豬瘟E2亞單位疫苗和豬口蹄疫O型/A型二價(jià)滅活疫苗聯(lián)合免疫的臨床評價(jià)

王遵寶 李俊輝 劉宏杰 曹 輝 趙 毅 王 元 候玉珍 何國文 高揚(yáng)毅 賀 筍

（天康生物股份有限公司，新疆烏魯木齊 830032）

在我國，豬瘟和口蹄疫都是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，其發(fā)生與流行給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前主要依靠疫苗免疫進(jìn)行防控。在非洲豬瘟成為常態(tài)化的背景下，采用傳統(tǒng)的免疫方式分別免疫豬瘟、口蹄疫疫苗，不僅工作量和勞動(dòng)強(qiáng)度大，免疫質(zhì)量差，而且多次注射免疫易增加豬場感染非洲豬瘟的風(fēng)險(xiǎn)。

隨著動(dòng)物疫苗研發(fā)、制造和生產(chǎn)工藝的不斷發(fā)展，豬用疫苗中有效抗原含量、純度逐步提升，免疫動(dòng)物后安全性、有效性隨之得到顯著改善，為育肥豬開展聯(lián)合免疫或1針免疫上市奠定了基礎(chǔ)。豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（商品名：“天瘟凈”）是國內(nèi)第一個(gè)上市的豬瘟E2亞單位疫苗，采用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白與進(jìn)口的植物油佐劑經(jīng)高速剪切乳化成油包水劑型的疫苗，緩釋效果好，可有效延長仔豬母源抗體至10～12周。豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗（商品名：“天蹄清”）是天康生物股份有限公司（以下簡稱“天康生物”）先后攻克了抗原濃縮、純化、保存期等技術(shù)難點(diǎn)后新近研制的豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗，屬于水包油包水的雙相疫苗，其母源抗體可持續(xù)至8～10周。

為提高免疫效率，保證免疫質(zhì)量，本研究采用天康生物生產(chǎn)的“天瘟凈”、豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗在田間開展了2種疫苗聯(lián)合免疫的安全性、有效性試驗(yàn)，并通過間隔免疫、同步分點(diǎn)注射、同步混合注射的方式，探索了同步混合注射的可行性和具體免疫程序。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在天康畜牧公司繁育豬場，用8周齡的360頭仔豬進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 疫苗

豬瘟E2亞單位疫苗（商品名：“天瘟凈”，批號(hào)：2018009、2018010、2018011），豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗（商品名：“天蹄清”，批號(hào)：201901、2019002、2019003）均由天康生物生產(chǎn)、提供。

1.3 檢測試劑

豬瘟病毒抗體檢測試劑盒購自愛德士公司（批號(hào)：99-43220）；豬口蹄疫O型、A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 主要儀器、設(shè)備、耗材

低溫高速離心機(jī)、微量振蕩器、酶標(biāo)儀、移液器、采血盛血器、96孔板、滅菌離心管等。

1.5 供試疫苗物理性狀測定方法

分別取3批次豬瘟E2亞單位疫苗和豬口蹄疫O、A二價(jià)滅活疫苗，按1∶1、2∶1、1∶2的體積比進(jìn)行混合，用手搖勻，連同3批次豬瘟E2亞單位疫苗和豬口蹄疫O、A二價(jià)滅活疫苗分別無菌取樣，進(jìn)行滴水、黏度、通針性測試，其余疫苗置于2～8℃保存7天，取樣測定疫苗穩(wěn)定性。

1.5.1 滴水測試

取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水表面，觀察分散相，確定混合疫苗劑型。如除第1滴外均呈油滴狀不擴(kuò)散，則為油包水劑型，如呈云霧狀擴(kuò)散，則為水包油包水劑型。

1.5.2 離心測試

取靜置2～8℃7天后的疫苗，吸取10 mL置于15 mL離心管中，以3000 r/min室溫離心15 min，測定管底析出的水相體積，分析疫苗穩(wěn)定性。

1.5.3 黏度測試

取200 mL疫苗置于20℃的電熱恒溫水浴鍋中，放置恒溫后，用NDJ-1B旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定疫苗黏度。

1.5.4 通針性測試

用10 mL注射器吸取10 mL疫苗，固定在鐵架臺(tái)上，在注射器活塞推桿上置以3.3 kg重物，記錄待測疫苗從注射器針頭完全排空所需要的時(shí)間，用以評價(jià)、比較疫苗通針性。

