• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    槐角多糖抗氧化活性研究

    2020-03-09 08:45:44王杰劉瑞珍劉東超李慧劉忠華
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:槐角超氧吸光

    王杰,劉瑞珍,劉東超,李慧,劉忠華,*

    (1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083;2.煙臺(tái)市森林資源監(jiān)測(cè)保護(hù)服務(wù)中心,山東煙臺(tái)264013)

    槐角是一種傳統(tǒng)中藥材,以其為原料制成的槐角茶有軟化血管、疏風(fēng)熱、抑菌消炎、潤(rùn)腸通便之效,尤其對(duì)降三高有極好療效,受到廣大老年人的歡迎。槐角藥理功能源于其中的活性物質(zhì)組分,如黃酮、異黃酮以及三萜皂苷等[1-3],隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展,更多活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn),其主要成分多糖也受到研究關(guān)注[4],方艷夕等[5]研究發(fā)現(xiàn)槐角多糖中主要單糖成分為葡萄糖、果糖;槐角果皮多糖和種子多糖有吸濕保濕的作用,對(duì)自由基有一定清除作用[6]。但目前對(duì)槐角多糖抗氧化活性研究相對(duì)較少,本文以提取的槐角多糖為試驗(yàn)材料,采用自由基評(píng)定法對(duì)ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH 自由基進(jìn)行了抗氧化活性研究,以期為槐角多糖的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 試驗(yàn)材料

    槐角:河北國(guó)安藥材批發(fā)市場(chǎng),產(chǎn)自河北國(guó)安地區(qū)。挑選顏色均勻、形態(tài)飽滿、果莢完好、無(wú)病蟲(chóng)害的槐角,自然晾干,60 ℃烘干 2 h,粉碎、過(guò) 20 目篩,干燥存儲(chǔ)。

    1.1.2 試劑

    果膠酶(40 U/mg)、纖維素酶(100 U/mg)、EDAE-52 纖維素柱料、ABTS、DPPH、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、FeSO4、水楊酸、30%H2O2試劑、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇:北京化工廠;pUC18 質(zhì)粒(Takera)、DNA Marker(DL5000)、6×Loading Buffer、Golden View 核酸染料:北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    分析天平(ML104/02):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī)(CT15RT):美國(guó)Sigma公司;真空冷凍干燥機(jī)(FD-80):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司;紫外分光光度計(jì)(UV-1100):上海美譜達(dá)儀器有限公司;酶標(biāo)儀(Infinite):瑞士 Tecan 集團(tuán);電泳儀(Power Pac)、紫外熒光凝膠成像儀(Chemi Doc XRS+):美國(guó)BIO-RAD。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 槐角多糖提取及分離純化

    1.3.1.1 槐角多糖提取

    參照李彩霞等[6]方法,采用超聲輔助復(fù)合酶解法水提槐角多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g 槐角粉加入100 mL 蒸餾水,200 W 超聲處理20 min 后加入0.05 %混合酶(果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比 1 ∶1),50 ℃水浴 60 min,沸水浴滅酶5 min,6 000 r/min 離心10 min,清液減壓濃縮,加3 倍95%乙醇過(guò)夜,離心,沉淀加水復(fù)溶,加入1/4 體積的Sevage 試劑[7](三氯甲烷與正丁醇體積比4 ∶1),重復(fù) 3~4 次,上清液醇沉過(guò)夜,沉淀于-80 ℃預(yù)冷12 h,再轉(zhuǎn)至-80 ℃真空冷凍干燥得到槐角多糖(sophorae fructus polysaccharides,SFP)。

    1.3.1.2 槐角多糖純化

    將槐角多糖(SFP)用中性去離子水配成100 mg/mL的多糖溶液,取10 mL 離心,上清液緩慢加入DEAE-52 纖維素層析柱,待SFP 全部進(jìn)入柱料后,向?qū)游鲋屑訚M去離子水,流速為1.0 mL/min,8 mL 每管。分別用 0、0.1、0.3、0.7 mol/L 的 NaCl 溶液線性梯度洗脫。將蒸餾水洗脫組分合并、濃縮、真空冷凍干燥,得槐角次級(jí)多糖SFP-1;將NaCl 溶液洗脫的酸性多糖合并、透析、再濃縮后真空冷凍干燥,得到槐角次級(jí)多糖SFP-2[8]。

