微流控芯片技術(shù)在藥物化學實驗中的應(yīng)用

高志剛，羅 勇，宋其玲，李悅青，王世盛，葉俊偉

（大連理工大學 化工學院，國家級化工綜合實驗教學示范中心，遼寧 大連 116024）

微流體是在微米尺度空間內(nèi)流動的流體，在此基礎(chǔ)上形成的微流控技術(shù)是對微流體進行操作的技術(shù)，其操作對象的主要特征是層流或低雷諾數(shù)[1-2]。微流體由于自身具有微小、易控等特點，使得其在常規(guī)化學和生物化學實驗等方面有廣泛的應(yīng)用前景。以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展的微流控芯片，是將常規(guī)化學、生物化學等實驗操作微縮在厘米尺寸芯片上的科學技術(shù)，因此又稱為微流控芯片實驗室。微流控芯片具有顯著的自身優(yōu)勢，如自動化程度高、靈活性高、可集成、高效、低成本、高分辨率、高靈敏度等特點[3-4]。

由于基于微流控芯片技術(shù)合成化合物具有良好的收率和可重復性，近年來應(yīng)用連續(xù)流動技術(shù)合成化合物成為熱門的研究方向之一[5]。通常微通道內(nèi)的流體是微米級別的，根據(jù)雷諾系數(shù)Re=黏性力/慣性力判斷，在微流體流動過程中，慣性力影響很小，黏性力起主導。Re大約在10–6～10，遠小于2 000，所以微流體的流動特性是典型的層流。因此微通道反應(yīng)器的宏觀流動模型也可視為平推流反應(yīng)器。在微通道反應(yīng)芯片中，不同反應(yīng)物通過分子擴散達到混合目的[6]。

硝苯地平臨床上主要用于降壓治療，其原理是通過阻滯鈣離子內(nèi)流進入心肌細胞或平滑肌細胞，從而使得冠狀動脈壓力降低，血管舒張，最終導致血壓下降。目前藥物化學實驗教學中，硝苯地平合成通常采用一鍋法制備，使用鄰硝基苯甲醛、乙酰乙酸甲酯和氮源作為反應(yīng)物，在醇溶液中加熱回流反應(yīng)，這種方法得到的產(chǎn)物總收率不高，副產(chǎn)物較多，乙醇重結(jié)晶后產(chǎn)物收率僅能達到70%左右[7-9]。

由于采用微流控技術(shù)進行藥物合成的研究仍處于亟待探索的方向，目前少有相關(guān)研究方向的報道。在本文微通道反應(yīng)裝置中，以連續(xù)制備硝苯地平為案例，將藥物合成技術(shù)相關(guān)知識內(nèi)容引入到藥物化學實驗教學中，從而培養(yǎng)學生創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力。

1 微通道反應(yīng)芯片設(shè)計及制作

本文采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作微通道反應(yīng)芯片，PDMS 具有透氣性強、可成型性好、生物相容性高、毒性小、易于封接等特點，其制作過程主要包括硅片預處理、勻膠、前烘、曝光、顯影、堅膜、PDMS 澆鑄和封接等操作步驟[10-11]。

在硝苯地平合成過程中，微通道的設(shè)計影響其合成收率。微通道的基本作用是能夠按照一定比例使液體充分均勻混合，同時還允許微流體在其內(nèi)穩(wěn)定流動，而不會出現(xiàn)固體堵塞[12-13]。結(jié)合硝苯地平的合成條件，在微通道反應(yīng)芯片中需要完成預熱、混合、分離和集成多個實驗操作。本實驗搭建微通道反應(yīng)裝置如圖1 所示，包括兩個注射泵、一個溫度加熱裝置和一個反應(yīng)芯片。反應(yīng)芯片集成預熱模塊和混合模塊，其中預熱模塊包括兩條獨立通道，每條通道包含8 個彎道，每條長度為200 mm（從進樣口至T 型混合器）。反應(yīng)模塊包括一個T 型混合器和68 個彎道的增強混合裝置，通道總長度為1 000 mm（從T 型混合器至出樣口）。芯片上層為PDMS 基片，面積為3 750 mm2，厚度為4.57 mm。下層為光學玻璃基片，厚度為1.14 mm。

圖1 搭建微通道合成裝置實物圖

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

合成實驗試劑：鄰硝基苯甲醛、乙酰乙酸甲酯、濃氨水、乙酸銨、無水乙醇等。

芯片制作試劑：30%過氧化氫、PDMS-A 液、PDMS 固化劑、光刻膠SU8、乳酸乙酯、異丙醇等。

2.2 實驗儀器

電熱恒溫水浴鍋、電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、真空泵、紫外深度光刻機、數(shù)控超聲波清洗器、勻膠臺、烘片機、水平搖床、四維旋轉(zhuǎn)混勻器、基本型等離子清洗機和注射泵等。

2.3 實驗步驟

分別取2 個10 mL 注射器，向其中注滿無水乙醇，安裝在注射泵上，用輸液管和塑料軟管將注射器和微流控芯片相連，并將芯片置于溫控裝置上，芯片與收集裝置同樣使用輸液管和塑料軟管連接。同時打開2個單通道注射泵，觀察流體在微通道中的流動狀態(tài)，排出微通道中的氣泡，無水乙醇同時起到清洗微通道的作用。檢查微流控芯片是否有堵塞或漏液現(xiàn)象，檢查進樣口、出樣口及其他連接部位是否有漏液現(xiàn)象。