1.6 供試疫苗的安全性及有效性的臨床研究

在天康畜牧公司繁育豬場，用妊娠期免疫“天瘟凈”、豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗的母豬所產(chǎn)的9周齡仔豬360頭，按照表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用不同顏色耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記、分組和免疫，每組120頭，分欄飼養(yǎng)、觀察，其中第1組為間隔免疫組，第2組為同步分點(diǎn)免疫組，第3組為同步混合免疫組。在免疫前、免疫后每4周隨機(jī)抽樣采集各試驗(yàn)組的血樣，不低于30份/次/組（25%抽樣率），分離血清測定血樣豬瘟病毒、豬口蹄疫O型、A型特異性抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試疫苗物理性狀測定結(jié)果

如表2所示，3批豬口蹄疫O、A二價(jià)滅活疫苗滴于清潔冷水表面后均呈云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水劑型。3批豬瘟E2亞單位疫苗除第1滴外均呈油滴狀不擴(kuò)散，為油包水劑型?？谔阋?、豬瘟E2亞單位疫苗1∶1、2∶1混合后均呈水包油包水劑型，2∶1混合的外水相較多，1∶2混合后呈油包水劑型。離心測試結(jié)果表明，疫苗混合后均一、穩(wěn)定，2～8℃保存7天后未見分層，離心后析出水相均不大于0.5 mL，即2種疫苗混合后均一、穩(wěn)定。黏度測試結(jié)果表明，豬口蹄疫O、A二價(jià)滅活疫苗黏度最低，3批疫苗均值為46.5 CP，3批豬瘟E2亞單位疫苗的黏度為82.3 CP，口蹄疫、E2疫苗2∶1混合后的黏度最低，為58.8 CP，其余均介于口蹄疫與E2亞單位疫苗之間。通針性測試結(jié)果表明，口蹄疫疫苗通針性最好，2∶1混合疫苗的通針性次之，豬瘟E2亞單位疫苗最差。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2種疫苗混合后可顯著改善E2亞單位疫苗的通針性，結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，確定采用口蹄疫、E2亞單位疫苗2∶1體積比混合后在臨床中研究混合疫苗的安全性和有效性。

2.2 供試疫苗的安全性及有效性的臨床研究

2.2.1 安全性臨床研究

2 mL豬口蹄疫O/A二價(jià)滅活疫苗與1 mL“天瘟凈”混勻后呈水包油包水劑型，整體均一、穩(wěn)定，靜置1小時(shí)未見分層。實(shí)驗(yàn)豬接種疫苗后連續(xù)觀察14日，均未出現(xiàn)由接種疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)和死亡，出欄屠宰檢查時(shí)頸部肌肉未見殘留疫苗或過度炎性反應(yīng)導(dǎo)致的腫脹。

2.2.2 有效性臨床研究

⑴豬瘟抗體監(jiān)測結(jié)果

在試驗(yàn)豬群免疫前、后不同周齡采集血液，測定的血清中豬瘟特異性ELISA抗體檢測結(jié)果顯示，如圖1，試驗(yàn)豬群免疫前即9周齡時(shí)母源抗體阻斷率均值介于56.8%～58.1%之間，抗體陽性率介于83.3%～86.7%，方差分析結(jié)果顯示3組間抗體水平差異不顯著（＞0.05），提示母豬免疫“天瘟凈”后所產(chǎn)仔豬母源抗體持續(xù)期不低于10周；13周齡時(shí)3個(gè)試驗(yàn)組豬群抗體均有所提升，提示免疫“天瘟凈”疫苗受母源抗體干擾小。17周齡時(shí)3個(gè)組的豬瘟抗體均達(dá)到峰值，抗體阻斷率均值差異不顯著（＞0.05），介于83.3%～87.3%，此后豬瘟抗體緩慢下降，離散度變大，第1、2組下降明顯，至25周齡時(shí)抗體阻斷率均值分別為68.5%、61.4%，第3組均值最高，為70.7%。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、動(dòng)物分組及免疫程序表

表2 供試疫苗物理性狀統(tǒng)計(jì)、分析結(jié)果

⑵豬口蹄疫O型、A型抗體監(jiān)測結(jié)果

試驗(yàn)豬群在9周齡時(shí)豬口蹄疫O型母源抗體幾何平均值介于1∶60.3～1∶66.1之間，A型抗體幾何平均值介于1∶54.4～1∶60.1之間。首免后3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，13周齡時(shí)第1組抽樣檢測的O型抗體均值升高至1∶608.9，A型為1∶517.9；第2組最高，O型為1∶637.6，A型為 1∶555.1；第 3組O、A抗體滴度均為最低，分別為1∶588.1、1∶530.1；17周齡時(shí)3個(gè)試驗(yàn)組的抗體滴度達(dá)到高峰，第2組最高，O、A抗體滴度均不低于1∶1 000，第1組次之，第3組最低；此后抗體滴度開始下降，至25周齡時(shí)，第3組O、A抗體滴度分別降至1∶349.7、1∶326.3，第2組最高，為 1∶425.6、1∶397.1。見圖2、圖3。

