暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈和苯甲酸的研究

郭 鈴,方文婉,葛 峰,戴亦軍

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023;2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042)

腈類物質(zhì)是一類含有氰基基團(tuán)的有機(jī)化合物,天然存在于在土壤、植物和微生物中,也可以通過(guò)人工合成應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),但大多數(shù)腈類化合物具有高毒性[1]。苯甲腈因其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用被認(rèn)為是最重要的腈類物質(zhì)之一,它可以作為溶劑和中間體廣泛應(yīng)用于藥物、香水、染料、橡膠、紡織品、樹(shù)脂等,用于干燥丙烯酸纖維和生產(chǎn)三聚氰胺。除此以外,苯甲腈還是廣泛使用的除草劑如二氯苯腈、溴苯腈和碘苯腈的主要成分。但是苯甲腈會(huì)對(duì)人體帶來(lái)嚴(yán)重危害,如運(yùn)動(dòng)能力下降和高鐵血紅蛋白血癥,還可通過(guò)皮膚直接吸收造成神經(jīng)麻痹和動(dòng)物組織痙攣,一旦經(jīng)由工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)入環(huán)境后,將對(duì)人體健康和環(huán)境保護(hù)帶來(lái)嚴(yán)重的危害[2]。

生物降解苯甲腈因?yàn)槠錅睾?、價(jià)格低廉、對(duì)環(huán)境危害小的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[3]。微生物降解腈類物質(zhì)有2條途徑:一是在腈水合酶(Nitrile hydratase,EC 4.2.1.84)作用下生成苯甲酰胺,再在酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)作用下生成苯甲酸和氨[4-5]。二是苯甲腈直接通過(guò)腈水解酶(Nitrilase, EC 3.5.5.1)水解生成苯甲酸和氨[6]。目前報(bào)道很多菌株可以通過(guò)腈水合酶/酰胺酶途徑進(jìn)行腈類降解,MicrobacteriumimperialeCBS 498-74、Rhodococcussp. MTB5、Rhodococcussp. BX2和RhodococcusequiTG 328的基因組中存在腈水合酶和酰胺酶,兩者共表達(dá)轉(zhuǎn)化腈類[7]。BradyrhizobiumjaponicumUSDA 110 中有2個(gè)腈水解酶基因(blr3397和bll6402),兩者都對(duì)苯乙腈表現(xiàn)出活性,其中blr3397同時(shí)對(duì)肉桂腈表現(xiàn)出高活性[8]。同時(shí)已經(jīng)在一些菌中發(fā)現(xiàn)多酶代謝系統(tǒng),如BacillussubtilisZJB-063含有2條代謝途徑,腈水解酶是組成型酶,腈水合酶/酰胺酶是誘導(dǎo)型酶[9]。RhodococcusrhodochrousJ1 也含有2條腈類代謝途徑,分別由尿素和環(huán)己烷-卡波沙酰胺-巴豆酰胺誘導(dǎo)表達(dá)[10-11]。

在被腈轉(zhuǎn)化酶(腈水合酶/酰胺酶和腈水解酶)代謝的過(guò)程中,苯甲腈會(huì)降解為另一種常見(jiàn)污染物苯甲酸。苯甲酸可用作抑菌劑,還可用作藥物的助溶劑隨工廠廢水排出[12]。多種芳香族化合物苯甲基脂肪酸、甲苯、酚等在降解過(guò)程中也會(huì)生成苯甲酸中間體,這一過(guò)程又增加了苯甲酸在環(huán)境中的危害程度[13]。苯甲酸類化合物的代謝主要可以分成好氧降解和厭氧降解[14]。好氧降解途徑又可分為鄰位途徑、間位途徑、龍膽酸途徑和原兒茶酸途徑[15],有些細(xì)菌可以同時(shí)有多種代謝途徑。一些光合細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和硫鐵還原細(xì)菌等通過(guò)厭氧途徑對(duì)苯甲酸進(jìn)行降解[16]。因此開(kāi)展苯甲酸的微生物降解途徑及機(jī)理的研究,對(duì)于闡明很多環(huán)境污染物的降解、治理環(huán)境污染有重要的指導(dǎo)作用。

