肉牛呼吸道感染主要細菌性病原多重PCR檢測方法的建立

張玉龍，馬志宇，崔耀成，譚天宇，姚彩霞，樊利虹，左之才，才冬杰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

由于長距離運輸或早期斷奶等應(yīng)激造成肉牛機體免疫力下降，一些寄生于肉牛鼻、咽和氣管的正常菌群可能下行至支氣管和肺臟中，并在其內(nèi)定植，激發(fā)潛在的病毒感染并造成機體上呼吸道黏膜損傷，從而引起繼發(fā)性細菌感染，嚴重影響肉牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、溶血性曼氏桿菌(Hemolyticbacterium)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、不動桿菌(Acinetobacter)等是引起牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease，BRD)的細菌性病原菌[4]。本實驗室從肉牛呼吸道中多次分離到多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌和不動桿菌，其中不動桿菌屬中約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)檢出頻數(shù)最高。

臨床常用的傳統(tǒng)細菌學(xué)檢驗方法需經(jīng)過細菌培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定等步驟，過程繁瑣，費時費力，難以滿足臨床試驗的需要[5]。PCR檢測方法耗時短，可信度高，可用作病原菌檢測，主要包括巢式PCR、熒光定量PCR、多重PCR[6]。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或某些病原微生物鑒定、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定，其操作簡單，成本低，可快速鑒定細菌[7]，為病原菌的檢測和鑒定提供了準確、可靠的方法[8-10]。本研究建立了一種同時檢測肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌這3種肉牛呼吸道病原菌的多重PCR方法，旨在為快速檢測牛呼吸道疾病病原菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，BNCC102997)、約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii，BNCC341940)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，ATCC15742)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacter，1Y-2)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，3D-5)、深紅沙雷氏菌(Serratiamarcescens，1B-4)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，SF5B-5)、皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii，SF1-JM-1)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris，3B-5)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，13-1)、志賀氏菌(Shigella，13-2)、奈瑟菌(Neisseria，9-1-2)、摩根菌(Morganella，464P-1)均由本實驗室分離保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸出液肉湯(HBI)、血瓊脂基礎(chǔ)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自成都浩博優(yōu)有限公司；DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、雙蒸水、50 bp DNA Ladder、Goldview、瓊脂糖均購于成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司。PCR儀購自Thermo Fisher公司，電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，全自動凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)文獻[11]和Genbank數(shù)據(jù)庫中肺炎克雷伯菌Khe基因、約翰遜不動桿菌Ptk基因、多殺性巴氏桿菌Abhd基因，利用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計3對特異性引物(表1)，引物由成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 DNA提取

取1 mL擴增培養(yǎng)24 h的菌液，按照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)說明書步驟提取細菌基因組DNA，用NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計檢測病原菌基因組DNA濃度。

1.4 單重PCR擴增

以病原菌基因組DNA作為模板，采用10 μL體系進行PCR擴增，并進行單重PCR的特異性、退火溫度、敏感度驗證。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，引物各0.5 μL，模板1 μL。以3%瓊脂凝膠電泳檢測基因組DNA。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.5 多重PCR退火溫度與引物濃度優(yōu)化

將肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌的基因組DNA等量混勻作為模板，優(yōu)化退火溫度(57～62 ℃)，引物的量(0.8～3.0 μmoL·L-1)，確保各病原菌擴增效率保持一致。以目的條帶明顯、引物二聚體少、無非特異性擴增條帶為標準，確定多重PCR的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.6 多重PCR檢測的特異性試驗

以本實驗室分離的病原菌擴增培養(yǎng)液作為模板，利用優(yōu)化的多重PCR最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行擴增，評價多重PCR的特異性試驗。

1.7 多重PCR檢測的敏感性試驗

將病原菌基因組DNA進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6這6個梯度稀釋，以稀釋液作為模板進行多重PCR敏感性與單重PCR敏感度比較，評價多重PCR的靈敏度。

1.8 臨床樣品的檢測

用建立的多重PCR檢測法和傳統(tǒng)細菌學(xué)檢測法，對采集的35份具有不同程度呼吸癥狀的肉牛鼻腔拭子樣品進行檢測，并對比2種方法的檢出率。同時，用多重PCR對樣品進行重復(fù)檢測，檢測多重PCR的可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR擴增結(jié)果

