EGCG與乳清蛋白相互作用的光譜分析

吳云雪，李娟，高晴，董文明，和勁松

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

茶多酚是茶葉中有保健功能的主要成分，其中兒茶素類約占茶多酚總量的60%～80%[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶葉中含量最為豐富的一種兒茶素，約占茶葉中總兒茶素含量的50%～60%[2]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、預(yù)防心腦血管疾病等活性，但穩(wěn)定性差的特點(diǎn)導(dǎo)致其生物利用率較低[3]。乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分之一[4]，將乳清蛋白高度濃縮可制得乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白質(zhì)含量在90%以上[5]，是公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一。

食品中不同成分之間發(fā)生的相互作用會影響食品的營養(yǎng)、質(zhì)地、安全性等，茶多酚與蛋白質(zhì)的相互作用會影響茶多酚的抗氧化活性以及蛋白質(zhì)的功能特性。Mariana 等[6]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白會影響綠茶的抗氧化活性和抑菌性。Avi 等[7]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與茶多酚的相互作用能夠提高茶多酚的穩(wěn)定性。徐潔瓊等[8]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化可影響其與茶多酚的相互作用。關(guān)于EGCG 與乳清蛋白間相互作用的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用紫外吸收光譜、導(dǎo)數(shù)光譜、熒光光譜研究EGCG與WPI 間的相互作用，以期為功能食品的開發(fā)以及茶多酚在蛋白食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白粉（蛋白質(zhì)含量＞95%）：美國Le Sueur Cheese 公司；EGCG（純度 98%）：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；所用分析用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XK96-A 型快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；FE20 型實(shí)驗(yàn)室2、3 計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UPG-752 紫外可見分光光度計(jì)：北京優(yōu)譜通用科技有限公司；F96Pro 型熒光分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；601 型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉配制不同pH（pH 范圍2.0～9.0、離子濃度為0.10 mol/L）和不同離子濃度（pH 為 3.0、離子濃度范圍 0.10 mol/L～0.20 mol/L）的磷酸鹽緩沖液，并以此為溶劑配制濃度為1.0 mg/mL的WPI 溶液，以及濃度為1.2 mg/mL 的EGCG 溶液。

1.3.2 光譜分析

1.3.2.1 紫外-可見吸收光譜分析

向試管中依次加入2.0 mL 磷酸鹽緩沖液，2.0 mL 1.0 mg/mL WPI 溶液和一定量1.2 mg/mL EGCG 溶液，用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充至5.0 mL，在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h 后取出，掃描260 nm～340 nm 波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜；對吸收曲線求二階、四階導(dǎo)數(shù)，得到相應(yīng)導(dǎo)數(shù)光譜。

1.3.2.2 熒光光譜分析

配制上述溶液，選擇激發(fā)波長280 nm、掃描速率3 000 nm/min，測定其在280 nm～440 nm 波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm/5 nm。

溶液中WPI 作為熒光物質(zhì)分子和猝滅劑EGCG分子發(fā)生相互碰撞引起的熒光猝滅過程由Stern-Volmer 方程描述[9]：

式中：F0和F 分別是不存在和存在猝滅劑時WPI溶液的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L；Ksv為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，L/mol；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；Ksv=Kq×τ0；τ0為不存在猝滅劑時熒光分子的壽命，生物大分子的平均壽命約為1×10-8s[10]。

當(dāng)熒光體為生物大分子時，其最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2×1010L/（mol·s），將經(jīng)公式（1）計(jì)算得到的Kq與之比較，若Kq＞2×1010L/（mol·s），則屬于靜態(tài)猝滅；若Kq＜2×1010L/（mol·s），則屬于動態(tài)猝滅。

對于靜態(tài)猝滅，可采用下式計(jì)算結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[11]：

式中：F0和F 分別是不存在和存在猝滅劑時WPI溶液的熒光強(qiáng)度；KA為表觀結(jié)合常數(shù)，L/mol；n 為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L。

通過log[（F0-F）/F]和log[Q]作圖可求出結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Origin Pro 8.5.1 軟件進(jìn)行繪圖，本文采用SPSS 19 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對WPI紫外吸收光譜的影響

紫外吸收光譜是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的一種簡單可靠的方法[12]。小分子與蛋白質(zhì)的相互作用會引起蛋白質(zhì)吸收譜的紅移與藍(lán)移，或信號的增強(qiáng)與減色。圖1 顯示了pH 值為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 和pH值為3.0、離子濃度為0.15 mol/L 條件下不同濃度EGCG 對WPI 紫外吸收光譜的影響。