⑶豬瘟、豬口蹄疫O、A型疫苗免疫前后抗體合格率

表3 試驗(yàn)豬群免疫前后抽檢血清樣本抗體合格率

根據(jù)豬瘟、豬口蹄疫抗體檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)、分析不同監(jiān)測點(diǎn)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的豬瘟、豬口蹄疫O、A亞型抗體的合格率，結(jié)果如表3顯示9周齡時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的豬瘟、豬口蹄疫母源抗體陽性率差異不顯著，其中豬瘟抗體陽性率均不低于80%，豬口蹄疫O型抗體合格率介于73.3%～76.7%，豬口蹄疫A型抗體合格率均不低于70%。

第1組試驗(yàn)豬10周齡免疫“天瘟凈”1頭份，免后3周豬瘟抗體陽性率提升至96.7%，17周齡時(shí)抽樣抗體陽性率為100%，此后開始下降，至25周時(shí)豬群豬瘟抗體陽性率降至86.7%。第2組在9周齡時(shí)用“天瘟凈”與口蹄疫疫苗分點(diǎn)免疫各1頭份，13周齡時(shí)豬瘟抗體陽性率達(dá)100%，17周仍為100%，25周時(shí)下降至83.3%；第3組在9周齡時(shí)用0.5頭份“天瘟凈”與1頭份口蹄疫混合均勻后免疫豬，免后3周以同樣方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，13周時(shí)豬群豬瘟抗體陽性率升高至93.3%，17周齡時(shí)抗體陽性率達(dá)100%，至25周齡時(shí)仍可達(dá)93.3%。

從首免后4周開始，即13周齡至25周齡豬群抽樣的口蹄疫O、A免疫抗體合格率均為100%。

3 討論與結(jié)論

國外主要養(yǎng)豬國家的口蹄疫（FMD）、豬瘟（CSF）等疫病防控以捕殺、凈化為主，因此疫苗的聯(lián)合免疫研究報(bào)道較少。近年來國內(nèi)多位學(xué)者用多個(gè)廠家生產(chǎn)的不同種類、毒株的FMD、CSF、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS）疫苗在不同日齡的多品種豬上進(jìn)行了疫苗的同步分點(diǎn)聯(lián)合免疫試驗(yàn)，除個(gè)別豬有發(fā)熱、減食等輕度應(yīng)激反應(yīng)外，均未見報(bào)道有嚴(yán)重不良反應(yīng)，表明聯(lián)合免疫在臨床中具有很好的安全性。

在免疫效果方面，部分學(xué)者認(rèn)為 FMD、CSF、HP-PRRS疫苗分點(diǎn)同步免疫，彼此無拮抗和干擾，可達(dá)到國家規(guī)定免疫合格率標(biāo)準(zhǔn)（不低于70%）。趙云堂等[1]報(bào)道用同一種稀釋液稀釋CSF脾淋苗、HP-PRRS滅活苗，混合后免疫豬耳后頸部肌肉，另一側(cè)同步注射FMD疫苗，在免疫后45天豬群CSF、FMD、HP-PRRS免疫抗體合格率分別達(dá)86.8%、76.5%、89.7%，均達(dá)到了國家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫的抗體保護(hù)要求。同樣地，覃勇等[1]在6個(gè)規(guī)模豬場用CSF細(xì)胞源活疫苗和HP-PRRS疫苗（TJM-F92株）釋稀后混合為1針，O型FMD滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）單獨(dú)1針同時(shí)分點(diǎn)免疫取得了較好的免疫效果。