通過全功能成像儀觀察凝膠電泳結(jié)果，3對特異性引物都能夠擴增出相應(yīng)的條帶并且目的條帶大小與預(yù)期的相符，多殺性巴氏桿菌目的條帶大小是462 bp(圖1)，肺炎克雷伯菌是226 bp(圖2)，約翰遜不動桿菌是365 bp(圖3)。

以病原菌基因組DNA的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液作為模板進行單重PCR檢測。結(jié)果顯示，單重PCR檢測肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌的檢測下限分別為69.8×10-5、208.9×10-6、70.8 ×10-3ng·μL-1。將退火溫度設(shè)定為57、58、59、60、61、62 ℃，進行單重PCR的退火溫度試驗。結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌的最佳的退火溫度是58 ℃，約翰遜不動桿菌的最佳退火溫度是59 ℃，多殺性巴氏桿菌的最佳退火溫度是61 ℃(圖4)。

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，多殺性巴氏桿菌；2，肺炎克雷伯菌；3，溶血性曼氏桿菌；4，約翰遜不動桿菌；5，銅綠假單胞菌；6，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Pasteurella multocida; 2， Klebsiella pneumonia; 3， Hemolytic bacterium; 4， Acinetobacter johnsonii; 5， Pseudomonas aeruginosa; 6， Negative control.圖1 多殺性巴氏桿菌特異性擴增結(jié)果Fig.1 Specific amplification results of Pasteurella multocida

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，肺炎克雷伯菌；2，多殺性巴氏桿菌； 3，溶血性曼氏桿菌；4，約翰遜不動桿菌；5，銅綠假單胞菌；6，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Klebsiella pneumonia; 2， Pasteurella multocida; 3， Hemolytic bacterium; 4， Acinetobacter johnsonii; 5， Pseudomonas aeruginosa; 6， Negative control.圖2 肺炎克雷伯菌特異性擴增結(jié)果Fig.2 Specific amplification results of Klebsiella pneumoniae

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，約翰遜不動桿菌；2，多殺性巴氏桿菌；3，肺炎克雷伯菌；4，溶血性曼氏桿菌；5，銅綠假單胞菌；6，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Acinetobacter johnsonii; 2， Pasteurella multocida; 3， Klebsiella pneumonia; 4， Hemolytic bacterium; 5， Pseudomonas aeruginosa; 6， Negative control.圖3 約翰遜不動桿菌特異性擴增結(jié)果Fig.3 Specific amplification results of Acinetobacter johnsonii

2.2 多重PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件優(yōu)化

通過多重PCR引物的量(0.8～3.0 μL)與退火溫度(57～62 ℃)的優(yōu)化，以不產(chǎn)生非特異性條帶，目的條帶擴增效率高，減少產(chǎn)生引物二聚體為目的，最終獲得多重PCR的最佳反應(yīng)體系為50 μL，其中肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌引物各1 μL，模板各2 μL，酶25 μL，水13 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.2.1 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

調(diào)整約翰遜不動桿菌、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌的引物比例，優(yōu)化多重PCR引物濃度。當約翰遜不動桿菌、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌的引物比例為1∶1∶1時不產(chǎn)生非特異性條帶，目的條帶擴增效率高。

2.2.2 多重PCR退火溫度試驗

以肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌的病原菌基因組DNA等量混合作模板，將退火溫度設(shè)定為57、58、59、60、61、62 ℃，以梯度溫度作為退火溫度進行多重PCR的退火溫度試驗。結(jié)果表明，多重PCR的退火溫度為58 ℃時，擴增效果最好(圖5)。

2.3 多重PCR檢測的特異性試驗結(jié)果

利用建立的多重PCR方法對本實驗室分離的病原菌擴增培養(yǎng)液進行檢測。以肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌擴增培養(yǎng)液等量混勻作為模板，50 μL體系中，3對特異性引物只擴增出對應(yīng)的目的條帶(圖6)。