筆者實(shí)驗(yàn)室篩選到一株可降解腈類化合物的暗灰鏈霉菌(Streptomycescanus)CGMCC 13662,該菌株有很強(qiáng)的苯甲腈降解能力,但目前尚無(wú)相關(guān)研究的報(bào)道。因此筆者進(jìn)一步開(kāi)展了暗灰鏈霉菌降解苯甲腈和苯甲酸的降解特性和降解途徑研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試劑

試驗(yàn)所用藥品苯甲腈、苯甲酰胺、苯甲酸、兒茶酚、原兒茶酸購(gòu)買自上海Sigma-Aldrich公司,高效液相色譜(HPLC)所使用的試劑乙腈購(gòu)買自TEDIA公司(Fairfield, OH, USA),其他試劑為分析純。

1.1.2菌株與培養(yǎng)基

暗灰鏈霉菌(Streptomycescanus)CGMCC 13662從土壤中篩選獲得,菌株保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC,北京)。

LB培養(yǎng)基:NaCl 10 g·L-1,胰蛋白胨10 g·L-1,酵母粉5 g·L-1,pH值為7.2。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g·L-1,NaCl 0.5 g·L-1,KNO31 g·L-1,K2HPO4·3H2O 1 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1,pH值為7.0。

ISP4改良培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g·L-1,K2HPO4·3H2O 1 g·L-1,MgSO41 g·L-1,NaCl 1 g·L-1,(NH4)2SO42 g·L-1,CaCl22 g·L-1, FeSO40.001 g·L-1,MnCl20.001 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.001 g·L-1,CoCl20.013 g·L-1,pH值為7.2。

YEME:酵母提取物 3 g·L-1,胰蛋白胨 5 g·L-1,麥芽提取物3 g·L-1,葡萄糖10 g·L-1,蔗糖 340 g·L-1,pH值保持自然狀態(tài)。

TSDY培養(yǎng)基:葡萄糖10 g·L-1,酸水解酪蛋白2 g·L-1,牛肉膏1 g·L-1,酵母粉 1 g·L-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662孢子懸液的制備、菌體培養(yǎng)與靜息細(xì)胞的制備

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基平板30 ℃生長(zhǎng)7 d,用無(wú)菌水收集孢子并用無(wú)菌尼龍過(guò)濾網(wǎng)去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì),4 ℃條件下以6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑為10.8 cm),棄上清液,在沉淀孢子中加入含φ=20%甘油的無(wú)菌水,輕輕混勻后置于-80 ℃冰箱中保存。

為探究暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號(hào)、ISP4、YEME和TSDY培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,首先調(diào)節(jié)孢子懸液到600 nm波長(zhǎng)處的光密度值(OD600)為0.1,按φ=1%接種到含有100 mL不同培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,三角瓶置于30 ℃、220 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng),每隔6～12 h取樣測(cè)量菌體生長(zhǎng)量。測(cè)量方法為:取20 mL發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾收集菌絲體。將收集菌絲體的濾紙?jiān)?00 ℃的烘箱中干燥至恒重,記錄菌絲體的干重,計(jì)算菌體生長(zhǎng)量(菌絲體干重/發(fā)酵液體積)。

制備靜息細(xì)胞(resting cell)的方法為:先將OD600為0.1的孢子懸液按φ=1%接種到含有100 mL ISP4種子培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中,于30 ℃、220 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)4 d;取50 mL菌液(菌絲體干重約為0.5 g),4 ℃條件下以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min(離心半徑為10.8 cm),棄上清液,菌體收集于50 mL離心管中,用20 mL濃度為50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)洗滌2次后得到靜息細(xì)胞。

1.2.2苯甲腈的降解

(1)生長(zhǎng)細(xì)胞降解苯甲腈:把OD600為0.1的孢子懸液按φ=1%接種到上述ISP4 改良液體培養(yǎng)基中,加入0.5 g·L-1苯甲腈。三角瓶于30 ℃、220 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置菌體對(duì)照組和底物對(duì)照組,每12 h取樣,樣品以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min (離心半徑為10.8 cm),上清液稀釋5倍,用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

