外源鈣對荷花適應鹽脅迫的影響

劉藝平，蘇少文，張 琳，劉 瑩，黃志遠，賀 丹，孔德政

(河南農業(yè)大學 林學院，河南 鄭州 450000)

鹽堿土由于鹽分含量高、結構差和缺乏養(yǎng)分而對植物生長產生不利影響，甚至導致植物死亡，這嚴重阻礙了農林業(yè)生產和土地綠化進程[1-2]。我國鹽堿地總面積約占全國總面積的1/10[3]，人口快速增加、城市化進程加速和耕地質量下降加劇了對土地資源的需求[4]。我國鹽堿地面積大且分布廣[5]，選擇適應鹽堿地生長發(fā)育的植物對充分利用鹽堿地和改善生態(tài)環(huán)境具有積極作用。

荷花(Nelumbonucifera)隸屬睡蓮科蓮屬，為多年生挺水草本植物，因其外形高雅圣潔、花色艷麗、花型豐富，觀賞價值極高，被廣泛應用于園林造景之中[6]。近年來，通過使用外源物質來緩解鹽脅迫對植物的傷害，成為一種克服土壤鹽漬化的途徑。鹽脅迫對植物造成的危害主要是離子毒害、滲透脅迫和膜透性改變，以及生理代謝紊亂[7]。CIPK家族基因在植物的生長發(fā)育和抗逆性中起著關鍵的調節(jié)作用。余愛麗等[8]從谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv.]基因組中鑒定出SiCIPK6基因，該基因在ABA、低溫、高溫、干旱和高鹽誘導下表達量上調幅度較大，推測該基因在逆境脅迫中起到一定作用。He等[9]從棉花體細胞中克隆了GhCIPK6基因，將該基因轉入擬南芥，轉基因擬南芥表現(xiàn)出耐鹽性和耐旱性，表明CIPK6在植物應激反應中起到雙重作用。鈣是植物必需的大量營養(yǎng)元素，在植物抗逆機制中起著重要作用[10]。研究表明，鈣能提高植物耐鹽[11]、耐低氧[12]、耐干旱[13]等多種抗性。有關外源鈣對荷花鹽脅迫下生理響應研究已有部分報道。印荔[14]對蓮藕耐鹽性進行了研究，認為Ca2+對鹽脅迫下蓮藕的生長具有較好的改善作用，證實NnCDPK13基因與其耐鹽性相關。李淑艷等[15]研究表明，低濃度的Ca2+對緩解蓮藕鹽脅迫具有較好的效果，但Ca2+濃度增加時，緩解作用不明顯，甚至出現(xiàn)抑制效果。本文通過研究鹽敏感品種粉美人和鹽抗性品種水晶粉七號在鹽脅迫下對外源鈣離子的生理響應，初步探究外源鈣離子對鹽脅迫下荷花生長的緩解效果，并分析與Ca2+相關的關鍵基因NnCIPK6基因的表達模式，為深入研究荷花耐鹽分子機理和利用分子輔助育種途徑改良荷花資源的耐鹽性提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中所用藥劑氯化鈣、氯化鈉由天津市瑞金特化學品有限公司提供。荷花材料由河南省駐馬店市荷花培植研究會(鄭州基地)提供，品種為鳳舞、粉美人、紅樓、鮮嬌、春紅和水晶粉七號。分別選取各品種健康狀況良好、生長勢基本一致的植株用于盆栽試驗。于2019年4月分別將6種幼苗栽植于橡膠盆內并施肥，以保證植株正常生長，每盆定植1株。在河南省優(yōu)質花卉蔬菜種苗工程研究中心露天苗圃進行培育供試，雨天進行遮蓋。

1.2 試驗方法

將所有供試材料培養(yǎng)1個月后，選取生長健壯均勻的植株，進行NaCl處理。試驗共設5個處理：A1，0 mmol·L-1NaCl；A2，50 mmol·L-1NaCl；A3，100 mmol·L-1NaCl；A4，150 mmol·L-1NaCl；A5，200 mmol·L-1NaCl。每個處理3個重復，共計15盆，處理7 d后進行鹽害指數(shù)測定。

