120 kb。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH）為內(nèi)參，GAPDH 正向引物：5'-AACTTTGGC ATTGTGGAAGG-3'；反向引物：5'-ACACATTGGGGG TAGGAACA-3'。長度310 kb。

1.2.3 Western blotting 用RIPA 裂解液裂解OSCC樣本或細胞系，加入5×上樣緩沖液95℃ 3 min，提取總蛋白，10% SDS-PAGE 電泳，分離蛋白樣本，以抗人Calpain-2（美國Abcam 公司）單克隆抗體4℃孵育過夜。過氧化物酶連接的抗小鼠二抗（CST）常溫孵育2 h 后，以HRP 化學發(fā)光液（美國Mllipore 公司）觀察蛋白表達量。

1.2.4 shRNA 轉(zhuǎn)染 OSCC 細胞系以2×105個/孔接種到6 孔板中。待細胞貼壁后用凝聚銨溶液每孔轉(zhuǎn)染5 mg Calpain 2-shRNA 載體或?qū)φ蛰d體。轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞消化下來重新鋪到15 cm 培養(yǎng)皿中，加入0.5 mg/ml 嘌呤霉素的細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。2 周后，分離出單個克隆并接種到96 孔板中進一步篩選。2個月后可以篩選出具嘌呤霉素抗性的穩(wěn)轉(zhuǎn)系，繼續(xù)在含1 mg/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.5 細胞增殖實驗 Calpain-2 shRNA 轉(zhuǎn)染后的OSCC 細胞系以5×103個/ml 接種到96 孔板中，培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后，用Cell Counting Kit-8（CCK-8，美國Sigma 公司）檢測細胞生長情況。每孔加入10 μl CCK-8 37℃孵育3～4 h 后，用450 nm 處的光密度（OD）值減去減去650 nm 處的背景進行測量染色。

1.2.6 細胞遷移實驗 將細胞重懸在無血清DMEM培養(yǎng)基中，按1.5×105個/孔將用Cell Trace 標記的細胞 鋪在Transwell 小室的上層，下層放置500 ml 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h 后將細胞固定，熒光顯微鏡下400 放大倍數(shù)計數(shù)細胞，計5個視野，取均值。

1.2.7 細胞凋亡實驗 OSCC 細胞轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 48 h 后，用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（美國BD 公司）檢測細胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；生存分析用 Kaplan-Meier 法，采用Log-rankχ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 的表達

Calpain-2 在OSCC 組織中的表達較癌旁組織高（χ2=99.925，P=0.000）。74 例早期OSCC 患者中，57 例（77.03%）Calpain-2表達于細胞質(zhì)，其中，38例為高表達，19 例為低表達；56 例（75.68%）Calpain-2 表達于細胞膜，其中，30 例陰性，26 例陽性；30 例于細胞質(zhì)和細胞膜共同表達。見圖1。

2.2 OSCC 組織及癌旁組織的Calpain-2 mRNA和Calpain-2 蛋白表達

RT-PCR結(jié)果顯示，OSCC組織的Calpain-2 mRNA相對表達水平為（4.81±0.14），癌旁組織為（1.15± 0.08），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=195.259，P= 0.001），OSCC 組織的Calpain-2 mRNA 水平較癌旁組織上調(diào)。Western blotting 顯示OSCC 組織的Calpain-2表達高于癌旁組織。見圖2。

圖1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 表達 （免疫組織化學 ×200）

圖2 OSCC 組織與癌旁組織的Calpain-2 的 表達情況比較

2.3 Calpain-2 表達與總體生存率的關(guān)系

74 例患者5年死亡33 例（44.59%），存活41 例（55.41%）。Calpain-2 在細胞膜中陰性與陽性5年生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表1）。

2.4 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系中Calpain-2 的表達

與對照組比較，Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細胞系中Calpain-2 表達降低（P＜0.05）。見圖3。

