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    槐角多糖抗氧化活性研究

    2020-03-09 08:45:44王杰劉瑞珍劉東超李慧劉忠華
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:槐角超氧吸光

    王杰,劉瑞珍,劉東超,李慧,劉忠華,*

    (1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083;2.煙臺(tái)市森林資源監(jiān)測(cè)保護(hù)服務(wù)中心,山東煙臺(tái)264013)

    槐角是一種傳統(tǒng)中藥材,以其為原料制成的槐角茶有軟化血管、疏風(fēng)熱、抑菌消炎、潤(rùn)腸通便之效,尤其對(duì)降三高有極好療效,受到廣大老年人的歡迎。槐角藥理功能源于其中的活性物質(zhì)組分,如黃酮、異黃酮以及三萜皂苷等[1-3],隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展,更多活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn),其主要成分多糖也受到研究關(guān)注[4],方艷夕等[5]研究發(fā)現(xiàn)槐角多糖中主要單糖成分為葡萄糖、果糖;槐角果皮多糖和種子多糖有吸濕保濕的作用,對(duì)自由基有一定清除作用[6]。但目前對(duì)槐角多糖抗氧化活性研究相對(duì)較少,本文以提取的槐角多糖為試驗(yàn)材料,采用自由基評(píng)定法對(duì)ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH 自由基進(jìn)行了抗氧化活性研究,以期為槐角多糖的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 試驗(yàn)材料

    槐角:河北國(guó)安藥材批發(fā)市場(chǎng),產(chǎn)自河北國(guó)安地區(qū)。挑選顏色均勻、形態(tài)飽滿、果莢完好、無(wú)病蟲(chóng)害的槐角,自然晾干,60 ℃烘干 2 h,粉碎、過(guò) 20 目篩,干燥存儲(chǔ)。

    1.1.2 試劑

    果膠酶(40 U/mg)、纖維素酶(100 U/mg)、EDAE-52 纖維素柱料、ABTS、DPPH、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、FeSO4、水楊酸、30%H2O2試劑、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇:北京化工廠;pUC18 質(zhì)粒(Takera)、DNA Marker(DL5000)、6×Loading Buffer、Golden View 核酸染料:北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    分析天平(ML104/02):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī)(CT15RT):美國(guó)Sigma公司;真空冷凍干燥機(jī)(FD-80):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司;紫外分光光度計(jì)(UV-1100):上海美譜達(dá)儀器有限公司;酶標(biāo)儀(Infinite):瑞士 Tecan 集團(tuán);電泳儀(Power Pac)、紫外熒光凝膠成像儀(Chemi Doc XRS+):美國(guó)BIO-RAD。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 槐角多糖提取及分離純化

    1.3.1.1 槐角多糖提取

    參照李彩霞等[6]方法,采用超聲輔助復(fù)合酶解法水提槐角多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g 槐角粉加入100 mL 蒸餾水,200 W 超聲處理20 min 后加入0.05 %混合酶(果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比 1 ∶1),50 ℃水浴 60 min,沸水浴滅酶5 min,6 000 r/min 離心10 min,清液減壓濃縮,加3 倍95%乙醇過(guò)夜,離心,沉淀加水復(fù)溶,加入1/4 體積的Sevage 試劑[7](三氯甲烷與正丁醇體積比4 ∶1),重復(fù) 3~4 次,上清液醇沉過(guò)夜,沉淀于-80 ℃預(yù)冷12 h,再轉(zhuǎn)至-80 ℃真空冷凍干燥得到槐角多糖(sophorae fructus polysaccharides,SFP)。

    1.3.1.2 槐角多糖純化

    將槐角多糖(SFP)用中性去離子水配成100 mg/mL的多糖溶液,取10 mL 離心,上清液緩慢加入DEAE-52 纖維素層析柱,待SFP 全部進(jìn)入柱料后,向?qū)游鲋屑訚M去離子水,流速為1.0 mL/min,8 mL 每管。分別用 0、0.1、0.3、0.7 mol/L 的 NaCl 溶液線性梯度洗脫。將蒸餾水洗脫組分合并、濃縮、真空冷凍干燥,得槐角次級(jí)多糖SFP-1;將NaCl 溶液洗脫的酸性多糖合并、透析、再濃縮后真空冷凍干燥,得到槐角次級(jí)多糖SFP-2[8]。

