孫躍寧,李懷平,羅明英,劉有菊
(1.金訶藏藥股份有限公司 藏藥新藥開發(fā)國家重點實驗室,青海 西寧 810003;2.金訶藏藥(山東)健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 濟南 250101)
手參腎寶膠囊是由手參、黃精、天冬、烈香杜鵑、冬蟲夏草五味藥味組成,具有溫腎補陰,填精補髓的作用,可用于腎陽不足,精血虧虛,遺精陽痿,腰膝酸軟,眩暈乏力。手參腎寶膠囊現(xiàn)行標準[WS-10550(ZD-0550)-2002-2011Z][1]中使用蒽酮-硫酸法測定總多糖含量。多糖提取一般采用熱水提取、乙醇除雜質(zhì),缺少進一步分離純化的步驟,常含影響定量測定的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、單糖、色素、苷等。采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量,單糖類雜質(zhì)直接與蒽酮反應(yīng)使實測值偏高;蛋白質(zhì)、苷類雜質(zhì)在酸性環(huán)境中水解后與蒽酮反應(yīng)使實測值偏高;色素類雜質(zhì)使待測樣品本身帶有顏色從而影響測定結(jié)果[2]。此法不能排除還原性雜質(zhì)(包括單糖)干擾,且顯色劑極易氧化而影響比色[3];重現(xiàn)性差、測定溶液穩(wěn)定時間短[4],同時使用大量具有強腐蝕性的硫酸,危險性高。文獻報道3,5-二硝基水楊酸(DNS)法操作簡便、快速、靈敏度高,且測定結(jié)果受雜質(zhì)干擾較小,可排除單糖等雜質(zhì)帶來的誤差。本文采用DNS法測定手參腎寶膠囊中多糖含量,為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。
UV-2450型紫外分光光度計(日本島津)。
DNS(自制);D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110833-201707,含量:99.5 %);手參腎寶膠囊(金訶藏藥股份有限公司,批號:01180709,01180718,01190129)。
精密稱取無水葡萄糖對照品10 mg,置入10 ml量瓶,加水使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 ml含無水葡萄糖1 mg)。
取本品內(nèi)容物0.3 g,精密稱定,置入100 ml量瓶,加熱水80 ml,置沸水浴加熱40 min,取出,放冷至室溫,加水稀釋至刻度,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液8 ml,置入25 ml量瓶,加6 mol/L鹽酸溶液8 ml,置沸水浴中加熱40 min,取出,放冷至室溫,加酚酞指示液2滴,用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色,加水稀釋至刻度,搖勻,作為總糖供試品溶液。再精密量取上述續(xù)濾液6 ml,置入10 ml量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻,作為還原糖供試品溶液。
取對照品溶液0.4 ml,加水至1 ml;再取供試品溶液中總糖供試品溶液及還原糖供試品溶液各1 ml,分別置入25 ml量瓶,加DNS溶液1.5 ml,混勻,沸水浴中加熱5 min,取出,立即冷卻至室溫,加水稀釋至刻度,搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,照分光光度法在400~600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。圖譜顯示,上述樣品在485±2 nm處有最大吸收,但文獻報道520 nm更有利于完成實驗[5],為確定更有利于手參腎寶膠囊多糖含量測定的波長,分別于0,1,2,4,6 h測定供試品吸光度值,計算RSD,見表1。由表1可見,520 nm處測定結(jié)果更加穩(wěn)定,與文獻報道一致,選定520 nm為檢測波長。
表1 不同波長處供試品溶液吸光度值
精密量取對照品溶液(濃度為1.0746 mg/ml)0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml,置入25 ml量瓶,分別加水至1.0 ml,分別精密加入DNS試液1.5 ml,混勻,沸水浴中加熱5 min,取出,立即冷卻至室溫,加水稀釋至刻度,搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,照分光光度法(中國藥典2015年版四部通則0401),在520 nm波長處測定吸光度(A),以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標(C),繪制標準曲線。回歸方程:A=0.01839C+0.01030,r=0.9981。結(jié)果表明:在8.597~42.984 μg/ml范圍內(nèi),多糖的吸光度與濃度線性關(guān)系良好。
精密量取總糖、還原糖供試品溶液各1 ml,分別置入25 ml量瓶,照標準曲線的制備項下,自“精密加入DNS試液1.5 ml”起,依法測定吸光度。從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量(mg),以總糖量減去還原糖量,即得。
取2.3項下供試品溶液,連續(xù)測定6次,記錄吸光度值。吸光度RSD為0.10 %,表明方法精密度良好。
取手參腎寶膠囊樣品(批號:01190129)6份,按2.2項方法制備供試品溶液,按2.5項方法測定多糖含量。結(jié)果顯示,多糖含量均值為103.02 mg/粒,RSD為1.91 %,表明方法重復(fù)性良好。
取已知含量的膠囊內(nèi)容物(批號:01190129,總糖含量:541.5 mg/g)約40 mg,精密稱定,置入25 ml量瓶,精密加入對照品20 mg,加水20 ml,置沸水浴加熱40 min,取出,放冷至室溫,加水稀釋至刻度,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液8 ml,置入25 ml量瓶,加6 mol/L鹽酸溶液8 ml,置沸水浴中加熱40 min,取出,放冷至室溫,加酚酞指示液2滴,用飽和的氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色,加水稀釋至刻度,搖勻,作為總糖供試品溶液。共配制6份。按含量測定方法測定總糖含量,計算回收率及RSD。結(jié)果見表2。結(jié)果表明:該方法測定結(jié)果準確,方法可行。
表2 回收率試驗結(jié)果表
取本品(批號:01190129),按2.5項方法,分別由不同分析人員,在不同時間采用同一設(shè)備檢測,多糖含量RSD值為0.6 %。結(jié)果表明:本方法中間精密度良好。
取3批手參腎寶膠囊樣品(01180709,01180718,01190129),按2.5項方法方法測定多糖的含量。結(jié)果見表3。
表3 手參腎寶膠囊多糖含量測定結(jié)果
手參腎寶腎寶膠囊組方精選手參、冬蟲夏草等五味名貴藥材,組方合理、性味平和,具有溫腎補陰之效,是藏醫(yī)治療腎陰虛的經(jīng)典方劑,現(xiàn)收載于《藏醫(yī)常用驗方薈萃》。本研究建立了手參腎寶膠囊中多糖含量測定方法,該方法簡便準確,回收率高、精密度好、重現(xiàn)性好、分析快速等優(yōu)點,可有效控制手參腎寶質(zhì)量。本法參照益腎康膠囊質(zhì)量標準[6],摸索了DNS法測定總多糖的方法,方法學(xué)研究表明:該法準確性高、重現(xiàn)性好、操作簡便,能更好地控制手參腎寶膠囊的質(zhì)量,保證了產(chǎn)品的安全、有效、質(zhì)量可控。