杜仲籽油脂質(zhì)體的制備及其穩(wěn)定性研究

陳 亮，詹桂萍，魯 穎，李加興，余 佶，麻成金，姚茂君*

(1.吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學(xué) 食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)又名思仙、思仲，傳統(tǒng)以皮入藥，在我國已有2 000多年的藥用歷史[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)杜仲的葉、枝條、果實(shí)、雄花與皮含有相似的活性成分，均可入藥[2]。此外，杜仲翅果中富含油脂[3]，其α-亞麻酸高達(dá)61.04%[4]，不僅能增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗癌，而且還具有降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、抗抑郁、預(yù)防心腦血管疾病和延緩衰老等功效[5-6]。由原衛(wèi)生部和國家衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布的2009年12號(hào)公告中，批準(zhǔn)杜仲籽油為新食品原料，故其可作為藥食兼用油。然而杜仲籽油易氧化“酸敗”，生成過氧化脂質(zhì)，限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。脂質(zhì)體是脂類分子在低剪切力作用下與水混合形成的一種球狀囊泡[7]。作為一種納米運(yùn)輸載體，脂質(zhì)體不僅可以克服疏水性物質(zhì)水溶性差及生物不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性、防止氧化分解，而且還可以提高水溶性，促進(jìn)活性物質(zhì)的吸收[8]。制備脂質(zhì)體的傳統(tǒng)方法包括薄膜水化法[9]、逆向蒸發(fā)法[10]、乙醚注入法[11]和復(fù)乳法[12]等，盡管這些方法制備的脂質(zhì)體包埋率高，但存在有機(jī)溶劑殘留、耗時(shí)長、產(chǎn)品粒徑大和穩(wěn)定性不佳等缺點(diǎn)。乙醇注入-超聲波法是將磷脂等脂質(zhì)膜材和脂溶性活性物質(zhì)一起溶于無水乙醇中，用注射器加壓將溶液快速注入到水相中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，再經(jīng)超聲波處理形成脂質(zhì)體的方法，操作簡單、耗時(shí)少且無毒副作用。鑒于此，本研究采用乙醇注入-超聲波法制備杜仲籽油脂質(zhì)體，以包埋率為指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察杜仲籽油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，以期提高杜仲籽油的氧化穩(wěn)定性及儲(chǔ)藏時(shí)間，為杜仲籽油在功能性食品中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

杜仲籽油，由湘西自治州和益生物科技有限公司提供。大豆卵磷脂(純度≥97%)、β-谷甾醇，上海瑞永生物科技有限公司；吐溫-80，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫代巴比妥酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、甲醇、石油醚(沸程60～90 ℃)，均為國產(chǎn)分析純。

JY-ⅡDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Talos F200x場發(fā)射透射電子顯微鏡，賽默飛世爾公司；Nano-ZS90激光粒度分析儀，英國馬爾文公司；TDL- 40B低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ZDJ- 4A型自動(dòng)電位滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器公司。

1.2 杜仲籽油脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

1.2.1單因素試驗(yàn) 采用乙醇注入-超聲波法制備杜仲籽油脂質(zhì)體。準(zhǔn)確稱取大豆卵磷脂240 mg，與一定比例的β-谷甾醇、杜仲籽油和吐溫-80于無水乙醇中混合，在水浴振蕩器中振蕩，待其充分溶解后，用無菌注射器將脂質(zhì)溶液注入到磷酸鹽(PBS)緩沖液中。然后將樣品溶液重新轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，水浴真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，將所得乳液進(jìn)行超聲波處理，直至形成均勻脂質(zhì)體乳液。

分別考察大豆卵磷脂與β-谷甾醇質(zhì)量比(2 ∶1～10 ∶1)、大豆卵磷脂與杜仲籽油質(zhì)量比(2 ∶1～6 ∶1)、吐溫-80用量(10%～30%，以大豆卵磷脂質(zhì)量計(jì))、PBS緩沖液pH值(6.0～8.0)、超聲波作用時(shí)間(5～25 min)、超聲波功率(60～300 W)等對(duì)杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率的影響。

1.2.2Plackett-Burman試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考察上述6個(gè)因素(n=12)對(duì)杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率的影響，并篩選出顯著影響因素。

1.2.3最陡爬坡試驗(yàn) 通過Plackett-Burman試驗(yàn)得到的一次擬合方程，設(shè)計(jì)各顯著因素的爬坡方向和步長，確定各顯著因素的最佳中心點(diǎn)。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析 采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化上述對(duì)包埋率影響顯著的因素，通過二次多項(xiàng)式回歸擬合，結(jié)合方差分析及各因素交互作用，確定杜仲籽油脂質(zhì)體制備最佳工藝條件。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 使用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述和多元回歸分析。