如圖7所示，肺炎克雷伯菌在226 bp，約翰遜不動桿菌在365 bp，多殺性巴氏桿菌在462 bp處出現(xiàn)特異性條帶，而其他10種牛呼吸道病原菌未出現(xiàn)特異性條帶，3次重復(fù)試驗得到相同的結(jié)果，表明該方法有良好的特異性和重復(fù)性。

2.4 多重PCR檢測的敏感性試驗結(jié)果

將3種病原菌基因組DNA的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6這6種稀釋液分別等量混合制作模板，利用建立的多重PCR方法進行靈敏度驗證。該方法對3種肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌基因組DNA的檢測下限分別為69.8×10-5、208.9×10-4、70.8×10-3ng·μL-1，肺炎克雷伯菌與多殺性巴氏桿菌的靈敏度略低于與單重PCR，多殺性巴氏桿菌的靈敏度與單重PCR靈敏度一致(圖8)。

M，50 bp DNA Ladder Marker；1～6，57～62 ℃，8～13，57～62 ℃，15～20，57～62 ℃，7、14、21，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1-6，57～62 ℃; 8-13， 57～62 ℃; 15-20， 57～62 ℃; 7， 14， 21， Negetive control。圖4 肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌退火溫度擴增結(jié)果Fig.4 Annealing temperature amplification results of Klebsiella pneumoniae， Acinetobacter johnsonii and Pasteurella multocida

M，50 bp DNA Ladder Marker；1～6，57～62 ℃；7，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1-6，57～62 ℃; 7， Negetive control。圖5 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of multiplex annealing temperature

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，肺炎克雷伯菌；2，約翰遜不動桿菌；3，多殺性巴氏桿菌；4～6，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Klebsiella pneumonia; 2， Acinetobacter johnsonii; 3， Pasteurella multocida;4-6， Negative control.圖6 多重PCR特異性擴增結(jié)果Fig.6 The primer specificity of multiplex PCR

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，陽性對照；2，肺炎克雷伯菌；3，約翰遜不動桿菌；4，多殺性巴氏桿菌；5，志賀氏菌；6，奈瑟菌；7，深紅沙雷氏菌；8，鮑曼不動桿菌；9，皮特不動桿菌；10，摩根菌；11，變形桿菌；12，大腸埃希菌；13，柯氏檸檬酸桿菌；14，銅綠假單胞菌；15，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Positive control; 2， Klebsiella pneumonia; 3， Acinetobacter johnsonii; 4， Pasteurella multocida;5， Shigella; 6， Neisseria; 7， Serratia marcescens; 8， Acinetobacter baumannii; 9， Acinetobacter pittii; 10， Morganella; 11， Proteus; 12， Escherichia coli; 13， Citrobacter; 14， Pseudomonas aeruginosa; 15， Negative control.圖7 13種病原菌的多重PCR特異性擴增結(jié)果Fig.7 Multiplex PCR analysis of thirteen kinds of pathogens

2.5 臨床樣品的檢測

利用建立的多重PCR方法檢測35份臨床樣品。如圖9所示，共10條泳道呈陽性結(jié)果，其中約翰遜不動桿菌4份，多殺性巴氏桿菌3份，肺炎克雷伯菌4份。35份臨床樣品種，1個樣品同時檢測出約翰遜不動桿菌和多殺性巴氏桿菌這2種病原菌，證明牛呼吸道疾病存在混合感染。同時，對PCR擴增的陽性樣品進行測序，經(jīng)NCBI序列比對相似性均高于99%，表明多重PCR檢測方法能夠?qū)εR床樣品進行準確檢測。用多重PCR對樣品進行重復(fù)檢測，檢測的結(jié)果一致，能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR檢測的可重復(fù)性。

2.6 多重PCR與細胞學(xué)檢驗的符合率

通過多重PCR與細胞學(xué)檢驗對35份臨床樣品進行檢測，并用卡方檢驗對不同感染類型進行分析。如表2所示，多重PCR檢測法檢出致病菌11株，致病菌檢出率為31.4%；傳統(tǒng)細菌學(xué)培養(yǎng)法檢出致病菌7株，檢出率為20.0%。通過卡方檢驗比較2種方法的檢出率結(jié)果，表明多重PCR檢測方法具有臨床樣品檢測的應(yīng)用能力。