圖1 不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of EGCG concentration on the UV-Vis absorption spectrum of WPI

如圖1，當(dāng) WPI 溶液中不含 EGCG 時，WPI 在 280 nm附近有最大吸收峰，隨著WPI 溶液中EGCG 濃度的增加，WPI 的紫外吸收光譜峰值隨之增大，并且發(fā)生藍(lán)移，最大吸收峰波長由280 nm 移至276.4 nm。此外，在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH 值（分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及 pH 值為 3.0，不同離子濃度（分別為0.10、0.20 mol/L）條件下均觀察到類似現(xiàn)象，如圖2、圖3。

孟麗艷等[13]研究了大黃酚與牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)加入大黃酚可使牛血清白蛋白的紫外吸收光譜發(fā)生明顯的變化。劉勤勤等[14]研究了茶多酚對大豆分離蛋白紫外吸收光譜的影響，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的紫外吸收光譜峰值隨加入茶多酚濃度的增加而升高，并且發(fā)生藍(lán)移。本研究結(jié)果與上述基本一致，表明加入EGCG 可使WPI 生色團(tuán)所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致WPI 吸光度增大。

圖2 不同pH 值條件下，不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.2 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different pH

圖3 不同離子濃度條件下，不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different ion concentration

2.2 EGCG對WPI導(dǎo)數(shù)光譜的影響

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是天然氨基酸中僅有的在近紫外光區(qū)具有吸收光譜的3 種組分，但由于它們在240 nm～300 nm 范圍內(nèi)的吸收峰會發(fā)生重疊[15]，因此選用高靈敏度、高分辨率和具有良好再現(xiàn)性的導(dǎo)數(shù)光譜法[16]進(jìn)一步探究EGCG 對WPI 結(jié)構(gòu)的影響。不同濃度EGCG 對WPI 溶液導(dǎo)數(shù)光譜的影響見圖4。

圖4 不同濃度EGCG 對WPI 溶液導(dǎo)數(shù)光譜的影響Fig.4 Effect of EGCG concentration on the derivative spectrum of WPI

由圖4 可知，WPI 的四階導(dǎo)數(shù)光譜在284 nm 和291 nm 附近有兩個尖銳的波峰，分別是酪氨酸和色氨酸的特征重疊峰以及色氨酸的特征吸收峰[17]，隨著加入EGCG 濃度的增大，這兩種峰的位置發(fā)生了變化。當(dāng)pH 值為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 時，分別由284.6 nm 和 291.5 nm 移至 284.8 nm 和 291.6 nm 處；當(dāng)pH 為3.0、離子濃度為0.15 mol/L 時，分別由281.1 nm和287.9 nm 移至281.9 nm 和287.7 nm 處。同樣地，WPI 的二階導(dǎo)數(shù)光譜在284 nm 和291 nm 附近相應(yīng)位置處有這兩種氨基酸的負(fù)吸收峰。隨著加入EGCG 濃度的增大，對應(yīng)特征峰的位置發(fā)生了類似的變化。當(dāng)pH 為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 時，分別由284.1 nm和 291.7 nm 移至 284.2 和 291.6 nm 處；當(dāng) pH 為 3.0、離子濃度為0.15 mol/L 時，酪氨酸和色氨酸的特征重疊峰的位置由284.1 nm 移至283.7 nm 處，而色氨酸特征峰波長則無明顯變化。在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH（分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及pH 為 3.0，不同離子濃度（分別為 0.10、0.20 mol/L）條件下均觀察到兩種峰位變化的類似現(xiàn)象（圖略）。

寧愛民等[18]利用導(dǎo)數(shù)光譜研究了牛血清白蛋白與十二烷基硫酸鈉的相互作用，發(fā)現(xiàn)隨著十二烷基硫酸鈉濃度的增大，牛血清白蛋白分子中芳香族氨基酸微環(huán)境極性的變化趨勢不同。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，EGCG 通過影響WPI 分子中酪氨酸和色氨酸所處的微環(huán)境使WPI 分子構(gòu)象發(fā)生改變，紫外吸收發(fā)生明顯變化，EGCG 與WPI 之間存在相互作用。

2.3 EGCG對WPI熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能夠發(fā)射熒光，含有這3 種氨基酸的蛋白質(zhì)均屬于內(nèi)源性熒光物質(zhì)，因此熒光光譜法常被用于探究蛋白質(zhì)與小分子間的相互作用。在280 nm 激發(fā)波長下，色氨酸和酪氨酸均能發(fā)射熒光，但當(dāng)激發(fā)波長為295 nm 時，只有色氨酸能夠發(fā)射熒光[19]。不同濃度EGCG 對WPI 溶液熒光發(fā)射光譜的影響見圖5。