    1.3.2 槐角多糖溶液配制

    精確稱(chēng)量0.64 g 槐角多糖SFP 及純化分離后的SFP-1、SFP-2,配制成6.40 mg/mL 的多糖母液,按二倍稀釋法稀釋成 3.20、1.60、0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL的樣品溶液,4 ℃存放。

    1.3.3 槐角多糖抗氧化試驗(yàn)

    1.3.3.1 槐角多糖清除ABTS+自由基試驗(yàn)

    參照 Yang 等[9]方法修改,ABTS(7.4 mmol/L)與K2S2O8(2.6 mmol/L)等體積混合,4 ℃遮光12 h,用前稀釋至734 nm 吸光值為0.700±0.020。準(zhǔn)確吸取樣品和ABTS 試劑各2 mL,暗反應(yīng)6 min,立即于734 nm 測(cè)吸光值,記為Ai;以等量蒸餾水替代樣品,記為A0;2 mL樣品與2 mL 的95%乙醇混勻,同樣反應(yīng)時(shí)間和波長(zhǎng)下測(cè)吸光值,記為A1。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.2 槐角多糖清除DPPH 自由基試驗(yàn)

    參照 Gong 等[10]方法,精確配制 0.15 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品與DPPH 溶液各2 mL混勻,暗反應(yīng) 30 min,517 nm 測(cè)吸光值,記為 Ai;蒸餾水替代樣品與2 mL 的DPPH 溶液反應(yīng),同樣操作,記為A0;2 mL 的95%乙醇與2 mL 樣品混合反應(yīng),吸光值記為A1。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.3 槐角多糖清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)

    采用鄰苯三酚自氧化法,向反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的樣品溶液 SFP、SFP-1、SFP-2 各 1 mL,4.5 mL Tris-HCl[50 mmol/L pH(8.1±0.1)]和 3.2 mL 蒸餾水,37 ℃水浴 20 min 后加入 0.3 mL 鄰苯三酚(5 mmol/L),于325 nm 處每隔30 s 記錄一次數(shù)值(以10 mmol/L 的HCl 調(diào)零),測(cè) 5 min,計(jì)算反應(yīng)速度斜率 ΔAi;對(duì)照組以蒸餾水代替樣品測(cè)吸光值變化斜率,記為ΔA0。

    式中:ΔAi為樣品吸光值變化的斜率;ΔA0為對(duì)照組吸光值變化的斜率。

    1.3.3.4 槐角多糖清除羥基自由基試驗(yàn)

    參照Chen 等[11]方法調(diào)整,配置6 mmol/L 的硫酸亞鐵、6 mmol/L 水楊酸-乙醇試劑,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光存放。在10 mL 離心管中加入2 mL FeSO4溶液、樣品和H2O2(0.3%)各 2 mL,渦旋混勻,室溫(25 ℃)放置 10 min,加入 2 mL 水楊酸-乙醇試劑,37 ℃水浴 30 min,510 nm測(cè)吸光值記為Ai;以蒸餾水代替樣品反應(yīng),記為A1;樣品2 mL、蒸餾水4 mL 與2 mL 水楊酸-乙醇試劑混合反應(yīng),記為A0。

    式中:Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值;A1為對(duì)照組吸光值;A0為空白組吸光值。

    1.3.3.5 槐角多糖抑制DNA 損傷試驗(yàn)

    采用 Fenton 反應(yīng)體系[12],取 200 μL 離心管冰浴操作,加入 1 μL 硫酸亞鐵溶液 (6 mmol/L)、2 μL 的pUC18 質(zhì)粒 DNA(0.5 mg/mL)和 5 μL 的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.2)渦旋混勻,加入 2 μL 樣品/對(duì)照,2 μL 的 H2O2(0.3%),37 ℃水浴孵育 30 min,與 2 μL的6×Loading Buffer 混勻。將凝膠板置于電泳儀中,上樣10 μL,150 V 電泳30 min,紫外熒光凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。

    1.3.4 數(shù)據(jù)處理

    使用 Excle 2016、SPSS 19.0 和 Origin 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)用平均值和方差表示顯示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除作用