(2)靜息細(xì)胞降解苯甲腈:將上述制備的靜息細(xì)胞懸浮于10 mL(含0.5 g·L-1苯甲腈)轉(zhuǎn)化液中,取出1 mL作為0 d樣品,剩余樣品按每管3 mL分裝于3個(gè)50 mL的尖底離心管內(nèi),稱重、封口并戳孔通氣,于30 ℃、220 r·min-1條件下轉(zhuǎn)化,定時(shí)取樣進(jìn)行HPLC鑒定。試驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置菌體對(duì)照和底物對(duì)照。每次取樣前需先用無(wú)菌水補(bǔ)足蒸發(fā)水分,樣品處理方式同生長(zhǎng)細(xì)胞降解苯甲腈。

在靜息細(xì)胞降解苯甲腈的過(guò)程中,為探究鈷離子對(duì)苯甲腈代謝的影響,在ISP4改良培養(yǎng)基中去除CoCl2;探究pH值對(duì)苯甲腈代謝過(guò)程的影響,靜息轉(zhuǎn)化液的pH值分別設(shè)置為5、6、7、7.5和8;探究不同共代謝基質(zhì)對(duì)苯甲腈代謝過(guò)程的影響,在轉(zhuǎn)化液中分別加入w=2%的葡萄糖、蔗糖、琥珀酸鈉和蘋(píng)果酸鈉,同時(shí)設(shè)置不添加共代謝基質(zhì)的對(duì)照組。

1.2.3苯甲腈中間產(chǎn)物降解

分別以苯甲酰胺、苯甲酸、兒茶酚、原兒茶酸為底物進(jìn)行暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解,方法與苯甲腈降解相同。

1.2.4HPLC分析

HPLC分析采用安捷倫1200型高效液相色譜儀,分析條件為:安捷倫HC-C18反相柱(4.6 mm×250 mm×5 μm);檢測(cè)器為Agilent G1314A可變紫外檢測(cè)器,紫外吸收波長(zhǎng)設(shè)定為231 nm;進(jìn)樣器為安捷倫7725i手動(dòng)進(jìn)樣器;進(jìn)樣體積為20 μL;柱溫為30 ℃;流動(dòng)相A為經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾的雙蒸水(含φ=1‰色譜級(jí)乙酸),流動(dòng)相B為色譜級(jí)乙腈,V(A)∶V(B)=45∶55;流速為1 mL·min-1。 HPLC數(shù)據(jù)在Agilent ChemStation工作站上進(jìn)行分析。苯甲腈和苯甲酸的定量方法為外標(biāo)法。

1.2.5半衰期的計(jì)算

苯甲腈降解半衰期方程式為

ln (I/I0)=-kt。

(1)

式(1)中,I為苯甲腈殘余質(zhì)量濃度,g·L-1;I0為苯甲腈起始質(zhì)量濃度,g·L-1;k為表觀常數(shù);t為時(shí)間, h。

降解半衰期(t1/2)的計(jì)算公式為

t1/2=(ln 2)/k。

(2)

式(2)中,k為表觀常數(shù),R2>0.9。

1.2.6試驗(yàn)的重復(fù)數(shù)以及檢驗(yàn)方法

相關(guān)試驗(yàn)均開(kāi)展3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及其對(duì)苯甲腈的耐受性

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 在ISP4、高氏一號(hào)、YEME和TSDY這4種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)如圖1所示,在ISP4培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)最好,培養(yǎng)120 h后的菌體干重達(dá)到10 g·L-1;在YEME和TSDY中菌體生長(zhǎng)情況相仿,但與在ISP4培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相比,這2種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲的最大生物量?jī)H為6 g·L-1。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號(hào)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)120 h的生物量?jī)H為4 g·L-1。

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662的生長(zhǎng)過(guò)程分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期,按φ=1%接種量接種后,在30 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng),50 h內(nèi)菌體生長(zhǎng)緩慢處于遲緩期,之后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,100 h以后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。因?yàn)榫w在ISP4中生物量最大,因此選其作為暗灰鏈霉菌CGMCC 13662后續(xù)研究的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