    1.3.2 槐角多糖溶液配制

    精確稱(chēng)量0.64 g 槐角多糖SFP 及純化分離后的SFP-1、SFP-2,配制成6.40 mg/mL 的多糖母液,按二倍稀釋法稀釋成 3.20、1.60、0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL的樣品溶液,4 ℃存放。

    1.3.3 槐角多糖抗氧化試驗(yàn)

    1.3.3.1 槐角多糖清除ABTS+自由基試驗(yàn)

    參照 Yang 等[9]方法修改,ABTS(7.4 mmol/L)與K2S2O8(2.6 mmol/L)等體積混合,4 ℃遮光12 h,用前稀釋至734 nm 吸光值為0.700±0.020。準(zhǔn)確吸取樣品和ABTS 試劑各2 mL,暗反應(yīng)6 min,立即于734 nm 測(cè)吸光值,記為Ai;以等量蒸餾水替代樣品,記為A0;2 mL樣品與2 mL 的95%乙醇混勻,同樣反應(yīng)時(shí)間和波長(zhǎng)下測(cè)吸光值,記為A1。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.2 槐角多糖清除DPPH 自由基試驗(yàn)

    參照 Gong 等[10]方法,精確配制 0.15 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品與DPPH 溶液各2 mL混勻,暗反應(yīng) 30 min,517 nm 測(cè)吸光值,記為 Ai;蒸餾水替代樣品與2 mL 的DPPH 溶液反應(yīng),同樣操作,記為A0;2 mL 的95%乙醇與2 mL 樣品混合反應(yīng),吸光值記為A1。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.3 槐角多糖清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)

    采用鄰苯三酚自氧化法,向反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的樣品溶液 SFP、SFP-1、SFP-2 各 1 mL,4.5 mL Tris-HCl[50 mmol/L pH(8.1±0.1)]和 3.2 mL 蒸餾水,37 ℃水浴 20 min 后加入 0.3 mL 鄰苯三酚(5 mmol/L),于325 nm 處每隔30 s 記錄一次數(shù)值(以10 mmol/L 的HCl 調(diào)零),測(cè) 5 min,計(jì)算反應(yīng)速度斜率 ΔAi;對(duì)照組以蒸餾水代替樣品測(cè)吸光值變化斜率,記為ΔA0。

    式中:ΔAi為樣品吸光值變化的斜率;ΔA0為對(duì)照組吸光值變化的斜率。

    1.3.3.4 槐角多糖清除羥基自由基試驗(yàn)

    參照Chen 等[11]方法調(diào)整,配置6 mmol/L 的硫酸亞鐵、6 mmol/L 水楊酸-乙醇試劑,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光存放。在10 mL 離心管中加入2 mL FeSO4溶液、樣品和H2O2(0.3%)各 2 mL,渦旋混勻,室溫(25 ℃)放置 10 min,加入 2 mL 水楊酸-乙醇試劑,37 ℃水浴 30 min,510 nm測(cè)吸光值記為Ai;以蒸餾水代替樣品反應(yīng),記為A1;樣品2 mL、蒸餾水4 mL 與2 mL 水楊酸-乙醇試劑混合反應(yīng),記為A0。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.5 槐角多糖抑制DNA 損傷試驗(yàn)

    采用 Fenton 反應(yīng)體系[12],取 200 μL 離心管冰浴操作,加入 1 μL 硫酸亞鐵溶液 (6 mmol/L)、2 μL 的pUC18 質(zhì)粒 DNA(0.5 mg/mL)和 5 μL 的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.2)渦旋混勻,加入 2 μL 樣品/對(duì)照,2 μL 的 H2O2(0.3%),37 ℃水浴孵育 30 min,與 2 μL的6×Loading Buffer 混勻。將凝膠板置于電泳儀中,上樣10 μL,150 V 電泳30 min,紫外熒光凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。