表1 Calpain-2 表達與OSCC 患者5年生存率的關(guān)系

2.5 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞的生長情況

轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 后，OSCC 細胞系（HSC3）在100 h 的OD 值為（3.1±1.0），與轉(zhuǎn)染陰性對照細胞 的Control shRNA OD 值（2.8±0.9）比較，差異無統(tǒng)計 學意義（t=1.918，P=0.060）。見圖4。

2.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞 的凋亡情況

以Calpain-2 shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)的OSCC 細胞系（HSC6）凋亡率為（9.83±1.57）%，與對照細胞系的凋亡率 （10.13±0.94）% 及其Annexin V單陽性細胞和Annexin V/PI 雙陽性細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（t= 1.410，P=0.163）。見圖5。

2.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞 的遷移情況

低表達Calpain-2 的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細胞系遷移率（58.1±2.98）%與對照細胞系（15.56±6.07）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖6）。在接種至培養(yǎng)皿48 h 后，遷移的細胞數(shù)量降低63.3%。

圖3 Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細胞系中 Calpain-2 的表達

圖4 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系的生長情況

圖5 Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細胞系的細胞凋亡情況

圖6 以Calpain-2 shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)的OSCC 細胞系細胞的遷移情況

3 討論

近年來，關(guān)于Calpain 介導的蛋白水解與Calpain參與化學性和興奮毒性神經(jīng)元創(chuàng)傷中神經(jīng)元壞死的研究受到極大的關(guān)注[5]。在靜息狀態(tài)下，Calpain-1 和Calpain-2 以異質(zhì)二聚體酶原（80+29）kD 的形式廣泛存在于各種細胞中。當細胞中Ca2+的含量發(fā)生異常馬上可以激活Calpain-2 和Calpain-2 發(fā)生自溶，形成異質(zhì)二聚體的活化形式[6]。在生理狀態(tài)下，Calpain-2的活性受內(nèi)源性的蛋白酶抑制蛋白調(diào)控[7]。在極端的情況下，Calpain-2 會被過度激活，導致細胞內(nèi)Ca2+的含量持續(xù)處于高水平[8]。Calpain 反應底物包括細胞支架蛋白、漿膜-細胞膜相關(guān)蛋白信號轉(zhuǎn)導和鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。當少量Calpain 被活化時，上述底物蛋白被水解后，可能會轉(zhuǎn)導細胞信號或觸發(fā)細胞功能，如膜融合或細胞伸展[9]。

本研究分析多個OSCC 組織中Calpain-2 的含量，OSCC 組織中Calpain-2 表達比癌旁組織要高。Calpain-2 可能參與腫瘤細胞的發(fā)展。Calpain-2 的高表達并不是影響OSCC 患者總體生存率的獨立因素，說明Calpain-2 并非直接影響腫瘤的發(fā)展，而是通過調(diào)控其他因素促進腫瘤的發(fā)生。為進一步研究Calpain-2在腫瘤細胞中的作用，利用Calpain-2 shRNA 構(gòu)建低表達Calpain-2 的OSCC 穩(wěn)轉(zhuǎn)系，發(fā)現(xiàn)Calpain-2 敲低的OSCC 細胞的生長情況與對照組比較無差異，同時凋亡率與對照組也無差異。同時，通過細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)，降低Calpain-2 的表達能抑制細胞的遷移。根據(jù)實驗結(jié)果可以推測，OSCC 癌細胞內(nèi)Ca2+的含量異常，激活Calpain-2 發(fā)生自溶形成活化狀態(tài)與胞內(nèi)底物蛋白發(fā)生反應，從而轉(zhuǎn)導細胞信號或使腫瘤細胞發(fā)生遷移。已有文獻報道Calpain-2 與纖維肉瘤細胞、膠質(zhì)母細胞瘤細胞、胃癌細胞等癌細胞的遷移有關(guān)[10]。本研究表明，Calpain-2 可能也參與到OSCC 癌細胞的遷移過程中，有可能成為抑制OSCC 癌細胞遷移的重要靶點。