由圖5 可知，當(dāng)激發(fā)波長為280 nm 時，WPI 在波長330 nm 附近發(fā)射熒光。固定WPI 溶液濃度不變，向其中加入EGCG，結(jié)果表明隨著EGCG 濃度的增加，WPI 的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低，最大發(fā)射波長發(fā)生輕微移動。在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH 值（分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及 pH 為 3.0，不同離子濃度（分別為0.10 mol/L、0.20 mol/L）條件下均觀察到相同現(xiàn)象，這說明EGCG 對WPI 的內(nèi)源熒光有猝滅作用。

圖5 不同濃度EGCG 對WPI 溶液熒光發(fā)射光譜的影響Fig.5 Effect of EGCG concentration on fluorescence emission spectrum of WPI

2.4 熒光猝滅機(jī)制分析

根據(jù)不同pH 值和不同離子濃度條件下WPI 的熒光猝滅光譜，繪制F0/F 隨[Q]變化的Stern-Volmer 關(guān)系圖，經(jīng)線性擬合得圖6，由圖中直線的斜率可計(jì)算出EGCG 與 WPI 相互作用的 Ksv和 Kq，結(jié)果見表1、表2。

圖6 不同pH 值和不同離子濃度條件下EGCG 猝滅WPI 的Stern-Volmer 曲線圖Fig.6 Stern-Volmer plots of WPI quenched by EGCG at different pH and different ion concentrations

表1 不同pH 值條件下EGCG-WPI 復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表2 不同離子濃度條件下EGCG-WPI 復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

由圖6 可知，EGCG 對 WPI 的 Stern-Volmer 曲線大部分呈非直線關(guān)系（R2＜0.98），表明 EGCG 對 WPI 的猝滅機(jī)制并不完全是動態(tài)猝滅，且雙分子猝滅常數(shù)都在1013L/（mol·s）數(shù)量級（表1、表2），均遠(yuǎn)大于最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L/（mol·s），說明EGCG 對WPI 的熒光猝滅機(jī)制屬于生成了不發(fā)光復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

在不同pH 值條件下，Stern-Volmer 猝滅常數(shù)隨pH 值的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。這可能與pH值影響蛋白質(zhì)分子表面電荷量有關(guān)，β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分，等電點(diǎn)在5.13 附近[20]，此時蛋白質(zhì)分子表面不帶電荷，因此pH 5.0 時Stern-Volmer 猝滅常數(shù)最小。在不同離子濃度條件下，Stern-Volmer 猝滅常數(shù)隨離子濃度的增大而增大，這可能是因?yàn)樵龃箅x子濃度能夠屏蔽靜電排斥作用，但不會影響EGCG 與WPI 之間的靜電吸引作用，導(dǎo)致EGCG 與WPI 之間的吸附量增加。由此推測在EGCG 與WPI 的相互作用中存在靜電作用力。

2.5 EGCG與WPI結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

根據(jù)公式（2），繪制lg[（F0-F）/F]隨lg[Q]變化的雙對數(shù)關(guān)系圖，經(jīng)線性擬合得圖7，由直線截距和斜率可計(jì)算出EGCG 與WPI 間相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見表3、表4。

表3 不同pH 值條件下EGCG-WPI 復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表4 不同離子濃度條件下EGCG-WPI 復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 4 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

如圖7 所示，EGCG 對WPI 猝滅的雙對數(shù)圖呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。不同條件下EGCG 與WPI 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n 均在 1 左右（表3、表4），說明 WPI 僅提供一個位點(diǎn)與EGCG 結(jié)合。在不同pH 值條件下，結(jié)合常數(shù)KA隨pH 值的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢；在不同離子濃度條件下，結(jié)合常數(shù)KA隨離子濃度的增大而增大，進(jìn)一步表明EGCG 與WPI 的相互作用中存在靜電作用力。

3 結(jié)論

EGCG 可改變WPI 分子中芳香族氨基酸的微環(huán)境，使WPI 的分子構(gòu)象發(fā)生改變，并能有規(guī)律的猝滅WPI 的內(nèi)源熒光，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，二者形成了復(fù)合物，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1。pH 值和離子濃度都是影響EGCG 與WPI 相互作用的外界因素，EGCG 與WPI結(jié)合常數(shù)在pH 2.0～9.0 范圍內(nèi)隨pH 值的增大先減小后增大，在離子濃度0.10 mol/L～0.20 mol/L 范圍內(nèi)隨離子濃度的增大而增大，基于以上可知，EGCG 與WPI間存在靜電相互作用。