    1.3.4 數(shù)據(jù)處理

    使用 Excle 2016、SPSS 19.0 和 Origin 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)用平均值和方差表示顯示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除作用

    ABTS+自由基是ABTS 氧化后產(chǎn)生的,在734 nm處有高吸收峰,呈穩(wěn)定藍(lán)綠色,與抗氧化物結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)褪色的現(xiàn)象,故可用于測(cè)定抗氧化物質(zhì)的作用效果[13]?;苯嵌嗵菍?duì)ABTS+自由基清除活性見(jiàn)圖1。

    圖1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on ABTS+free radical

    如圖1 可知,樣品與ABTS+自由基清除率成量效關(guān)系,在最高試驗(yàn)濃度(6.40 mg/mL)時(shí),槐角多糖樣品SFP、SFP-1、SFP-2 和對(duì)照品 VC的 ABTS+自由基清除率分別是99.73 %、97.54 %、98.36 %、99.81 %。樣品SFP-1 和SFP-2 濃度低于3.20 mg/mL 時(shí)清除率隨樣品濃度升高變化速率快,高于3.20 mg/mL 之后趨于平緩;SFP 在濃度 0.05 mg/mL~0.80 mg/mL 時(shí),清除率隨樣品濃度升高變化速率較快,在濃度高于0.80 mg/mL后,上升趨于平穩(wěn)。

    2.2 槐角多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

    槐角多糖對(duì)DPPH 清除作用如圖2 所示。

    圖2 3 種槐角多糖對(duì)DPPH 自由基清除活性Fig.2 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on DPPH free radical

    多糖濃度與DPPH 自由基的清除率成正相關(guān)。當(dāng)濃度為 6.4 mg/mL 時(shí),槐角多糖 SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)DPPH 自由基平均清除率可達(dá)到64.94 %、87.05 %、86.65%?;苯嵌嗵荢FP 在濃度0.05 mg/mL 到3.20 mg/mL之間時(shí),隨濃度提高清除率上升迅速,在3.2 mg/mL 到6.4 mg/mL 之間時(shí)趨于平穩(wěn);槐角多糖純化分離的次級(jí)多糖SFP-1 和SFP-2 作用效果相似,隨濃度升高清除率出現(xiàn)交叉:在低濃度0.05 mg/mL~0.10 mg/mL時(shí)SFP-2 對(duì)DPPH 自由基清除率高于SFP-1,濃度在0.20 mg/mL~0.80 mg/mL 時(shí) SFP-1 對(duì) DPPH 自由基清除率高于SFP-2,在濃度為0.80 mg/mL 時(shí)二者對(duì)DPPH 自由基清除能力相同,之后隨濃度SFP-1 的清除率高于SFP-2,在6.4 mg/mL 時(shí)清除率接近相似。

    整體來(lái)看純化分離后的多糖SFP-1 和SFP-2 清除率高于槐角多糖SFP,推測(cè)可能與各組分中單糖組成、分子量、糖苷鍵、糖醛酸含量有關(guān)。此外,槐角多糖對(duì)ABTS 自由基和DPPH 自由基抑制作用基本一致,但對(duì)ABTS 自由基清除能力略高,其原因可能與自由基性質(zhì)有關(guān),ABTS 自由基更適合親水性抗氧化劑測(cè)評(píng)[14-15]。

    2.3 槐角多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

    超氧自由基是一種活性氧,可與其他分子反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基、單線態(tài)氧等物質(zhì),對(duì)機(jī)體造成直接和間接損傷?;苯嵌嗵菍?duì)超氧自由基清除活性見(jiàn)圖3。

    圖3 3 種槐角多糖對(duì)超氧自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on superoxide radical

    如圖3 槐角多糖樣品與對(duì)照品對(duì)超氧自由基清除能力呈量效關(guān)系,但VC的清除能力優(yōu)于測(cè)試多糖樣品溶液,在試驗(yàn)最高濃度(6.40 mg/mL)時(shí)對(duì)照品VC和槐角多糖SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率分別是 100.00 %、18.15 %、50.92 %、31.08 %?;苯嵌嗵荢FP-1 對(duì)超氧自由基清除能力優(yōu)于SFP 和SFP-2,在濃度0.40 mg/mL~3.20 mg/mL 之間時(shí)對(duì)超氧自由基抑制能力隨濃度升高變化快,超過(guò)3.20 mg/mL 后作用效果趨于平緩。