1.3 杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率的測定

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將杜仲籽油、大豆卵磷脂、β-谷甾醇分別溶解于石油醚中，以石油醚為空白對(duì)照，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，獲得最大吸收波長為302 nm。配置質(zhì)量濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 g/L的杜仲籽油石油醚溶液，在302 nm處測定不同濃度杜仲籽油石油醚溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.104 8x-0.003 4，R2=0.993 1。

1.3.2包埋率的測定 參照文獻(xiàn)[13]方法并稍做修改測定杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率。取10 mL脂質(zhì)體于燒杯中，加入10 mL石油醚，混合均勻，4 000 r/min離心15 min，取上層石油醚液置于25 mL容量瓶，重復(fù)萃取2次后，合并石油醚液，并用石油醚定容至刻度，以石油醚為空白對(duì)照，在302 nm 處測定樣品吸光度(A0)。選用10%Triton X-100甲醇溶液為破乳劑，超聲波破乳(功率96 W，10 min)，同法測定上述萃取后的脂質(zhì)體溶液的吸光度(A1)。將A0和A1分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出游離杜仲籽油質(zhì)量濃度(C0)和被包埋的杜仲籽油質(zhì)量濃度(C1)，并計(jì)算包埋率(η)：η=C1/(C0+C1)×100%。

1.4 杜仲籽油脂質(zhì)體的形態(tài)與性能分析

1.4.1微觀形態(tài)觀察 采用負(fù)染色法[14]觀察脂質(zhì)體的表面形態(tài)。用PBS緩沖液將樣品稀釋10倍，用銅網(wǎng)沾取少量脂質(zhì)體懸浮液，在銅網(wǎng)上停留2 min，然后將銅網(wǎng)浸入2%磷鎢酸2 min，并用濾紙吸干，在透射電鏡下觀察杜仲籽油脂質(zhì)體的微觀形態(tài)。

1.4.2粒徑測定 按優(yōu)化工藝條件制備杜仲籽油脂質(zhì)體懸浮液，稀釋一定倍數(shù)后，在25 ℃、散射角90°條件下，采用激光粒度儀測定杜仲籽油脂質(zhì)的粒徑大小、多分散系數(shù)(PDI)及Zeta電位值。

1.4.3穩(wěn)定性分析 按優(yōu)化工藝條件制備杜仲籽油脂質(zhì)體懸浮液，分裝于密封小瓶中，分別置于4、25和40 ℃條件下避光保存15 d，每隔3 d取樣觀察1次。根據(jù)平均粒徑、包埋率、pH值、丙二醛(MDA)含量等指標(biāo)的變化情況，評(píng)價(jià)其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。其中以MDA含量表征杜仲籽油脂質(zhì)體中磷脂的氧化程度，參照文獻(xiàn)[15]方法，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲籽油脂質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

2.1.1單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 選擇大豆卵磷脂與β-谷甾醇質(zhì)量比(X1)、大豆卵磷脂與杜仲籽油質(zhì)量比(X2)、吐溫-80用量(X3)、PBS緩沖液pH值(X4)、超聲波作用時(shí)間(X5)和超聲波功率(X6)為考察因素，探討各因素對(duì)杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率的影響，結(jié)果見圖1。

a.m(大豆卵磷脂)/m(β-谷甾醇)m(phosphatidylcholine)/m(β-sitosterol); b.m(大豆卵磷脂)/m(杜仲籽油)

由圖1(a)可知，β-谷甾醇含量過高過低都會(huì)導(dǎo)致杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率下降，大豆卵磷脂與β-谷甾醇最佳質(zhì)量比為2 ∶1～6 ∶1，考慮到Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素的水平選取時(shí)，需盡量涵蓋每個(gè)因素允許取值的最大空間，但不能選太大，所以選擇大豆卵磷脂與β-谷甾醇最佳質(zhì)量比為3 ∶1～5 ∶1。同理，由圖1(b)～圖1(f)可知，大豆卵磷脂與杜仲籽油的質(zhì)量比、吐溫-80用量、PBS緩沖液pH值、超聲波作用時(shí)間、超聲波功率分別在3 ∶1～5 ∶1、15%～25%、6.8～7.2、6～14 min、160～240 W區(qū)間內(nèi)杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率達(dá)最高。