進行NaCl處理后選出抗性品種與敏感品種，再選取生長健壯均勻的植株，待長出3～5葉時，隨后進行外源鈣處理。采用鹽濃度為100 mmol·L-1溶液培養(yǎng)，模擬鹽脅迫環(huán)境。試驗共設計6個處理：對照(CK)0 mmol·L-1NaCl+0 mmol·L-1CaCl2；T1，100 mmol·L-1NaCl+0 mmol·L-1CaCl2；T2，100 mmol·L-1NaCl+5 mmol·L-1CaCl2；T3，100 mmol·L-1NaCl+10 mmol·L-1CaCl2；T4，100 mmol·L-1NaCl+15 mmol·L-1CaCl2；T5，100 mmol·L-1NaCl+20 mmol·L-1CaCl2。試驗采取隨機區(qū)組設計，每個處理3個重復，共計18盆，處理14 d后結束試驗。分別于處理后的第0、7和14天08：00測量生長量和采樣，用電子天平稱取0.2 g葉，用錫箔紙包住，放于液氮中，貯存在-80 ℃?zhèn)溆?，用于測量各項生理生化指標。

1.3 測定方法

1.3.1 鹽害指數(shù)測定

根據(jù)以下鹽害級別判定標準[16-17]進行耐鹽性評價：1級，生長正常，無明顯鹽害癥狀；2級，輕度鹽害，少數(shù)葉片尖緣枯焦或黃化；3級，中度鹽害，1/2葉片尖緣枯焦黃化或少量葉片脫落失水萎蔫；4級，重度鹽害，大部分葉片枯焦，1/2左右葉片脫落；5級，極重度鹽害，多數(shù)葉片脫落，枝條枯死，植株瀕臨死亡。

1.3.2 株高和葉面積測定

用尺子測量植株的株高、葉片長寬。凈高生長量計算公式如下：凈高生長量=處理后植株高度-原始植株高度。參考王永皎等[18]圖像處理法計算植物葉面積。

1.3.3 生理指標的測定

葉綠素含量測定參考波欽諾克[19]和朱廣廉等[20]的方法并加以改進。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用的氮藍四唑(NBT)法。丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法。脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮比色法[21]。

1.3.4 基因表達量的測定

采用改良的CTAB法提取RNA，以18S-rRNA為內參基因。上下游引物用Primer 5.0設計，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

采用SYBR Green I染料法，在200 μL PCR管中，于冰上依次加入試劑：10.0 μL SYBR Premix ExTaqII、1.0 μL 上游引物、1.0 μL 下游引物、0.4 μL ROX II、1.0 μL反轉錄產物和6.6 μL ddH2O，總反應體系共20 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行初步分析，并用SPSS 19.0軟件進行方差分析并分析其差異顯著性，使用Excel和Origin Pro8繪制各項指標變化圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下荷花的鹽害指數(shù)

由表2可以看出，50 mmol·L-1NaCl脅迫下，粉美人鹽害指數(shù)最高，說明其受害表現(xiàn)最為明顯；其次是鳳舞和春紅，水晶粉七號未表現(xiàn)出受害現(xiàn)象。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，紅樓的受害指數(shù)增長最快，與粉美人相近。150 mmol·L-1NaCl脅迫下，所有品種的鹽害指數(shù)均大幅度上漲，這說明150 mmol·L-1NaCl對荷花生長狀況有明顯影響，植株明顯受到傷害。當NaCl濃度升高到200 mmol·L-1時，所有品種的鹽害指數(shù)為17.33%～28.00%，粉美人鹽害指數(shù)最大，達到28.00%?？傮w來看，水晶粉七號耐鹽性最強，鮮嬌和春紅次之，粉美人最低。各品種耐鹽能力為水晶粉七號>鮮嬌>春紅>紅樓>鳳舞>粉美人。