    綜合來(lái)看,槐角多糖SFP、SFP-1 和SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率表現(xiàn)出SFP-1>SFP-2>SFP,多糖的超氧自由基清除能力可能與O-H 鍵電離能力有關(guān),糖鏈上連接的羧基、醛基越多,O-H 鍵越難電離,清除超氧陰離子能力越強(qiáng)。SFP-1 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力較高,因而推斷SFP-1 可能含有較多的醛酸基團(tuán)[16]。

    2.4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除作用

    羥基自由基是機(jī)體中最為活躍的自由基,可對(duì)細(xì)胞造成直接損傷,是評(píng)價(jià)抗氧化的重要指標(biāo)?;苯嵌嗵菍?duì)OH-·的清除作用如圖4 所示。

    圖4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除活性Fig.4 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on hydroxyl radical

    在試驗(yàn)最高濃度 6.4 mg/mL 時(shí),VC和樣品SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力分別是98.68%、95.64%、87.49%、93.95%,VC溶液平均清除率均高于槐角多糖溶液。在較低濃度0.05 mg/mL~0.40 mg/mL 時(shí)SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力高于SFP-1,之后隨濃度升高SFP-2 清除能力略低于SFP-1,但在3.20 mg/mL~6.40 mg/mL 之間時(shí)再次超過(guò)SFP-1。對(duì)比槐角多糖SFP 與SFP-1 可知,當(dāng)溶液濃度低于1.6 mg/mL 時(shí)SFP對(duì)羥基自由基清除率高于SFP-1,但濃度在3.20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,SFP 對(duì)羥基自由基的清除率低于SFP-1,并在實(shí)驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí)再次高于SFP-1 的作用效果。清除OH-·能力與多糖中羥基數(shù)量、氨基基團(tuán)有關(guān),推測(cè)槐角多糖的糖鏈中含有較高的羥基含量,與單糖組成有關(guān)[17]。

    2.5 槐角多糖抑制DNA損傷作用

    羥基自由基可直接造成DNA 損傷,采用Fenton反應(yīng)測(cè)定槐角多糖對(duì)由羥基自由基造成DNA 損傷的抑制作用[18],結(jié)果如圖5 所示。

    圖5 槐角多糖抑制羥基自由基造成的DNA 損傷電泳圖Fig.5 DNA damage electrophoresis of SFP and SFP-1 inhibiting hydroxyl radicals

    對(duì)照組、試驗(yàn)組與空白組DNA 電泳條帶,均有不同程度的開(kāi)環(huán)和開(kāi)鏈現(xiàn)象;而與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組均表現(xiàn)出抑制DNA 損傷作用,樣品SFP 和SFP-1 隨濃度升高抑制DNA 損傷效果越明顯,在濃度3.2 mg/mL時(shí),SFP 的開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)含量高于SFP-1,即SFP 抑制DNA損傷能力低于SFP-1,在濃度6.4 mg/mL 時(shí),SFP 的開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)含量低于SFP-1,即SFP 抑制DNA 損傷作用高于SFP-1。

    3 結(jié)論

    槐角多糖通過(guò)自由基評(píng)價(jià)法對(duì)各組分抗氧化活性研究表明,雖然試驗(yàn)樣品溶液與對(duì)照品VC溶液相比抗氧化能力略低,但3 種純化分離的槐角多糖SFP、SFP-1 及SFP-2 均表現(xiàn)出較好的抗氧化作用。在試驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí),槐角多糖SFP 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基清除能力分別為99.73 %、64.94 %、18.15 %及95.64 %;槐角次級(jí)多糖SFP-1 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除率可達(dá)到97.54%、87.05%、50.92%及87.49%;槐角次級(jí)多糖SFP-2 對(duì)4 種自由基清除率依次為98.36%、86.65%、31.08%及93.95%。在羥基自由基抗氧化試驗(yàn)基礎(chǔ)上,槐角多糖SFP 和SFP-1 對(duì)DNA 損傷的抑制作用結(jié)果顯示,槐角多糖對(duì)羥基自由基造成的DNA 開(kāi)鏈、開(kāi)環(huán)有保護(hù)作用。研究說(shuō)明槐角多糖具有較好的抗氧化能力,其在生物制藥、保健食品、化妝品等方向具有一定的開(kāi)發(fā)潛力[19-20]。