在ρ(苯甲腈)為1～10 g·L-1的ISP4液體培養(yǎng)基中研究其對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662菌體生長(zhǎng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ρ(苯甲腈)為3 g·L-1時(shí)菌體生長(zhǎng)量最高,達(dá)(10.16±1.71) g·L-1,當(dāng)苯甲腈濃度大于此值時(shí)菌體的生長(zhǎng)逐漸受到抑制,當(dāng)苯甲腈濃度到達(dá)8 g·L-1時(shí)菌體生長(zhǎng)被完全抑制。

直方柱上方英文字母不同表示不同培養(yǎng)時(shí)間和苯甲腈濃度下暗灰鏈霉菌的生物量差異顯著(P<0.05)。

2.2 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662生長(zhǎng)細(xì)胞和靜息細(xì)胞降解苯甲腈

暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662的生長(zhǎng)細(xì)胞和與靜息細(xì)胞均可降解苯甲腈,HPLC分析結(jié)果如圖2所示。降解過(guò)程中產(chǎn)生2個(gè)新產(chǎn)物P1和P2,菌體對(duì)照與苯甲腈底物對(duì)照均無(wú)這2個(gè)峰出現(xiàn)。P1和P2的出峰時(shí)間分別為3.25和4.27 min,P1和P2出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品苯甲酰胺和苯甲酸出峰時(shí)間相同,因而P1和P2產(chǎn)物分別是苯甲酰胺和苯甲酸。

圖2 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈的HPLC分析

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662的生長(zhǎng)細(xì)胞與靜息細(xì)胞對(duì)苯甲腈的代謝能力不同,生長(zhǎng)細(xì)胞在ISP4液體培養(yǎng)基中完全降解0.5 g·L-1苯甲腈需要120 h,生成的ρ(苯甲酰胺)達(dá)到最高〔(0.47±0.02) g·L-1〕后不再降解〔圖3(a)〕。靜息細(xì)胞能在20 h內(nèi)完全降解0.5 g·L-1苯甲腈,ρ(苯甲酰胺)在20 h達(dá)到最高值〔(0.42±0.02) g·L-1〕后則不斷被降解,在45 h被完全降解〔圖3(b)〕。無(wú)論生長(zhǎng)細(xì)胞還是靜息細(xì)胞在降解苯甲腈的過(guò)程中產(chǎn)生的苯甲酸質(zhì)量濃度均很低(<10 mg·L-1)。

圖3 暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662 生長(zhǎng)細(xì)胞和靜息細(xì)胞降解苯甲腈

2.3 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662對(duì)苯甲腈中間代謝產(chǎn)物的降解

分別以苯甲酰胺〔圖4(a)〕和苯甲酸〔圖4(b)〕為底物進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明暗灰鏈霉菌CGMCC 13662對(duì)苯甲酰胺和苯甲酸有較高的降解能力。不同濃度苯甲酰胺在暗灰鏈霉菌CGMCC 13662轉(zhuǎn)化下初期降解緩慢,0.2 g·L-1苯甲酰胺在18 h后才開(kāi)始快速降解,30 h左右完全降解。ρ(苯甲酰胺)為5 g·L-1時(shí)60 h的降解率僅為19.5%。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662能快速降解苯甲酸,0.2 g·L-1苯甲酸能在10 h內(nèi)被完全降解,其對(duì)高濃度苯甲酸也有高效降解能力,5 g·L-1苯甲酸在48 h內(nèi)能完全降解。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在代謝苯甲腈過(guò)程中能快速利用掉生成的苯甲酸,因此檢測(cè)到的苯甲酸濃度始終處于較低水平。