2.1.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵因素 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考察了上述因素對(duì)杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率的影響，并篩選出顯著影響因素，每個(gè)因素取最低(-1)和最高(1)兩個(gè)水平。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，進(jìn)行多元回歸方程擬合和方差分析，得一次回歸方程：Y=0.348 5+1.648×10-2X1+6.667×10-3X2-1.500×10-4X3+3.850×10-2X4-2.079×10-3X5-1.567×10-4X6，對(duì)方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.3最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳中心點(diǎn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)回歸方程中3個(gè)顯著因素(X1、X4、X5)的變量關(guān)系確定爬坡方向和步長，其中X1、X4為正效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)取其高水平；X5為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)取其低水平。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可知，杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率在第2組達(dá)到最高，說明第2組附近存在最優(yōu)點(diǎn)。因此以m(大豆卵磷脂)/m(β-谷甾醇)3.5 ∶1、PBS緩沖液pH值6.9、超聲波作用時(shí)間12 min為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.4響應(yīng)面優(yōu)化分析 結(jié)合單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平共17組試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表4試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行多元回歸方程擬合和方差分析，得到自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=-128.6+1.617X1+36.14X4+0.356 1X5-0.197 0X1X4-4.850×10-3X1X5-3.138×10-2X4X5-3.361×10-2X12-2.548X42-5.057×10-3X52。

根據(jù)模型回歸方程求得杜仲籽油脂質(zhì)體制備的優(yōu)化工藝條件為大豆卵磷脂與β-谷甾醇比為3.1 ∶1，PBS緩沖液pH值為6.93，超聲波作用時(shí)間為12.52 min，在此條件下杜仲籽油脂質(zhì)體的理論包埋率為74.41%。

表5 回歸方程方差分析

為驗(yàn)證該響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。采用上述最佳工藝制備脂質(zhì)體，考慮實(shí)際情況，取大豆卵磷脂240 mg,設(shè)定大豆卵磷脂與β-谷甾醇質(zhì)量比為3.1 ∶1，大豆卵磷脂與杜仲籽油質(zhì)量比為4 ∶1，吐溫-80占大豆卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，PBS緩沖液pH值為6.9，超聲波作用時(shí)間13 min，超聲波功率180 W，制備的杜仲籽油脂質(zhì)體平均包埋率為75.26%，與理論值的相對(duì)誤差為1.129%，與劉玉珍等[8]通過乙醇注入-超聲波法制備的薏苡仁油脂質(zhì)體包埋率接近，說明該模型真實(shí)可靠。

2.2 杜仲籽油脂質(zhì)體微觀形態(tài)及粒徑分布

按上述優(yōu)化工藝條件制備杜仲籽油脂質(zhì)體懸浮液樣品于透射電鏡下觀察粒子微觀形態(tài)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，杜仲籽油脂質(zhì)體外觀呈現(xiàn)準(zhǔn)球形，平滑完整，無明顯塌陷和凝聚成團(tuán)的現(xiàn)象。經(jīng)超聲波處理后，杜仲籽油脂質(zhì)體顆粒分布較為均勻，粒徑小于100 nm。

采用粒徑分析儀測定杜仲籽油脂質(zhì)體的粒徑分布，結(jié)果見圖3。由圖3可知，杜仲籽油脂質(zhì)體的平均粒徑為137.4 nm，分布均勻，且呈正態(tài)分布。此外，經(jīng)測定杜仲籽油脂質(zhì)體的平均Zeta電位為-19.3 mV，PDI為0.219，初步判斷所制備的杜仲籽油脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。

由上述分析可知，透射電鏡與粒徑分析儀測定的粒徑結(jié)果稍有差異，這可能是因?yàn)榱椒治鰞x所測的杜仲籽油脂質(zhì)體是液體狀態(tài)，測的是水力學(xué)粒徑，使得所測粒徑較大；與此相反，透射電鏡圖是在樣品脫水條件下測得的[16]。此外，2種測定方法的分析技術(shù)原理有所差異，激光粒度分析儀對(duì)顆粒粒徑的計(jì)算基于顆粒的擴(kuò)散特性，體系的黏度會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾[17]。

2.3 杜仲籽油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性分析

通過測定包埋率、平均粒徑、pH值和MDA含量，分析杜仲籽油納米脂質(zhì)體的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。在不同儲(chǔ)藏溫度下，杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率變化趨勢(shì)如圖4(a)所示。由圖可知，溫度越高，杜仲籽油滲出越嚴(yán)重，包埋率越低；在4 ℃條件下，儲(chǔ)藏15 d時(shí)包埋率由75.26%下降到61.45%，下降趨勢(shì)相對(duì)于25和40 ℃明顯放緩。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，脂質(zhì)體膜材的分子熱運(yùn)動(dòng)加速，脂質(zhì)雙分子層的酰基側(cè)鏈從有序排列到無序，導(dǎo)致脂膜由凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)，膜的橫切面增加，雙分子層的厚度減小，膜流動(dòng)性增加，導(dǎo)致包埋的杜仲籽油泄露[18]。