    猜你喜歡
    槐角超氧吸光
    金色的吸管
    槐角有效成分的研究進(jìn)展
    Statistics
    China Textile(2017年10期)2017-12-25 12:43:00
    二氧化鈦光催化產(chǎn)生超氧自由基的形態(tài)分布研究
    熒光/化學(xué)發(fā)光探針成像檢測(cè)超氧陰離子自由基的研究進(jìn)展
    你把空氣全部吸光
    初中生(2016年1期)2016-04-14 20:13:15
    槐角茶緩解痔瘡
    半菁染料作為染料敏化太陽(yáng)能電池吸光材料的理論研究
    清熱潤(rùn)腸的槐角
    高效液相色譜法測(cè)定槐角總黃酮水解產(chǎn)物中染料木素和槐角苷含量
    亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲人成电影免费在线| 电影成人av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 超碰97精品在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 两个人免费观看高清视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 黑人猛操日本美女一级片| 电影成人av| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 999精品在线视频| 亚洲欧美清纯卡通| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产视频一区二区在线看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美中文综合在线视频| 美女午夜性视频免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 少妇被粗大的猛进出69影院| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 黄色视频在线播放观看不卡| 99国产综合亚洲精品| 亚洲少妇的诱惑av| 乱人伦中国视频| 男人舔女人的私密视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 人成视频在线观看免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜日韩欧美国产| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一级毛片女人18水好多| 最近最新免费中文字幕在线| 1024香蕉在线观看| 丝袜喷水一区| 亚洲第一av免费看| av在线app专区| 亚洲精品国产av蜜桃| 婷婷成人精品国产| 久久久欧美国产精品| a级毛片黄视频| 丝袜脚勾引网站| 国产亚洲精品一区二区www | 十八禁网站网址无遮挡| 中文字幕精品免费在线观看视频| www.熟女人妻精品国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久亚洲国产成人精品v| 国产不卡av网站在线观看| 黄色 视频免费看| 老司机靠b影院| 美女视频免费永久观看网站| 一级毛片女人18水好多| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产淫语在线视频| 久久中文字幕一级| a级片在线免费高清观看视频| 91成人精品电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 久热爱精品视频在线9| 一区二区三区四区激情视频| 制服人妻中文乱码| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 中文字幕高清在线视频| 多毛熟女@视频| 热99re8久久精品国产| 性少妇av在线| 人妻久久中文字幕网| 国产一区二区 视频在线| 91精品三级在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 免费观看a级毛片全部| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 永久免费av网站大全| 十八禁网站免费在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 精品视频人人做人人爽| 91成年电影在线观看| 一区在线观看完整版| 国产区一区二久久| av福利片在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲欧洲日产国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 高清av免费在线| bbb黄色大片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美精品av麻豆av| 高清在线国产一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| av片东京热男人的天堂| 我要看黄色一级片免费的| 看免费av毛片| 最新在线观看一区二区三区| 视频区图区小说| 国产国语露脸激情在线看| 人成视频在线观看免费观看| 香蕉国产在线看| 国产黄色免费在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 热re99久久国产66热| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品第二区| 在线观看人妻少妇| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久av网站| 黄色毛片三级朝国网站| 一区二区三区乱码不卡18| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲人成77777在线视频| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 一级毛片女人18水好多| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美少妇被猛烈插入视频| av天堂久久9| 国产精品av久久久久免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人精品在线电影| 电影成人av| 操美女的视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩免费高清中文字幕av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 热re99久久国产66热| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲国产精品一区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| av线在线观看网站| 免费观看人在逋| 视频区图区小说| 一级毛片女人18水好多| 男人爽女人下面视频在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99久久人妻综合| 国产欧美亚洲国产| 69av精品久久久久久 | 国产伦理片在线播放av一区| 捣出白浆h1v1| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产成人精品久久二区二区91| 十八禁人妻一区二区| 免费不卡黄色视频| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久久成人av| www.