    ABTS+自由基是ABTS 氧化后產(chǎn)生的,在734 nm處有高吸收峰,呈穩(wěn)定藍(lán)綠色,與抗氧化物結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)褪色的現(xiàn)象,故可用于測(cè)定抗氧化物質(zhì)的作用效果[13]?;苯嵌嗵菍?duì)ABTS+自由基清除活性見(jiàn)圖1。

    圖1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on ABTS+free radical

    如圖1 可知,樣品與ABTS+自由基清除率成量效關(guān)系,在最高試驗(yàn)濃度(6.40 mg/mL)時(shí),槐角多糖樣品SFP、SFP-1、SFP-2 和對(duì)照品 VC的 ABTS+自由基清除率分別是99.73 %、97.54 %、98.36 %、99.81 %。樣品SFP-1 和SFP-2 濃度低于3.20 mg/mL 時(shí)清除率隨樣品濃度升高變化速率快,高于3.20 mg/mL 之后趨于平緩;SFP 在濃度 0.05 mg/mL~0.80 mg/mL 時(shí),清除率隨樣品濃度升高變化速率較快,在濃度高于0.80 mg/mL后,上升趨于平穩(wěn)。

    2.2 槐角多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

    槐角多糖對(duì)DPPH 清除作用如圖2 所示。

    圖2 3 種槐角多糖對(duì)DPPH 自由基清除活性Fig.2 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on DPPH free radical

    多糖濃度與DPPH 自由基的清除率成正相關(guān)。當(dāng)濃度為 6.4 mg/mL 時(shí),槐角多糖 SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)DPPH 自由基平均清除率可達(dá)到64.94 %、87.05 %、86.65%?;苯嵌嗵荢FP 在濃度0.05 mg/mL 到3.20 mg/mL之間時(shí),隨濃度提高清除率上升迅速,在3.2 mg/mL 到6.4 mg/mL 之間時(shí)趨于平穩(wěn);槐角多糖純化分離的次級(jí)多糖SFP-1 和SFP-2 作用效果相似,隨濃度升高清除率出現(xiàn)交叉:在低濃度0.05 mg/mL~0.10 mg/mL時(shí)SFP-2 對(duì)DPPH 自由基清除率高于SFP-1,濃度在0.20 mg/mL~0.80 mg/mL 時(shí) SFP-1 對(duì) DPPH 自由基清除率高于SFP-2,在濃度為0.80 mg/mL 時(shí)二者對(duì)DPPH 自由基清除能力相同,之后隨濃度SFP-1 的清除率高于SFP-2,在6.4 mg/mL 時(shí)清除率接近相似。

    整體來(lái)看純化分離后的多糖SFP-1 和SFP-2 清除率高于槐角多糖SFP,推測(cè)可能與各組分中單糖組成、分子量、糖苷鍵、糖醛酸含量有關(guān)。此外,槐角多糖對(duì)ABTS 自由基和DPPH 自由基抑制作用基本一致,但對(duì)ABTS 自由基清除能力略高,其原因可能與自由基性質(zhì)有關(guān),ABTS 自由基更適合親水性抗氧化劑測(cè)評(píng)[14-15]。

    2.3 槐角多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

    超氧自由基是一種活性氧,可與其他分子反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基、單線態(tài)氧等物質(zhì),對(duì)機(jī)體造成直接和間接損傷?;苯嵌嗵菍?duì)超氧自由基清除活性見(jiàn)圖3。

    圖3 3 種槐角多糖對(duì)超氧自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on superoxide radical

    如圖3 槐角多糖樣品與對(duì)照品對(duì)超氧自由基清除能力呈量效關(guān)系,但VC的清除能力優(yōu)于測(cè)試多糖樣品溶液,在試驗(yàn)最高濃度(6.40 mg/mL)時(shí)對(duì)照品VC和槐角多糖SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率分別是 100.00 %、18.15 %、50.92 %、31.08 %?;苯嵌嗵荢FP-1 對(duì)超氧自由基清除能力優(yōu)于SFP 和SFP-2,在濃度0.40 mg/mL~3.20 mg/mL 之間時(shí)對(duì)超氧自由基抑制能力隨濃度升高變化快,超過(guò)3.20 mg/mL 后作用效果趨于平緩。