由圖4(b)可知，在4 ℃條件下，儲(chǔ)藏15 d時(shí)杜仲籽油脂質(zhì)體懸浮液pH值略微下降，而25和40 ℃條件下儲(chǔ)藏15 d時(shí)pH值下降明顯。這是由于隨著溫度的升高，加重了磷脂的氧化程度，使其水解產(chǎn)生游離脂肪酸、溶血磷脂和甘油磷脂等[19]，這些產(chǎn)物的生成，導(dǎo)致杜仲籽油脂質(zhì)體在儲(chǔ)藏過程中pH值下降，并加速其進(jìn)一步水解和氧化。

由圖4(c)可知，在4 ℃下，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，脂質(zhì)體的粒徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，到第9天時(shí)粒徑由137.4 nm上升到187.8 nm，在第15天時(shí)粒徑下降到160.9 nm。在25和40 ℃下，脂質(zhì)體的粒徑也呈同樣的趨勢(shì)，且隨著溫度的升高，脂質(zhì)體前期粒徑增大更加明顯。這是因?yàn)橹|(zhì)體是熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，在儲(chǔ)藏過程中受體系溫度影響較大，磷脂膜之間易發(fā)生融合、聚集等現(xiàn)象，導(dǎo)致粒徑變大；此外，隨著杜仲籽油的泄露與水解，游離脂肪酸的生成可以充當(dāng)良好的融合劑的作用，促進(jìn)脂質(zhì)體融合[20]。但隨著時(shí)間的推移，脂質(zhì)體膜可能會(huì)由于氧化而發(fā)生崩解，脂質(zhì)體變成碎片，導(dǎo)致所測平均粒徑變小[21]。

a.包埋率encapsulation efficiency; b.pH值pH value; c.平均粒徑particle size;d.MDA

由圖4(d)可知，丙二醛(MDA)含量在儲(chǔ)藏期間呈現(xiàn)先上升后趨于平緩甚至略有下降趨勢(shì)，且4 ℃下脂質(zhì)體的MDA含量低于25和40 ℃下的測定值。4 ℃下儲(chǔ)藏15 d時(shí)，丙二醛由0.023 2 mg/g上升到0.033 1 mg/g。這是因?yàn)橹|(zhì)體氧化過程通常是一個(gè)連鎖式反應(yīng)，丙二醛只是氧化反應(yīng)的一個(gè)中間產(chǎn)物，在高溫、低pH值、氧氣等條件下會(huì)加速脂質(zhì)體氧化水解[22]，此時(shí)，過氧化物分解速度低于生成速度，導(dǎo)致所測MDA含量加速升高；但隨著儲(chǔ)藏過程中氧氣的損耗，使脂質(zhì)氧化水解速度下降，隨著過氧化物含量的升高，其分解速度加快，導(dǎo)致MDA含量上升平緩甚至下降[23]。

綜上可知，杜仲籽油脂質(zhì)體作為一個(gè)熱不穩(wěn)定體系，在4、25和40 ℃儲(chǔ)藏15 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)4 ℃下各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定性均優(yōu)于25和40 ℃，4 ℃下的杜仲籽油脂質(zhì)體有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

3.1采用乙醇注入-超聲波法制備杜仲籽油脂質(zhì)體，以杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率為響應(yīng)值，在單因素的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到杜仲籽油脂質(zhì)體的最優(yōu)制備工藝為：大豆卵磷脂240 mg,大豆卵磷脂與β-谷甾醇質(zhì)量比為3.1 ∶1，大豆卵磷脂與杜仲籽油質(zhì)量比為4 ∶1，吐溫-80用量為20%，PBS緩沖液pH值為6.9，超聲波作用時(shí)間13 min，超聲波功率180 W。此時(shí)，杜仲籽油脂質(zhì)體包埋率為75.26%。

3.2在優(yōu)化工藝條件下，杜仲籽油脂質(zhì)體在透射電鏡下呈準(zhǔn)球形，外觀平滑完整，平均粒徑為137.4 nm，PDI為0.219，Zeta電位為-19.3 mV。在4、25和40 ℃儲(chǔ)藏15 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)杜仲籽油脂質(zhì)體在 4 ℃ 下有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，其各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定性均優(yōu)于25和40 ℃。