自偷自拍.com| 欧美激情极品国产一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 久久久精品94久久精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 丁香六月欧美| 他把我摸到了高潮在线观看 | 91精品国产国语对白视频| 日本欧美视频一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 超碰成人久久| 日本91视频免费播放| 国产一区二区三区综合在线观看| a在线观看视频网站| 亚洲av男天堂| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 黑人欧美特级aaaaaa片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | avwww免费| 人妻一区二区av| 欧美在线一区亚洲| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产成人免费观看mmmm| 首页视频小说图片口味搜索| 国产区一区二久久| 久久ye,这里只有精品| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品国产av成人精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美激情高清一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 69av精品久久久久久 | 成人手机av| 久久青草综合色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲天堂av无毛| 大片免费播放器 马上看| 精品一区二区三卡| 两人在一起打扑克的视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久中文字幕一级| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩电影二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 超碰97精品在线观看| 大型av网站在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 久久亚洲国产成人精品v| 操美女的视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 最近最新免费中文字幕在线| 不卡av一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| av天堂久久9| tube8黄色片| 国产欧美日韩一区二区精品| 97精品久久久久久久久久精品| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利视频精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产激情久久老熟女| av线在线观看网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级a爱视频在线免费观看| av欧美777| 日韩大码丰满熟妇| 美女国产高潮福利片在线看| 老司机影院毛片| 人人澡人人妻人| 在线观看一区二区三区激情| 欧美成狂野欧美在线观看| www日本在线高清视频| www.av在线官网国产| 国产高清videossex| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品一二三区在线看| 国产成人精品无人区| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美另类一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99香蕉大伊视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产日韩一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 老司机靠b影院| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美日韩av久久| 99国产综合亚洲精品| 黄色怎么调成土黄色| 国产免费av片在线观看野外av| 一本色道久久久久久精品综合| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 91国产中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 大陆偷拍与自拍| 啦啦啦在线免费观看视频4| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产在线一区二区三区精| 一区在线观看完整版| 99热全是精品| 男女边摸边吃奶| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产三级黄色录像| av国产精品久久久久影院| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品国产一区二区三区四区第35| av又黄又爽大尺度在线免费看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲一区二区精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁网站免费在线| 制服人妻中文乱码| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲,欧美精品.| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久av美女十八| 日韩大片免费观看网站| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 大码成人一级视频| 青春草视频在线免费观看| 久久久久视频综合| 免费少妇av软件| 国产成人免费观看mmmm| 国产日韩欧美亚洲二区| 操美女的视频在线观看| av在线老鸭窝| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲伊人色综图| 免费观看a级毛片全部| 免费日韩欧美在线观看| 一个人免费看片子| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产av一区二区精品久久| a在线观看视频网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 婷婷成人精品国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 青春草亚洲视频在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 9色porny在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 黄色a级毛片大全视频| 国产一卡二卡三卡精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品一区二区免费欧美 | 黑人猛操日本美女一级片| 国产真人三级小视频在线观看| 精品久久蜜臀av无| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲国产av影院在线观看| 99久久人妻综合| 亚洲伊人久久精品综合| 丝袜喷水一区| 婷婷丁香在线五月| 一区福利在线观看| 男女国产视频网站| 国产一卡二卡三卡精品| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久网色| 这个男人来自地球电影免费观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 99久久国产精品久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 2018国产大陆天天弄谢| 另类亚洲欧美激情| 黄片播放在线免费| 日韩三级视频一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产av精品麻豆| 精品久久久精品久久久| 免费观看av网站的网址| 在线 av 中文字幕| 中亚洲国语对白在线视频| 秋霞在线观看毛片| 久久久国产成人免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本vs欧美在线观看视频| 男女午夜视频在线观看| 高清av免费在线| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 他把我摸到了高潮在线观看 | 