圖4 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈中間代謝產(chǎn)物苯甲酰胺和苯甲酸

分別以苯甲酸代謝途徑中的中間物原兒茶酸和兒茶酚為底物,發(fā)現(xiàn)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662能完全降解原兒茶酸和兒茶酚(圖5),因而推測(cè)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 可能同時(shí)通過(guò)兒茶酚途徑、原兒茶酸途徑進(jìn)行苯甲酸代謝。兒茶酚降解途徑包括鄰位途徑和間位途徑,有報(bào)道發(fā)現(xiàn)這2條途徑同時(shí)存在且受底物濃度調(diào)控,惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)P8在ρ(苯甲酸)較低時(shí)(<200 mg·L-1)代謝通過(guò)臨位降解途徑,當(dāng)ρ(苯甲酸)高于300 mg·L-1時(shí)2種途徑同時(shí)進(jìn)行[17]。某些生物體中還同時(shí)存在其他多種代謝通路,如伯克霍爾德菌(Burkholderiaxenovorans)LB400同時(shí)存在兒茶酚途徑中的鄰位途徑以及2條不同的苯甲酸-CoA途徑[18],解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)S12存在鄰位途徑和原兒茶酸途徑[19];紅球菌(Rhodococcussp.)R04代謝主要通過(guò)兒茶酚鄰位途徑、間位途徑以及原兒茶酸途徑共同完成[20]。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662可以同時(shí)降解兒茶酚和原兒茶酸,但確定其代謝通路還需結(jié)合基因組測(cè)序和相關(guān)基因簇分析。

圖5 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細(xì)胞降解苯甲酸的中間代謝產(chǎn)物兒茶酚和原兒茶酸

2.4 鈷離子對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細(xì)胞降解苯甲腈的影響

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈過(guò)程中產(chǎn)生苯甲酰胺,表明菌體中存在腈水合酶。腈水合酶是金屬離子酶,根據(jù)結(jié)合在金屬活性中心的輔助因子,腈水合酶可分為鈷離子型和鐵離子型。經(jīng)腈水合酶基因克隆、誘導(dǎo)表達(dá)以及腈水合酶活性分析,暗灰鏈霉菌CGMCC 13662腈水合酶是鈷離子型腈水合酶,即鈷離子能調(diào)控腈水合酶代謝途徑。因此研究鈷離子對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細(xì)胞降解苯甲腈的影響能有效反映相關(guān)酶代謝系統(tǒng)代謝苯甲腈的情況。圖6是CoCl2對(duì)菌體代謝苯甲腈的影響。添加CoCl2培養(yǎng)的菌體靜息細(xì)胞降解ρ(苯甲腈)在20 h時(shí)為(0.042±0.012) g·L-1,而未添加CoCl2的對(duì)照組為(0.081±0.001) g·L-1,初始ρ(苯甲腈)為0.55 g·L-1,結(jié)果表明CoCl2能提高腈水合酶活性。CoCl2除了改變苯甲酰胺生成速率,還對(duì)代謝過(guò)程中苯甲酸的生成有顯著影響。不加CoCl2時(shí)在8 h內(nèi)最高ρ(苯甲酸)可達(dá)0.094 g·L-1,而加入CoCl2后12 h僅生成0.016 g·L-1苯甲酸。但CoCl2對(duì)苯甲腈的降解速率影響不大,添加CoCl2與不添加時(shí)的降解半衰期分別為5.8 和6.7 h。

圖6 添加CoCl2對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

這是由于暗灰鏈霉菌CGMCC 13662測(cè)序的基因組(全長(zhǎng)10 656 045 bp)中同時(shí)含有腈水合酶/酰胺酶、腈水解酶2條途徑,鈷離子能激活腈水合酶活性,增強(qiáng)了腈水合酶/酰胺酶代謝途徑,因而苯甲酰胺的最高濃度高于不加鈷離子的對(duì)照組;反之,在不加鈷離子的對(duì)照組,苯甲腈經(jīng)由腈水解酶途徑的代謝流比例增加,因此苯甲酸濃度隨之升高。