大部分研究報(bào)告表明，CSF活疫苗、HP-PRRS疫苗間存在一定的免疫干擾作用，并可能干擾口蹄疫疫苗的免疫效果。魏軍等[3]報(bào)道豬 O型 FMD、CSF、HP-PRRS 3種疫苗同時(shí)免疫，免疫HP-PRRS疫苗不論是采用滅活疫苗還是活疫苗，CSF疫苗不論是采用肌肉注射還是皮下注射，疫苗免疫合格率均未達(dá)到國家規(guī)定的免疫合格率標(biāo)準(zhǔn)（不低于70%），3種疫苗不能同時(shí)免疫。進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)，用政府采購的豬O型FMD滅活疫苗、CSF細(xì)胞源活疫苗免疫后間隔21天肌肉注射HP-PRRS疫苗（NVDC-JXAI株），3種疫苗免疫合格率均高于國家標(biāo)準(zhǔn)。盧景等[4]同樣研究表明，F(xiàn)MD、CSF和HP-PRRS 3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫40日齡左右仔豬，其抗體水平低于單獨(dú)免疫，建議先同時(shí)分點(diǎn)免疫FMD和CSF疫苗，7天后免疫HP-PRRS疫苗，其抗體效價(jià)與單獨(dú)免疫基本一致。曹宗喜研究團(tuán)隊(duì)用FMD多肽疫苗、CSF細(xì)胞源活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗在定安黑豬同時(shí)分點(diǎn)免疫注射，各抗體水平相當(dāng)，且均達(dá)到國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。用豬FMD O型滅活疫苗、CSF兔源活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗（CH-1R株）分別在60日齡杜長大豬、臨高豬上進(jìn)行同時(shí)分點(diǎn)免疫注射，杜長大豬的聯(lián)合免疫組各抗體水平略低于對照組，但達(dá)到了國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，臨高豬聯(lián)合免疫組的FMD抗體水平和CSF抗體水平與對照組相當(dāng)，達(dá)到了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，但PRRS抗體免疫合格率僅達(dá)40%。綜上，其團(tuán)隊(duì)提出聯(lián)合免疫程序雖然節(jié)省人力、物力，減少了對豬的應(yīng)激，但可能與豬品種、氣候等因素有關(guān)，適合在定安黑豬和杜長大豬上應(yīng)用，不適合在臨高豬上推廣應(yīng)用[5]。

以上研究進(jìn)展表明，疫苗的聯(lián)合免疫效果受所用疫苗種類、生產(chǎn)廠家、疫苗中抗原含量、免疫程序、母源抗體水平、豬的品種及飼養(yǎng)管理等多種因素共同影響、作用，免疫效果差別較大，而且均屬于同步分點(diǎn)注射或CSF、HP-PRRS的稀釋混合注射，并未有效減輕免疫負(fù)擔(dān)，未見口蹄疫疫苗與豬瘟疫苗混合免疫的試驗(yàn)研究。主要是由于目前國內(nèi)口蹄疫滅活疫苗均為水包油劑型疫苗，難以與豬瘟凍干活疫苗的稀釋液混合均勻。豬瘟E2亞單位疫苗選用了進(jìn)口的植物油佐劑，成品疫苗為油包水劑型，該設(shè)計(jì)顯著提高疫苗的緩釋、炎癥反應(yīng)效果，延長了免疫持續(xù)期，但疫苗黏度較大，而且使用過程中注射器的橡膠活塞會(huì)吸油膨脹，影響了疫苗的通針性。本試驗(yàn)證實(shí)將2種疫苗按2∶1的體積比混合后疫苗呈水包油包水劑型，不僅均一、穩(wěn)定性好，而且可有效降低豬瘟E2亞單位疫苗的黏度，改善注射的通針性。

近年來，隨著獸用疫苗制造工藝的快速發(fā)展，國內(nèi)FMD疫苗生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)工藝技術(shù)革新，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也提高了疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，由每頭份3 PD50（疫苗50%動(dòng)物保護(hù)劑量）提高到6 PD50，該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施意味著FMD疫苗配苗抗原含量顯著提升，免疫后抗體效價(jià)和免疫持續(xù)期相應(yīng)提高，母源抗體持續(xù)期可由原來的4～6周延長至8～10周。CSF活疫苗的母源抗體持續(xù)期為3～5周，而新近上市的豬瘟E2亞單位疫苗中有效抗原含量高，能夠誘導(dǎo)懷孕母豬產(chǎn)生高水平中和抗體，其所產(chǎn)仔豬經(jīng)母乳移行的母源抗體持續(xù)期為10～12周。因此本研究在仔豬9周齡時(shí)采用3種不同免疫方式進(jìn)行豬瘟、口蹄疫疫苗的免疫防控。結(jié)果表明，采用間隔免疫、同步分點(diǎn)注射、同步混合注射的方式免疫試驗(yàn)豬均未引起免疫副反應(yīng)，同步混合注射的免疫效果優(yōu)于其他試驗(yàn)組，但彼此間差異不顯著，未見免疫干擾現(xiàn)象。用1 mL豬瘟E2亞單位疫苗與2 mL的口蹄疫疫苗混合免疫保護(hù)育肥豬至出欄上市時(shí)豬瘟抗體陽性率不低于90%，口蹄疫O、A抗體陽性率為100%，即同步混合免疫注射豬瘟E2亞單位疫苗和豬口蹄疫疫苗的技術(shù)方法不僅安全有效，而且可降低免疫勞動(dòng)強(qiáng)度、易于操作應(yīng)用，免疫效果理想，適合在臨床中大面積推廣應(yīng)用，對于在非洲豬瘟背景下防控豬瘟和口蹄疫，避免發(fā)生區(qū)域性疫情、降低非洲豬瘟感染風(fēng)險(xiǎn)具有重要價(jià)值。