2.2 外源鈣對NaCl脅迫下荷花生長指標的影響

2.2.1 凈高生長量

由圖1可看出，NaCl脅迫不同程度上抑制了鹽敏感品種粉美人和鹽抗性品種水晶粉七號的生長，脅迫7 d和14 d后，鹽敏感品種和鹽抗性品種的凈高生長量與對照組相比均減小，敏感品種在T1處理下的凈高生長量分別是4.23、6.87 cm，而抗性品種的凈高生長量分別是4.87、7.43 cm，抗性品種水晶粉七號的凈高生長量顯著(P<0.05)大于敏感品種粉美人。經過不同濃度的CaCl2處理后，2種荷花的高生長量均大于T1處理，這說明不同濃度的CaCl2處理對緩解鹽脅迫有一定的作用，其中以10 mmol·L-1CaCl2處理的緩解效果最好?？剐云贩N在鹽脅迫7 d和14 d后，T3處理下凈高生長量達到9.50 cm和15.57 cm，而鹽敏感品種在鹽脅迫7 d和14 d后，T3處理下凈高生長量達到8.32 cm和14.40 cm，且差異均顯著(P<0.05)。由此可以看出，鹽脅迫對荷花的危害隨脅迫時間的延長而加重。

表2 NaCl脅迫下荷花的鹽害指數(shù)Table 2 Salt damage index of lotus under stress

同行數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。
Data marked without the same lowercase letter in each row indicated significant differences atP<0.05.

圖1 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花凈高生長量的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on the clear height growth of lotus under salt stress

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖2 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種葉面積的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on leaf area of sensitive variety and tolerant variety lotus under salt stress

2.2.2 葉面積

由圖2可看出，NaCl脅迫對荷花的葉面積增長也產生了一定影響。敏感品種對照組在7 d和14 d后葉面積分別增長7.29%和14.22%，抗性品種對照組在7 d和14 d后葉面積分別增長7.46%和14.45%。T1處理下，敏感品種在7 d和14 d后葉面積分別增長2.75%和5.49%，抗性品種葉面積分別增長3.49%和6.43%，無論是正常條件下還是鹽脅迫下抗性品種水晶粉七號的葉面積增長量均顯著(P<0.05)大于敏感品種粉美人。在T3處理中，敏感品種在鹽脅迫7 d和14 d后葉面積分別增長5.57%和10.28%，抗性品種在鹽脅迫7 d和14 d后葉面積分別增長4.95%和9.66%，這說明在外源鈣處理下，敏感品種粉美人的葉面積增長量大于抗性品種水晶粉七號，表明在鹽脅迫條件下外源鈣可能對敏感品種粉美人的緩解效果更好。

2.3 外源鈣對NaCl脅迫下荷花生理生化指標的影響

2.3.1 葉綠素含量

從表3可以看出：T1處理中，7 d后敏感品種粉美人和抗性品種水晶粉七號的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和葉綠素總量(Chla+Chlb)含量分別為21.22、7.32、28.51 mg·g-1和25.37、10.21、31.64 mg·g-1，比對照組分別下降18.69%、40.95%、25.87%和7.46%、31.12%、22.73%，鹽脅迫下荷花葉綠素含量明顯降低，敏感品種粉美人的降幅更大。T3處理中，與處理7 d相比，處理14 d荷花的葉綠素含量有一定的下降，敏感品種處理Chl a、Chl b和Chla+Chlb分別下降4.67%、12.37%和4.51%，抗性品種Chl a、Chl b和Chla+Chlb分別下降8.66%、15.44%和2.69%。

2.3.2 SOD活性

圖3表明：T1處理中，7 d和14 d 抗性和敏感品種荷花的SOD活性與對照組相比顯著升高，敏感品種的SOD活性分別達到241.49、293.72 U·g-1，比對照組分別增加了5.07%和13.68%，表明敏感品種粉美人的SOD活性隨著鹽脅迫時間的延長增大；T1處理中抗性品種的SOD活性在7 d和14 d分別達到了278.37 U·g-1和294.35 U·g-1，比對照組分別增加了1.44%和2.79%。脅迫14 d后，T1處理組敏感品種的SOD活性顯著(P<0.05)高于對照組和抗性品種。4個不同濃度的CaCl2處理后，2種荷花的SOD活性均有所升高，10 mmol·L-1和15 mmol·L-1CaCl2處理的SOD活性升高的幅度最大。其中T3處理7 d和14 d后，敏感品種和抗性品種的SOD活性分別比T1處理升高了26.42%、18.24%和13.89%、16.83%。

表3 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花葉綠素含量的影響Table 3 Effects of exogenous CaCl2 on chlorophyll content of lotus under salt stress

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05.

