青蒿組方對球蟲感染雛雞血液中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的影響試驗(yàn)

郭全海，劉詩柱，王 留，劉中原，王中華

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000； 2.商丘市農(nóng)村農(nóng)業(yè)局，河南 商丘 476000)

球蟲病是養(yǎng)雞生產(chǎn)中的常見病，對雞危害嚴(yán)重(尤其是雛雞)。 目前我國發(fā)現(xiàn)有9 種雞球蟲，其中毒力最強(qiáng)的柔嫩艾美耳球蟲寄生于雞腸上皮細(xì)胞，雞發(fā)病后輕則生長受阻，增加沙門氏菌等病原的感染概率，重則大量死亡，2 ～7 周齡的雛雞病死率可高達(dá)80%，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。

目前預(yù)防雞球蟲病尚無高效的疫苗，主要以化學(xué)藥物控制。 臨床上雖然可選擇的藥物較多，但由于頻繁用藥且藥量不斷加大，不僅對雞肉食品安全影響較大，而且還易產(chǎn)生耐藥性，所以研究毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的中藥進(jìn)行防治具有廣闊的前景和巨大的市場[3，4]。 現(xiàn)在大多數(shù)抗球蟲中藥的研究還停留在試驗(yàn)階段，而中藥抗球蟲的作用機(jī)理成為近年研究的熱門[5]。 許多研究發(fā)現(xiàn)，青蒿及其衍生物對球蟲有很好的抑制作用，但對雞免疫細(xì)胞的影響研究甚少[6～9]。 本試驗(yàn)通過測定球蟲感染雞血液中CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化，研究青蒿組方中藥對動物機(jī)體免疫力的影響，為開發(fā)具有良好抗球蟲效果的中藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物從河南正大某種雞場購買1 日齡三黃雞150 只，分籠飼喂于經(jīng)嚴(yán)格消毒的籠舍中，飼喂自配無添加任何抗球蟲藥的飼料，飲水經(jīng)煮沸消毒，自由采食、飲水，飼養(yǎng)至14 日齡。 試驗(yàn)前3 天，連續(xù)檢查糞便無球蟲卵囊者用于試驗(yàn)。

1.2 球蟲卵囊雞柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella) 卵囊由商丘市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提供，試驗(yàn)前人工感染無球蟲雞繼代1 次，獲得試驗(yàn)用卵囊，29 ℃孢子化，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)藥物青蒿組方由青蒿、常山、地榆、黃柏、茵陳、苦參6 味中藥組成，各藥物購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)400 目超微粉碎機(jī)粉碎備用。

1.4 主要試劑及儀器(1)單克隆抗體(McAb)：FITC 標(biāo)記鼠 IgG2b 抗雞 CD4 單抗、FITC 標(biāo)記鼠IgG1 抗雞CD8 單抗，購自北京百奧萊博科技有限公司。 (2)雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒：購自索萊寶科技有限公司。 (3)流式細(xì)胞儀：商丘市人民醫(yī)院。

1.5 試驗(yàn)分組及處理選擇14 日齡、體重相近、無球蟲感染的雞120 只，隨機(jī)分為4 組，每組30 只。1 組：感染給藥組；2 組：感染不給藥組；3 組：不感染給藥組；4 組：不感染不給藥組(對照組)。 給藥組飼料中按質(zhì)量比例添加1.5%青蒿組方微粉，飼喂至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 2 組和4 組飼喂不添加任何抗球蟲藥的飼料。 16 日齡時(shí)，各感染組人工經(jīng)口接種雞柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×104個/只。

1.6 血樣采集分別在接種球蟲后第4、7、10 d，從各組隨機(jī)抽取5 只雞心臟采血，送商丘市人民醫(yī)院用流式細(xì)胞儀測定CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)值，結(jié)果用spss 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿組方中藥對試驗(yàn)雞CD4+T 淋巴細(xì)胞的影響雛雞接種球蟲后第 4、7、10 d，1 組(感染給藥組)的 CD4+T 淋巴細(xì)胞值分別為6.51%、4.76%、9.89%，均高于2 組(感染不給藥組)，其中接種后第4、7 d 差異不顯著(P＞0.05)，接種后第 10 d 差異顯著(P＜0.05)。 在整個試驗(yàn)期，3 組(不感染給藥組)CD4+T 淋巴細(xì)胞值均高于4 組(不感染不給藥對照組)，并且隨著飼喂天數(shù)的增加差值增大，但差異不顯著(P＞0.05)。 見表1。

表1 各組CD4+T 淋巴細(xì)胞檢測值 %

2.2 青蒿組方中藥對試驗(yàn)雞CD8+ T 淋巴細(xì)胞的影響雛雞在接種球蟲后第4、10 d，1 組的 CD8+T 淋巴細(xì)胞值均高于其他組，但差異不顯著(P＜0.05)；接種球蟲后的第7 d，CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量有所下降，略低于 2 組，差異不顯著(P＜0.05)。 在整個試驗(yàn)期，3 組的CD8+T 淋巴細(xì)胞值均高于4 組，但差異不顯著(P＜0.05)。 見表2。

