DNS法測定手參腎寶膠囊中多糖含量

孫躍寧，李懷平，羅明英，劉有菊

（1.金訶藏藥股份有限公司 藏藥新藥開發(fā)國家重點實驗室，青海 西寧 810003；2.金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濟南 250101）

手參腎寶膠囊是由手參、黃精、天冬、烈香杜鵑、冬蟲夏草五味藥味組成，具有溫腎補陰，填精補髓的作用，可用于腎陽不足，精血虧虛，遺精陽痿，腰膝酸軟，眩暈乏力。手參腎寶膠囊現(xiàn)行標準[WS-10550（ZD-0550）-2002-2011Z][1]中使用蒽酮-硫酸法測定總多糖含量。多糖提取一般采用熱水提取、乙醇除雜質(zhì)，缺少進一步分離純化的步驟，常含影響定量測定的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、單糖、色素、苷等。采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量，單糖類雜質(zhì)直接與蒽酮反應(yīng)使實測值偏高；蛋白質(zhì)、苷類雜質(zhì)在酸性環(huán)境中水解后與蒽酮反應(yīng)使實測值偏高；色素類雜質(zhì)使待測樣品本身帶有顏色從而影響測定結(jié)果[2]。此法不能排除還原性雜質(zhì)（包括單糖）干擾，且顯色劑極易氧化而影響比色[3]；重現(xiàn)性差、測定溶液穩(wěn)定時間短[4]，同時使用大量具有強腐蝕性的硫酸，危險性高。文獻報道3,5-二硝基水楊酸（DNS）法操作簡便、快速、靈敏度高，且測定結(jié)果受雜質(zhì)干擾較小，可排除單糖等雜質(zhì)帶來的誤差。本文采用DNS法測定手參腎寶膠囊中多糖含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2450型紫外分光光度計（日本島津）。

1.2 試藥

DNS（自制）；D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201707，含量：99.5 %）；手參腎寶膠囊（金訶藏藥股份有限公司，批號：01180709，01180718，01190129）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖對照品10 mg，置入10 ml量瓶，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 ml含無水葡萄糖1 mg）。

2.2 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物0.3 g，精密稱定，置入100 ml量瓶，加熱水80 ml，置沸水浴加熱40 min，取出，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液8 ml，置入25 ml量瓶，加6 mol/L鹽酸溶液8 ml，置沸水浴中加熱40 min，取出，放冷至室溫，加酚酞指示液2滴，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色，加水稀釋至刻度，搖勻，作為總糖供試品溶液。再精密量取上述續(xù)濾液6 ml，置入10 ml量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，作為還原糖供試品溶液。

2.3 最大吸收波長的確定

取對照品溶液0.4 ml，加水至1 ml；再取供試品溶液中總糖供試品溶液及還原糖供試品溶液各1 ml，分別置入25 ml量瓶，加DNS溶液1.5 ml，混勻，沸水浴中加熱5 min，取出，立即冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照分光光度法在400～600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。圖譜顯示，上述樣品在485±2 nm處有最大吸收，但文獻報道520 nm更有利于完成實驗[5]，為確定更有利于手參腎寶膠囊多糖含量測定的波長，分別于0，1，2，4，6 h測定供試品吸光度值，計算RSD，見表1。由表1可見，520 nm處測定結(jié)果更加穩(wěn)定，與文獻報道一致，選定520 nm為檢測波長。

表1 不同波長處供試品溶液吸光度值

2.4 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液（濃度為1.0746 mg/ml）0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，置入25 ml量瓶，分別加水至1.0 ml，分別精密加入DNS試液1.5 ml，混勻，沸水浴中加熱5 min，取出，立即冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照分光光度法（中國藥典2015年版四部通則0401），在520 nm波長處測定吸光度（A），以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標（C），繪制標準曲線。回歸方程：A=0.01839C+0.01030，r=0.9981。結(jié)果表明：在8.597～42.984 μg/ml范圍內(nèi)，多糖的吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.5 測定法

精密量取總糖、還原糖供試品溶液各1 ml，分別置入25 ml量瓶，照標準曲線的制備項下，自“精密加入DNS試液1.5 ml”起，依法測定吸光度。從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量（mg），以總糖量減去還原糖量，即得。

2.6 精密度試驗

取2.3項下供試品溶液，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值。吸光度RSD為0.10 %，表明方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取手參腎寶膠囊樣品（批號：01190129）6份，按2.2項方法制備供試品溶液，按2.5項方法測定多糖含量。結(jié)果顯示，多糖含量均值為103.02 mg/粒，RSD為1.91 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗

取已知含量的膠囊內(nèi)容物（批號：01190129，總糖含量：541.5 mg/g）約40 mg，精密稱定，置入25 ml量瓶，精密加入對照品20 mg，加水20 ml，置沸水浴加熱40 min，取出，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液8 ml，置入25 ml量瓶，加6 mol/L鹽酸溶液8 ml，置沸水浴中加熱40 min，取出，放冷至室溫，加酚酞指示液2滴，用飽和的氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色，加水稀釋至刻度，搖勻，作為總糖供試品溶液。共配制6份。按含量測定方法測定總糖含量，計算回收率及RSD。結(jié)果見表2。結(jié)果表明：該方法測定結(jié)果準確，方法可行。

表2 回收率試驗結(jié)果表

2.9 中間精密度試驗

取本品（批號：01190129），按2.5項方法，分別由不同分析人員，在不同時間采用同一設(shè)備檢測，多糖含量RSD值為0.6 %。結(jié)果表明：本方法中間精密度良好。

2.10 樣品含量測定結(jié)果

取3批手參腎寶膠囊樣品（01180709，01180718，01190129），按2.5項方法方法測定多糖的含量。結(jié)果見表3。

表3 手參腎寶膠囊多糖含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

手參腎寶腎寶膠囊組方精選手參、冬蟲夏草等五味名貴藥材，組方合理、性味平和，具有溫腎補陰之效，是藏醫(yī)治療腎陰虛的經(jīng)典方劑，現(xiàn)收載于《藏醫(yī)常用驗方薈萃》。本研究建立了手參腎寶膠囊中多糖含量測定方法，該方法簡便準確，回收率高、精密度好、重現(xiàn)性好、分析快速等優(yōu)點，可有效控制手參腎寶質(zhì)量。本法參照益腎康膠囊質(zhì)量標準[6]，摸索了DNS法測定總多糖的方法，方法學(xué)研究表明：該法準確性高、重現(xiàn)性好、操作簡便，能更好地控制手參腎寶膠囊的質(zhì)量，保證了產(chǎn)品的安全、有效、質(zhì)量可控。