將鄰硝基苯甲醛和乙酰乙酸甲酯按照一定摩爾比在無水乙醇中溶解混合，加入注射器1 中，將稱取的10 mL 濃氨水加入注射器2 中，調(diào)節(jié)單通道注射泵的流速為0.5 mL/min，調(diào)節(jié)溫控裝置的預設(shè)溫度為80 ℃，開啟單通道注射泵片刻，設(shè)置2 個單通道注射泵的運行時間，使得2 個注射器中的溶液能夠同時到達微流控芯片進樣口，進行混合反應(yīng)。當反應(yīng)液在T 型混合器中同時達到中心點，混合液在流動過程中無不規(guī)則氣泡產(chǎn)生，且在微通道內(nèi)穩(wěn)定流動時，開始收集硝苯地平粗產(chǎn)品，最后采用無水乙醇重結(jié)晶。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 氮源對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

根據(jù)實驗方案，該反應(yīng)中氮源選擇濃氨水和乙酸銨2 種溶液，其中氨水摩爾濃度為7.94 mol/L，乙酸銨摩爾濃度4.28 mol/L。當反應(yīng)流速為0.5 mL/min，反應(yīng)濕度80 ℃時，考察鄰硝基苯甲醛濃度分別為1、1.5 和3 mol/L 時，反應(yīng)收率如表1 所示。

表1 不同摩爾濃度鄰硝基苯甲醛實驗結(jié)果

對比上述實驗結(jié)果可知，反應(yīng)物濃度相同時，以乙酸銨作為氮源的產(chǎn)物收率較高，同時當鄰硝基濃度1.5 mol/L、乙酰乙酸甲酯3 mol/L 時，反應(yīng)收率最高為70.2%。

3.2 反應(yīng)物比例對收率的影響

當乙酸銨濃度 4.28 mol/L，鄰硝基苯甲醛為 1.5 mol/L，考察了不同濃度乙酰乙酸甲酯對收率的影響，如表2 所示，可知當鄰硝基苯甲醛與乙酰乙酸甲酯比例1∶2～1∶3 時對該反應(yīng)的收率影響不大，故選擇鄰硝基苯甲醛與乙酰乙酸甲酯摩爾比1∶2 進行反應(yīng)。

表2 不同濃度乙酰乙酸甲酯實驗結(jié)果

3.3 反應(yīng)溫度影響

反應(yīng)溫度考察了70 ℃、80 ℃和90 ℃ 3 個條件，收率如表3 所示，鄰硝基苯甲醛濃度為1 mol/L，乙酰乙酸甲酯濃度2 mol/L，乙酸銨濃度4.28 mol/L，反應(yīng)溫度80 ℃。流速都為0.5 mL/min，由表可知，當反應(yīng)物溫度為80 ℃時收率最大，此為合成硝苯地平的最適溫度。當溫度低于80 ℃時，反應(yīng)物無法完全反應(yīng)導致收率降低。當溫度高于80 ℃時，高溫使得反應(yīng)物部分揮發(fā)，產(chǎn)物受熱分解，使副產(chǎn)物生產(chǎn)增加，最終導致收率降低。

表3 溫度對產(chǎn)物收率的影響

3.4 微通道流速對收率的影響

根據(jù)實驗方案將不同流動速度分成4 組，并研究了3 種不同鄰硝基苯甲醛濃度對硝苯地平合成實驗結(jié)果的影響，實驗結(jié)果見表4。對比上述實驗結(jié)果可知，當流量大于0.2 mL/min 時，在相同流速下，反應(yīng)物濃度越高，反應(yīng)收率越低。但是當流量小于0.2 mL/min時，這種規(guī)律不是嚴格被遵守的。這種收率與濃度負相關(guān)的現(xiàn)象可能的解釋是由于微通道尺寸受限，微通道的體積較小，高濃度反應(yīng)物不能在微通道充分混合導致產(chǎn)量降低?；蛘哂捎诟邼舛确磻?yīng)物在微通道內(nèi)停留時間過短，沒有完全反應(yīng)。而低濃度反應(yīng)物在相同流速下，能在較短的停留時間內(nèi)完全反應(yīng)。低流速下這種相關(guān)性消失，可能與停留時間增長，反應(yīng)物反應(yīng)的比例增大有關(guān)。

表4 微通道流速對產(chǎn)物收率的影響

濃度相同時，隨流速增大，收率增加。濃度為0.5、1.5 mol/L 時，流速對反應(yīng)收率增加作用明顯，流速為0.5 mL/min 時為最佳流速，濃度為1 mol/L 時不明顯，且在流速為0.4 mL/min 時有最大收率。收率隨流速增加的原因可能是由于流速降低，反應(yīng)物在微通道內(nèi)停留時間長，生產(chǎn)的硝苯地平晶體在通道中受熱不穩(wěn)定而部分分解，因此導致產(chǎn)量降低。

4 結(jié)語

本文基于微流控芯片技術(shù)，設(shè)計并制作了一種依靠壓電驅(qū)動、廉價易得、制作操作簡單、微流體流動穩(wěn)定、可重復利用的集成化學合成反應(yīng)芯片，并對其形狀和尺寸進行了優(yōu)化改進。在研究微流控芯片的預熱功能和混合效率基礎(chǔ)上，利用該芯片完成了硝苯地平的合成，并討論了不同反應(yīng)條件對實驗結(jié)果的影響。實驗結(jié)果表明，其產(chǎn)物純度和收率與傳統(tǒng)實驗室方法相比，均有一定的提高，同時僅需要幾分鐘就可以反應(yīng)完全。該實驗方法拓展了微通道反應(yīng)在藥物化學實驗教學中的應(yīng)用，同時對微流控技術(shù)在有機合成等領(lǐng)域中的實際應(yīng)用具有一定的指導作用。