表2 各組CD8+T 淋巴細(xì)胞檢測值 %

2.3 青蒿組方中藥對CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值的影響4 組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值平均高于感染球蟲的 1、2 組，1 組 CD4+T/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值高于 2 組，但差異不顯著(P＞0.05)。 其中 1、3、4組平均CD4+T/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值均＞1，分別為1.12、1.33、1.24，而 2 組比值僅為 0.92。 見表3。

表3 各組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值

2.4 CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞變化情況隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長，各組CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞值呈有規(guī)律的動態(tài)變化。 給藥組均在7 ～10 d 后呈現(xiàn)上升趨勢，不給藥組全程均為下降趨勢。 見圖1、圖2。

3 討論

動物免疫學(xué)理論研究表明，機(jī)體免疫系統(tǒng)自身具有周密健全的調(diào)節(jié)機(jī)制，具體的效應(yīng)表現(xiàn)在維持內(nèi)環(huán)境平衡，而T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞在調(diào)控中起重要作用。 T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫中，一定條件下是相對穩(wěn)定的，屬于效應(yīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞，它的變化預(yù)示機(jī)體免疫功能的改變[10]。 依據(jù)T 淋巴細(xì)胞表面抗原將其分為兩大類： CD4+T 淋巴細(xì)胞(輔助性T 細(xì)胞)和CD8+T 淋巴細(xì)胞(細(xì)胞毒性T 細(xì)胞)。

3.1 青蒿組方對CD4+T 淋巴細(xì)胞的影響本試驗(yàn)結(jié)果表明，感染給藥組CD4+T 淋巴細(xì)胞值在接種球蟲后第4、7、10 d 均高于感染不給組藥組的試驗(yàn)雞，特別在接種球蟲后第10 d 顯著高于后者。 同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在2 個不接種球蟲組中，在飼料中加入青蒿組方的CD4+T 淋巴細(xì)胞值在第4、7、10 d 也高于感染不給藥組，但差異并不顯著。 這一試驗(yàn)結(jié)果表明，接種球蟲后雞體可能受到球蟲抗原的刺激，CD4+T 淋巴細(xì)胞啟動了細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫效應(yīng)，而CD4+T 淋巴細(xì)胞值增多標(biāo)志著機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)。 感染給藥組CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量增多說明青蒿組方中藥有促進(jìn)CD4+T 淋巴細(xì)胞生成的作用，進(jìn)而增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能。

3.2 青蒿組方藥對CD8+T 淋巴細(xì)胞的影響已有試驗(yàn)研究證實(shí)CD8+T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用在抗球蟲免疫中發(fā)揮著巨大的作用[11]。 CD8+T 淋巴細(xì)胞與被蟲體感染上皮細(xì)胞直接接觸，使其成為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的靶細(xì)胞。 CD8+T 淋巴細(xì)胞可分泌穿孔素或其他可擾亂細(xì)胞膜完整性的蛋白，破壞感染的上皮細(xì)胞或可誘導(dǎo)感染上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。 被激活的CD8+T 淋巴細(xì)胞也可釋放細(xì)胞免疫因子，在球蟲保護(hù)性免疫中發(fā)揮作用[12]。 本試驗(yàn)表明，感染給藥組CD8+T 淋巴細(xì)胞值在接種球蟲后第4、7、10 d 均高于感染不給藥組，說明青蒿組方藥能夠促進(jìn)CD8+T 淋巴細(xì)胞的生成，并誘導(dǎo)破壞上皮細(xì)胞，進(jìn)而加速球蟲的排出。

3.3 青蒿組方藥對CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值的影響CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞的比值可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，通常比值在1～2 之間，其中1 種細(xì)胞的增多或減少均可影響另1 種細(xì)胞的存在，造成免疫的不均衡。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不感染球蟲組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值平均高于感染球蟲組，而感染球蟲給藥組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值高于感染球蟲不給藥組，但差異不顯著。 感染球蟲組的CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞的平均比值均低于不感染球蟲組，表明攻蟲后機(jī)體的免疫水平有所下降。 感染不給藥組在感染球蟲后第4、7、10 d CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞平均比值低于1(0.92)，說明接種球蟲后機(jī)體的免疫水平是處于下降的趨勢。 而感染給藥組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值在接種后的第7、10 d 均高于感染不給藥組，該組CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值僅在感染后第7 d 低于1(0.90)，到第10 d 上升至1.35，說明感染球蟲后青蒿組方藥具有增強(qiáng)機(jī)體免疫水平的功能。

4 結(jié)論

青蒿組方中藥可促進(jìn)雞血液中CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞生成，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。