2.5 pH值對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 靜息細(xì)胞代謝苯甲腈的影響

pH值對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈和產(chǎn)物苯甲酰胺的影響如圖7所示。pH值為7.5時(shí)苯甲腈降解速率最高,降解半衰期為5.4 h;pH值為7和8時(shí)苯甲腈降解半衰期分別為6.4 和9.9 h;當(dāng)pH值為6時(shí)苯甲腈降解能力開(kāi)始顯著下降,降解半衰期延長(zhǎng)為13.0 h;pH值為5時(shí)降解半衰期達(dá)15.6 h,結(jié)果表明腈水合酶在酸性條件下活性受到抑制。pH值為7.5時(shí)苯甲酰胺降解速率達(dá)到最大,在50 h以內(nèi)完全降解;pH值為7和8時(shí)生成的苯甲酰胺要在60 h以后才可完全降解;然而當(dāng)pH值為6時(shí)苯甲酰胺達(dá)到最高值的時(shí)間延長(zhǎng)至50 h左右,然后才被降解,70 h的降解率僅為50%。當(dāng)pH值為5時(shí)苯甲酰胺緩慢生成且不發(fā)生降解。上述結(jié)果表明產(chǎn)物苯甲酰胺的進(jìn)一步降解對(duì)pH值的變化非常敏感,僅在pH值為7.5時(shí)達(dá)到最佳水平,偏酸偏堿都會(huì)抑制苯甲酰胺的降解。

圖7 pH值對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

2.6 共代謝基質(zhì)對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈的影響

共代謝基質(zhì)(co-substrate)通常能促進(jìn)有機(jī)污染物的降解,因而在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中分別加入蘋(píng)果酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖、蔗糖來(lái)研究其對(duì)苯甲腈降解的影響。苯甲腈和產(chǎn)物苯甲酰胺的變化如圖8所示。未添加其代謝基質(zhì)的對(duì)照組的苯甲腈降解半衰期為5.4 h,苯甲酰胺生成量在25 h達(dá)到最高后在50 h內(nèi)完全降解。添加蘋(píng)果酸鈉后,苯甲腈代謝速率明顯加快,降解半衰期減少到3.8 h,同時(shí)苯甲酰胺含量在12 h達(dá)到最高,在40 h內(nèi)完全降解。葡萄糖、蔗糖、琥珀酸鈉對(duì)苯甲腈代謝速率幾乎沒(méi)有影響,苯甲酰胺都在25 h達(dá)到最高,但共代謝基質(zhì)對(duì)之后苯甲酰胺降解的影響不同。葡萄糖、蔗糖減緩了苯甲酰胺的降解速度,苯甲酰胺在60 h后才完全降解,但添加琥珀酸鈉后苯甲酰胺的降解與對(duì)照組沒(méi)有差別。上述結(jié)果中蘋(píng)果酸鹽能顯著促進(jìn)腈水合酶的活性,加速苯甲酰胺的生成,但對(duì)苯甲酰胺代謝沒(méi)有影響;葡萄糖和蔗糖對(duì)腈水合酶活性沒(méi)有影響,但卻抑制苯甲酰胺的代謝,其降解機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

圖8 共代謝基質(zhì)對(duì)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

3 結(jié)論

通過(guò)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈及其中間產(chǎn)物確定其代謝通路,并探究鈷離子、pH值和共代謝物質(zhì)對(duì)代謝途徑的影響,得到以下結(jié)論:

(1)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662同時(shí)通過(guò)腈水合酶/酰胺酶、腈水解酶2條代謝途徑對(duì)苯甲腈進(jìn)行降解,生成的苯甲酸可通過(guò)兒茶酚途徑和原兒茶酸途徑進(jìn)一步代謝。

(2)CoCl2激活暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662中腈水合酶活性,增強(qiáng)了腈水合酶/酰胺酶代謝途徑;在無(wú)CoCl2時(shí)通過(guò)腈水解酶代謝苯甲腈的途徑增加。

(3)酸性條件下苯甲腈降解減慢,腈水合酶活性受到抑制;苯甲酰胺的降解對(duì)pH值變化敏感,僅在pH值為7.5時(shí)降解速率最快,偏酸偏堿條件下都會(huì)被抑制。

(4)蘋(píng)果酸鹽促進(jìn)苯甲腈的降解和加速苯甲酰胺的生成,對(duì)腈水合酶活性有促進(jìn)作用,葡萄糖和蔗糖抑制苯甲酰胺的進(jìn)一步降解。