M，50 bp DNA Ladder Marker；1，陽性對照；2，10-1 ng·μL-1；3，10-2 ng·μL-1；4，10-3 ng·μL-1；5，10-4 ng·μL-1；6，10-5 ng·μL-1；7，10-6 ng·μL-1；8，10-7 ng·μL-1；9，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1， Positive control; 2， 10-1 ng·μL-1; 3， 10-2 ng·μL-1; 4， 10-3 ng·μL-1; 5， 10-4 ng·μL-1; 6， 10-5 ng·μL-1; 7， 10-6 ng·μL-1; 8， 10-7 ng·μL-1; 9， Negative control.圖8 多重PCR敏感性擴增結(jié)果Fig.8 The sensitivity of amplification results of multiplex PCR

M，50 bp DNA Ladder Marker；1、22，陽性對照；2～20、23～37，臨床樣品；21、38，陰性對照。M， 50 bp DNA Ladder Marker; 1 and 22， Positive control; 2-20， 23-37， Clinical samples; 21 and 38， Negative control.圖9 臨床樣品檢測多重PCR擴增結(jié)果Fig.9 Multiplex PCR amplification results of clinical sample detection

表2 兩種方法對不同類型致病菌的檢出率比較Table 2 Comparison of detection rates of different types of pathogenic bacteria by two methods

3 討論

牛呼吸道疾病嚴重影響肉牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[12]。肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、不動桿菌是引起牛呼吸道疾病的病原菌[13]。本試驗旨在通過構(gòu)建肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌檢測方法，為肉牛養(yǎng)殖中細菌性病原的快速檢測提供參考，最終為牛呼吸道疾病的防控奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)細菌學(xué)檢測法檢驗步驟煩瑣，檢測周期較長。為了提高檢測效率，通過優(yōu)化PCR檢測方法的特異性、靈敏度、退火溫度，建立一種能夠同時檢測出肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌的多重PCR技術(shù)。通過單重PCR與多重PCR特異性試驗，本研究建立的多重PCR檢測法能夠檢出肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌這3種目標病原菌，而對于其他10種常見呼吸道病原菌均不能檢出，并且該方法具有較好的特異性和重復(fù)性。張曼等[14]建立的禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸埃希菌多重PCR檢測方法中，禽多殺性巴氏桿菌DNA檢測下限為24.3 pg·μL-1，本研究中多重PCR方法多殺性巴氏桿菌檢測下限是70.8 pg·μL-1；張越華等[15]建立的SPF級實驗小鼠4種致病菌多重PCR方法中肺炎克雷伯菌最低檢出量為10-5ng·μL-1，本實驗室建立的多重PCR肺炎克雷伯菌最低檢出量為69.8×10-5ng·μL-1；祝巖波等[16]建立的實驗動物4種病原體多重PCR方法中肺炎克雷伯菌敏感性為10 pg·μL-1，多殺性巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體敏感性為1 pg·μL-1，本實驗室建立多重PCR方法中肺炎克雷伯菌敏感度為0.7 pg·μL-1，多殺性巴氏桿菌為70.8 pg·μL-1。通過綜合對比發(fā)現(xiàn)，本研究建立的多重PCR方法可以達到檢測臨床樣品的要求。

本研究建立的多重PCR方法可以同時檢測出肺炎克雷伯菌、約翰遜不動桿菌、多殺性巴氏桿菌，具有操作簡單、快速、準確等優(yōu)點，且有較強的特異性、敏感性。通過臨床樣品檢測結(jié)果顯示，多重PCR檢測法檢出率高于傳統(tǒng)細菌學(xué)檢測法，表明多重PCR檢測方法能夠?qū)εR床樣品進行準確檢測，具有臨床樣品檢測的應(yīng)用能力。本研究建立的多重PCR方法為肉牛呼吸道主要病原菌的快速檢測提供了重要的技術(shù)手段，為臨床上快速鑒別診斷3種病原菌引起的肉牛呼吸道疾病提供了一種有效的檢測方法。