圖3 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花SOD活性的影響Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on SOD activity of lotus under salt stress

圖4 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花MDA含量的影響Fig.4 Effects of exogenous CaCl2 on MDA content of lotus under salt stress

2.3.3 丙二醛含量

由圖4可知：在T1處理下，粉美人和水晶粉七號MDA含量最高，與對照組相比，粉美人在7 d和14 d后MDA含量分別增長69.68%和36.92%，水晶粉七號在7 d和14 d后MDA含量分別增長59.19%和47.84%。T3處理7 d和14 d粉美人MDA含量分別達到5.74、8.42 μmol·g-1，與對照組相比分別增長23.44%和9.07%，分別比T1處理下降27.25%和20.34%；T3處理7 d和14 d水晶粉七號MDA含量分別達到4.39、7.25 μmol·g-1，與對照組相比分別增長18.65%和16.00%，比T1處理分別下降25.47%和21.54%。

2.3.4 脯氨酸含量

由圖5可知：T1處理中，7 d和14 d粉美人的脯氨酸含量分別比對照組增加20.02%和19.55%，水晶粉七號的脯氨酸含量分別比對照組增加38.71%和14.77%，處理7 d后水晶粉七號脯氨酸含量的增幅明顯大于粉美人。隨著外源CaCl2濃度的升高，不同處理下的脯氨酸含量均有不同程度的升高，T3和T4處理中脯氨酸含量的積累速率加快。

圖5 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花脯氨酸含量的影響Fig.5 Effects of exogenous CaCl2 on Proline content of lotus under salt stress

圖6 外源CaCl2對鹽脅迫下荷花NnCIPK6表達量的影響Fig.6 Effects of exogenous CaCl2 on NnCIPK6 gene expression of lotus under salt stress

2.4 外源鈣對NaCl脅迫下荷花NnCIPK6基因表達量的影響

從圖6可以看出，與對照組相比，鹽脅迫下荷花NnCIPK6基因表達量明顯上升，加入CaCl2后NnCIPK6表達量進一步升高。處理7 d，隨著CaCl2濃度的升高，粉美人和水晶粉七號的NnCIPK6表達量均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；T3處理的NnCIPK6表達量最高，水晶粉七號的NnCIPK6表達量是對照組的2.19倍，粉美人的NnCIPK6表達量是對照組的2.02倍；CaCl2濃度超過10 mmol·L-1后，NnCIPK6表達量呈現(xiàn)下降趨勢，其中T5處理的抗性品種水晶粉七號NnCIPK6表達量顯著(P<0.05)低于T3、T4處理。處理14 d后，2個荷花品種NnCIPK6表達量的變化趨勢和處理7 d較為相似，但整體低于7 d的表達量；T3處理中，敏感品種粉美人和抗性品種水晶粉七號NnCIPK6基因表達量比處理7 d分別下降19.44%和28.92%。從圖6可知，T3處理中NnCIPK6表達量最高，表明10 mmol·L-1CaCl2能緩解鹽脅迫對荷花生長發(fā)育的傷害，粉美人NnCIPK6表達量均低于水晶粉七號，說明CaCl2對粉美人的緩解效果更好，此結果與荷花生長發(fā)育指標呈現(xiàn)的結果相符。

3 結論與討論

在不同濃度的NaCl處理下，荷花的凈生長量和葉面積均顯著降低，并且隨著NaCl處理時間延長，鹽脅迫對荷花的危害加重，抗性品種水晶粉七號和敏感品種粉美人對鹽脅迫的反應有顯著差異。NaCl處理下，添加外源鈣使荷花葉綠素含量升高，一定濃度下SOD活性和脯氨酸積累量達到最高，一定濃度的外源CaCl2處理能降低MDA含量，而高濃度的Ca2+也會對植物造成脅迫，即離子毒害，使膜脂過氧化程度和MDA含量增加。NaCl處理下，添加外源鈣使抗性品種水晶粉七號和敏感品種粉美人的NnCIPK6基因表達量均顯著升高，且在10 mmol·L-1CaCl2處理時最高，表明10 mmol·L-1CaCl2的緩解效果最好。