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利在线观看吧| 国产视频一区二区在线看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 精品一区二区三卡| 国产精品一区二区在线不卡| 黄色视频不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩av久久| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 老司机靠b影院| 国产黄色免费在线视频| av在线播放精品| 999久久久国产精品视频| 另类精品久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | www.999成人在线观看| 中文字幕色久视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美中文综合在线视频| 亚洲 国产 在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 伊人亚洲综合成人网| 亚洲欧美一区二区三区久久| 十八禁网站网址无遮挡| svipshipincom国产片| 精品亚洲成国产av| 久久精品国产a三级三级三级| 我要看黄色一级片免费的| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲成人手机| 国产精品二区激情视频| 性少妇av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜福利乱码中文字幕| av网站在线播放免费| 午夜免费成人在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲熟女毛片儿| 欧美精品一区二区大全| 国产亚洲精品一区二区www | 国产精品久久久av美女十八| 五月开心婷婷网| 国产一区二区 视频在线| 国产在线观看jvid| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲成人免费av在线播放| 少妇的丰满在线观看| 91成人精品电影| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产日韩欧美在线精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲中文字幕日韩| 免费高清在线观看视频在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 99久久综合免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产高清videossex| 日韩精品免费视频一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 制服诱惑二区| 我的亚洲天堂| 午夜福利,免费看| 人人澡人人妻人| 亚洲av美国av| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 国产激情久久老熟女| 无遮挡黄片免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 超碰97精品在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 大香蕉久久网| 国产成人av激情在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 悠悠久久av| 99香蕉大伊视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人国语在线视频| 欧美97在线视频| 欧美中文综合在线视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产高清国产精品国产三级| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费在线观看日本一区| 久久久国产精品麻豆| 99九九在线精品视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | av超薄肉色丝袜交足视频| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久精品94久久精品| avwww免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲第一青青草原| 国产99久久九九免费精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99久久综合免费| 国产亚洲精品久久久久5区| av电影中文网址| 成年美女黄网站色视频大全免费| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品一区二区在线不卡| 精品福利观看| 久久免费观看电影| 亚洲精品第二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩一区二区三区影片| 久久九九热精品免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男人操女人黄网站| 成人国产一区最新在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产深夜福利视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品亚洲av一区麻豆| 五月天丁香电影| 天天影视国产精品| 2018国产大陆天天弄谢| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美 | 成人国产av品久久久| 老司机靠b影院| 欧美日韩福利视频一区二区| 蜜桃国产av成人99| 久久久国产成人免费| av线在线观看网站| av片东京热男人的天堂| 国产高清国产精品国产三级| 性色av一级| 久9热在线精品视频| 久久久久久人人人人人| 精品国产一区二区久久| 亚洲全国av大片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产97色在线日韩免费| 考比视频在线观看| 精品第一国产精品| 国产成人精品在线电影| a级毛片黄视频| 999精品在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人国产一区最新在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一本色道久久久久久精品综合| 国产淫语在线视频| 久久热在线av| 久久久国产精品麻豆| 老司机亚洲免费影院| 最新的欧美精品一区二区| 18禁观看日本| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 国产精品一区二区在线不卡| 在线精品无人区一区二区三| 在线观看免费高清a一片| 国产男女超爽视频在线观看| 超碰成人久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丰满饥渴人妻一区二区三| 91精品三级在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美日韩av久久| 国产黄色免费在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品九九99| 日韩免费高清中文字幕av| 中国美女看黄片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩大片免费观看网站| 午夜免费观看性视频| 国产一区二区 视频在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 手机成人av网站| 男人操女人黄网站| 国产精品影院久久| 欧美中文综合在线视频| 欧美午夜高清在线| 天堂8中文在线网| 久久久国产精品麻豆| 9热在线视频观看99| av福利片在线| 美女午夜性视频免费| 精品第一国产精品| 国产男女超爽视频在线观看| 曰老女人黄片| 国产色视频综合| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 在线观看www视频免费|