    綜合來(lái)看,槐角多糖SFP、SFP-1 和SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率表現(xiàn)出SFP-1>SFP-2>SFP,多糖的超氧自由基清除能力可能與O-H 鍵電離能力有關(guān),糖鏈上連接的羧基、醛基越多,O-H 鍵越難電離,清除超氧陰離子能力越強(qiáng)。SFP-1 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力較高,因而推斷SFP-1 可能含有較多的醛酸基團(tuán)[16]。

    2.4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除作用

    羥基自由基是機(jī)體中最為活躍的自由基,可對(duì)細(xì)胞造成直接損傷,是評(píng)價(jià)抗氧化的重要指標(biāo)?;苯嵌嗵菍?duì)OH-·的清除作用如圖4 所示。

    圖4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除活性Fig.4 Scavenging activity of SFP,SFP-1,SFP-2 on hydroxyl radical

    在試驗(yàn)最高濃度 6.4 mg/mL 時(shí),VC和樣品SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力分別是98.68%、95.64%、87.49%、93.95%,VC溶液平均清除率均高于槐角多糖溶液。在較低濃度0.05 mg/mL~0.40 mg/mL 時(shí)SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力高于SFP-1,之后隨濃度升高SFP-2 清除能力略低于SFP-1,但在3.20 mg/mL~6.40 mg/mL 之間時(shí)再次超過(guò)SFP-1。對(duì)比槐角多糖SFP 與SFP-1 可知,當(dāng)溶液濃度低于1.6 mg/mL 時(shí)SFP對(duì)羥基自由基清除率高于SFP-1,但濃度在3.20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,SFP 對(duì)羥基自由基的清除率低于SFP-1,并在實(shí)驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí)再次高于SFP-1 的作用效果。清除OH-·能力與多糖中羥基數(shù)量、氨基基團(tuán)有關(guān),推測(cè)槐角多糖的糖鏈中含有較高的羥基含量,與單糖組成有關(guān)[17]。

    2.5 槐角多糖抑制DNA損傷作用

    羥基自由基可直接造成DNA 損傷,采用Fenton反應(yīng)測(cè)定槐角多糖對(duì)由羥基自由基造成DNA 損傷的抑制作用[18],結(jié)果如圖5 所示。

    圖5 槐角多糖抑制羥基自由基造成的DNA 損傷電泳圖Fig.5 DNA damage electrophoresis of SFP and SFP-1 inhibiting hydroxyl radicals

    對(duì)照組、試驗(yàn)組與空白組DNA 電泳條帶,均有不同程度的開(kāi)環(huán)和開(kāi)鏈現(xiàn)象;而與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組均表現(xiàn)出抑制DNA 損傷作用,樣品SFP 和SFP-1 隨濃度升高抑制DNA 損傷效果越明顯,在濃度3.2 mg/mL時(shí),SFP 的開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)含量高于SFP-1,即SFP 抑制DNA損傷能力低于SFP-1,在濃度6.4 mg/mL 時(shí),SFP 的開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)含量低于SFP-1,即SFP 抑制DNA 損傷作用高于SFP-1。

    3 結(jié)論

    槐角多糖通過(guò)自由基評(píng)價(jià)法對(duì)各組分抗氧化活性研究表明,雖然試驗(yàn)樣品溶液與對(duì)照品VC溶液相比抗氧化能力略低,但3 種純化分離的槐角多糖SFP、SFP-1 及SFP-2 均表現(xiàn)出較好的抗氧化作用。在試驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí),槐角多糖SFP 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基清除能力分別為99.73 %、64.94 %、18.15 %及95.64 %;槐角次級(jí)多糖SFP-1 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除率可達(dá)到97.54%、87.05%、50.92%及87.49%;槐角次級(jí)多糖SFP-2 對(duì)4 種自由基清除率依次為98.36%、86.65%、31.08%及93.95%。在羥基自由基抗氧化試驗(yàn)基礎(chǔ)上,槐角多糖SFP 和SFP-1 對(duì)DNA 損傷的抑制作用結(jié)果顯示,槐角多糖對(duì)羥基自由基造成的DNA 開(kāi)鏈、開(kāi)環(huán)有保護(hù)作用。研究說(shuō)明槐角多糖具有較好的抗氧化能力,其在生物制藥、保健食品、化妝品等方向具有一定的開(kāi)發(fā)潛力[19-20]。

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