鹽脅迫會使植物葉綠素含量降低，導致光合作用、CO2吸收能力降低，增加引起光系統(tǒng)氧化損傷的活性氧的含量[22-23]。本研究通過外源鈣處理顯著提高了鹽脅迫下荷花的葉綠素含量，推測外源鈣可抑制鹽脅迫下荷花葉片葉綠素含量的下降，這與王鴻蕉等[22]在白菜 (Brassicarapavar.pekinensis)幼苗上得出的結論相一致。同時外源鈣對敏感品種粉美人葉綠素含量下降的抑制效果大于抗性品種水晶粉七號，與顏志明[25]在甜瓜(CucumismeloL.)幼苗上得出的結果一致。這可能是因為敏感品種粉美人更容易對周圍環(huán)境的變化做出反應，外源鈣可能降低了鹽脅迫下植物體中葉綠素酶的活性，抑制了因鹽脅迫引起的葉綠素的降解，從而提高了鹽脅迫下幼苗葉片葉綠素含量[26-27]。

在各種非生物脅迫下，活性氧(ROS)的產生和清除之間的平衡被打破，導致細胞內ROS的水平迅速增加，對細胞結構造成嚴重傷害[28]。SOD是細胞內有效的抗氧化酶，它能夠將O2-轉化為H2O2。逆境條件下，植物超氧化物歧化酶(SOD)被激活，以清除ROS的過度生成，保護植物細胞免受ROS的傷害?？寡趸富钚詼y定表明，抗性品種水晶粉七號的SOD活性高于敏感品種粉美人。這一結果符合在其他植物物種中獲得的結果，即鹽脅迫提高抗氧化酶活性和促進活性氧的產生[29]。

MDA是膜脂過氧化的主要產物，其含量與細胞膜損傷程度呈正相關[30]。本試驗中NaCl處理下荷花葉片MDA含量升高，表明鹽脅迫使植物細胞膜脂過氧化作用增強，加劇對其的氧化損傷。適宜濃度的外源鈣處理能有效地降低荷花MDA含量，但仍高于對照；且抗性品種水晶粉七號的MDA含量低于敏感品種粉美人。這與Sarmast等[31]在高羊茅(Festucaarundinacea)上得出的結論一致，即在干旱脅迫下MDA含量相對較低的品種比MDA含量較高的品種具有更好的抗逆性。

脯氨酸可維持細胞的擴張和滲透調節(jié)功能，以提高植物對滲透脅迫的耐受性[32]，脯氨酸積累與植物脅迫耐受性的改善相關[31]。本試驗結果表明，鹽脅迫下荷花脯氨酸含量升高，抗性品種水晶粉七號的脯氨酸含量高于敏感品種粉美人，這與Bojórquez-Quintal等[33]在辣椒(CapsicumannuumL.)上得出的結論一致。

CIPK作為CBL的唯一特異性靶蛋白激酶，是目前發(fā)現(xiàn)的植物中所特有的一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白激酶家族[34]。CIPK家族基因在植物的抗逆性中起著關鍵的調節(jié)作用。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CIPK家族基因在低溫、干旱和鹽脅迫處理后的棉花葉、莖和根中表達量顯著增加；Ma等[36]研究表明，過表達CBL和CIPK基因能顯著提高植物抗鹽脅迫能力，驗證了CIPK家族基因能夠在非生物刺激中發(fā)揮重要作用。目前CBL和CIPK基因功能在模式植物擬南芥中的研究較為深入，主要集中在揭示CBL或CIPK基因抵抗生物或非生物脅迫的分子機制，尤其以CBL-CIPK介導的Ca2+信號在鹽脅迫、低溫、干旱和ABA等刺激中的作用機制研究較多[37]。在擬南芥中，AtCIPK6基因是幼苗發(fā)育和鹽脅迫反應所必需的[38]。近些年，從蘋果(PumilaMill.)[39]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[40]中克隆了CIPK6基因，結果顯示，這些基因受鹽脅迫誘導并參與轉基因植物對多種非生物脅迫的響應。本研究結果也表明，NaCl處理后荷花NnCIPK6的表達水平明顯升高，說明NnCIPK6在荷花應對鹽脅迫的反應中起作用，但其具體功能有待進一步研究。